專利名稱：定點(diǎn)單取代聚乙二醇化Exendin類似物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種定點(diǎn)單取代聚こニ醇化Exendin類似物、其制備方法和醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
早在上世紀(jì)60年代，麥金太爾和埃爾里克等人就發(fā)現(xiàn)，ロ服葡萄糖對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用明顯高于靜脈注射，這種額外的效應(yīng)被稱為“腸促胰素效應(yīng)”。而珀利等人進(jìn)ー步研究證實(shí)，這種“腸促胰素效應(yīng)”所產(chǎn)生的胰島素占進(jìn)食后胰島素總量的50%以上。1986 年，瑙克等人發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者腸促胰素作用減退。這提示，腸促胰素系統(tǒng)異?？赡苁?型糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一。隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展，腸促胰素這層神秘的面紗被慢慢揭開。研究證實(shí)，腸促胰素是人體內(nèi)ー種腸源性激素。在進(jìn)食后，該類激素可促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮葡萄糖濃度依賴性降糖作用。腸促胰素主要由GLP-I和糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)組成，其中GLP-I在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著更為重要的作用，它能夠通過促進(jìn)胰島素分泌、刺激胰島β細(xì)胞增生、阻止胰島β細(xì)胞凋亡、抑制胰高血糖素的釋放、抑制胃腸道蠕動(dòng)和胃液分泌、延遲胃排空、產(chǎn)生飽脹感和食欲下降等多重途徑來控制血糖。但是由于其在體內(nèi)會(huì)迅速被DPP-IV降解，半衰期只有1-2分鐘，限制了其應(yīng)用開發(fā)。exendin-4是從美洲毒蜥的唾液中分離得到的含有39個(gè)氨基酸序列的GLP-I類似物，其與GLP-I有53%的結(jié)構(gòu)同源性，能夠與GLP-I受體結(jié)合。通過與GLP-I受體結(jié)合發(fā)揮促胰島素分泌的作用，有效降低空腹和餐后血糖的作用，用于治療ニ型糖尿病。與GLP-I相比由于其第二位的丙氨酸改為了甘氨酸，避免了體內(nèi)ニ肽酶(DPP-IV)的降解，半衰期較GLP-I的l_2min提高到2_4h,使得其得以被開發(fā)成上市產(chǎn)品(Byetta, Amylin公司)，姆日給藥兩次。然而頻繁的注射給藥病人順應(yīng)性很低，因此對(duì)于此類藥物緩釋劑型的研究和開發(fā)從未停止NoVo Nordisk開發(fā)的liraglutide (NN-2211)姆天給藥一次。Amylin研究開發(fā)的exenatide LAR(PLGA微球)，每周給藥一次。因此，研究開發(fā)長效制劑或者非注射途徑給藥的制劑是該類藥物發(fā)展的趨勢(shì)。目前研究最充分的，使用的最廣泛的多肽蛋白藥物長效制劑技術(shù)即是聚こニ醇化技術(shù)，其使用活化的聚こニ醇試劑與多肽蛋白上特殊的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，形成新的分子，利用聚こニ醇的水溶性大分子特點(diǎn)增加多肽蛋白的溶解度，降低其免疫原性，減少腎小球?yàn)V過從而延長體內(nèi)半衰期，達(dá)到延長藥物作用時(shí)間的目的，提高病人順應(yīng)性。聚こニ醇化技術(shù)一般使用活化的聚こニ醇化試劑與多肽或蛋白結(jié)構(gòu)上的活潑殘基(按活性順序一般為巰基，氨基，羧基等)進(jìn)行反應(yīng)，形成化學(xué)鍵穩(wěn)定的聚こニ醇化產(chǎn)物。但是結(jié)構(gòu)上具有多個(gè)活潑殘基時(shí)，一般生成不同位點(diǎn)的單取代混合物，并且在聚こニ醇摩爾比例較高時(shí)還會(huì)繼續(xù)形成多取代產(chǎn)物。一般多取代物會(huì)顯著影響藥物活性，進(jìn)而影響體內(nèi)藥效，而且多取代物的質(zhì)量控制也比較困難，因此上市的聚こニ醇化藥物基本都是單取代物。由于單取代的位置對(duì)于多肽或者蛋白類藥物的活性影響非常顯著，因此制備活性位點(diǎn)最佳的單取代聚こニ醇化產(chǎn)品很有必要。
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現(xiàn)有技術(shù)中，定點(diǎn)化聚こニ醇化的常用技術(shù)有兩類一類是控制結(jié)構(gòu)上能夠反應(yīng)的殘基數(shù)。這類技術(shù)中，比較多的方法是是在位置最佳處突變產(chǎn)生或者合成中加入ー個(gè)半胱氨酸，然后利用能夠與巰基反應(yīng)的聚こニ醇化試劑(如聚こニ醇化馬來酰亞胺)進(jìn)行反應(yīng)，在半胱氨酸上結(jié)合聚こニ醇。然而這種方法的缺點(diǎn)一方面是藥物結(jié)構(gòu)改變?cè)斐蓪?duì)其藥效及毒性的影響不清楚，ニ是引入了半胱氨酸，對(duì)于其穩(wěn)定性會(huì)有不利影響，比如說半胱氨酸易氧化。另外的定點(diǎn)方法則是采用賴氨酸氨基作為聚こニ醇化位點(diǎn)，其將其它位點(diǎn)的賴氨酸全部替換為堿性精氨酸，僅留下需要反應(yīng)位點(diǎn)的賴氨酸。這樣的方法缺點(diǎn)同樣是結(jié)構(gòu)改變會(huì)對(duì)藥效及毒性產(chǎn)生明顯影響，本申請(qǐng)的發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中即有明確發(fā)現(xiàn)這樣改變結(jié)構(gòu)的新多肽藥效受到很大影響。另ー類技術(shù)則是在偏酸性條件下使用聚こニ醇丙醛試劑對(duì)N端氨基進(jìn)行聚こニ醇化修飾。有研究者發(fā)現(xiàn)N端氨基pKa值小于賴氨酸殘基上的氨基，也就是說堿性更強(qiáng)。因此，賴氨酸上的氨基需要在微堿性條件下(PH7-8)發(fā)生聚こニ醇化反應(yīng)，而N端氨基可在偏酸性條件下(pH 5-6)即發(fā)生聚こニ醇化反應(yīng)，而此時(shí)賴氨酸上的氨基不能反應(yīng)。因此有研究者利用多肽或者蛋白的上述性質(zhì)，在偏酸性條件下對(duì)N端氨基進(jìn)行定點(diǎn)的聚こニ醇化反應(yīng)。但是這種方法有兩個(gè)缺點(diǎn)，ー是不適用于N端為活性位點(diǎn)的藥物；ニ是此反應(yīng)得率低，在聚こニ醇試劑使用摩爾比高達(dá)5甚至10的條件下，而產(chǎn)率也僅有50% -60%，導(dǎo)致生產(chǎn)成本太高，不具備生產(chǎn)的可能。對(duì)Exendin-4類似物進(jìn)行聚こニ醇化修飾時(shí)，由于Exendin-4類似物的結(jié)構(gòu)中沒有半胱氨酸，因此無法使用聚こニ醇馬來酰亞胺進(jìn)行定點(diǎn)聚こニ醇化反應(yīng)；其次，由于其結(jié)構(gòu)的 N端是活性位點(diǎn)(參見 British Journal of Pharmacology, 2003,140, 339-346),因此
無法使用聚こニ醇丙醛進(jìn)行N端定點(diǎn)聚こニ醇化反應(yīng)。然而，當(dāng)使用聚こニ醇琥珀酰亞胺試劑對(duì)Exendin-4類似物側(cè)鏈氨基進(jìn)行修飾吋，由于Exendin-4類似物中含有最多4個(gè)賴氨酸，加上N端氨基總共將有5個(gè)潛在反應(yīng)位點(diǎn)，因此在聚こニ醇化過程中不可避免會(huì)出現(xiàn)上面所提到的多取代物和單取代物混合物出現(xiàn)的情況，而所有這些產(chǎn)物中只有ー個(gè)是活性最佳的目標(biāo)產(chǎn)物。Youn等人提出了使用Fmoc (9_芴基甲氧羰基)保護(hù)基對(duì)多肽結(jié)構(gòu)中不希望發(fā)生反應(yīng)的氨基進(jìn)行保護(hù)的方法(Biocomjugate Chem, 2007,18, 500-506),但該方法有一個(gè)顯著的缺點(diǎn)，即在堿性環(huán)境下多肽的Fmoc保護(hù)基很容易脫落。實(shí)際上，在很多多肽合成實(shí)驗(yàn)中，就是采用堿(20%哌唳)來脫除Fmoc保護(hù)基的。Exendin-4類似物中氨基的聚こニ醇化反應(yīng)需要在一定程度的堿性條件下才能發(fā)生。這兩個(gè)矛盾的事實(shí)使得Fmoc保護(hù)的多肽在偏堿性條件下進(jìn)行聚こニ醇化修飾吋，F(xiàn)moc保護(hù)基很容易脫落，從而不可避免地造成相當(dāng)數(shù)量的多取代物副反應(yīng)物的生成。因此，有必要提供一種制備定點(diǎn)單取代聚こニ醇化Exendin-4類似物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備定點(diǎn)單取代聚こニ醇化Exendin類似物的方法以及由該方法所制備的單取代聚こニ醇化Exendin類似物。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述的發(fā)明目的，一方面，本發(fā)明提供了一種制備定點(diǎn)單取代聚こニ醇化Exendin類似物的方法,該方法包括如下的步驟
(I)合成Exendin類似物的多肽原料，該多肽原料的部分位點(diǎn)的Lys殘基上帯有Dde保護(hù)基，其中，Dde為Ν_α _1-(4，4_ ニ甲基_2，6_ ニ氧代環(huán)己亞基)(其英文名稱為(N-α -I-(4，4-dimethyl_2，6-dioxocyclohex-l-ylideneノ ；(2)將上述的多肽原料與聚こニ醇化試劑在偏堿性的有機(jī)溶劑中反應(yīng)，使得該多肽原料中不帶有Dde保護(hù)基的Lys殘基上連接有聚こニ醇基團(tuán)；(3)脫除步驟(2)所得產(chǎn)物上的保護(hù)基，井分離純化，得到聚こニ醇化Exendin類似物。在本發(fā)明的方法中，由于采用了相對(duì)Fmoc耐受堿性條件強(qiáng)的多得多的Dde作為保護(hù)基，避免了 Fmoc不穩(wěn)定性(脫落)所導(dǎo)致的多取代反應(yīng)，從而使得反應(yīng)的副產(chǎn)物大大減少，使得大規(guī)模制備成為可能。在上述的制備方法中，其多肽原料中應(yīng)當(dāng)至少有ー個(gè)位點(diǎn)的Lys殘基上不帶有Dde保護(hù)基，以便連接聚こニ醇基團(tuán)；優(yōu)選地，上述多肽原料中只有一個(gè)位點(diǎn)的Lys殘基上不帶有Dde保護(hù)基,從而制備定點(diǎn)的、單取代的聚こニ醇化Exendin類似物。在上述的制備方法中，其多肽原料的N端可以帶有Dde保護(hù)基或Fmoc保護(hù)基；單純從藥物純度的角度來看，多肽原料的N端帶有Dde保護(hù)基為佳，但如果結(jié)合成本的角度來開，可以選擇N端帶有Fmoc保護(hù)基，因?yàn)閺姆磻?yīng)活性的實(shí)際考察來看，N端使用Fmoc保護(hù)基并不會(huì)帶來較多的多取代的聚こニ醇化Exendin類似物。例如，在上述的制備方法中，其具體的多肽原料可以具有如下的結(jié)構(gòu)(X) His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y1-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-AIa-Val-Y2-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Y3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser_Y4，其中，X 是 Fmoc 或 Dde ;Z 為 Leu 或 lie J1-Y4 為 Lys 或(Dde) LyS，而且 Y1-Y4 中至少ー個(gè)為Lys ;優(yōu)選地，在Y1-Y4中，只有Y2-Y4中的ー個(gè)為Lys，其余均為(Dde)Lys ;更優(yōu)選地，Y2 為 Lys,YpY3 和 Y4 為(Dde)Lys0但是，本發(fā)明的方法并不只限于制備上述結(jié)構(gòu)的聚こニ醇化Exendin類似物；在所有的Exendin類似物,包括Exendin-4類似物中，只要其多肽序列中有多于ー個(gè)的Lys殘基(兩個(gè)以及以上的Lys殘基)，都特別適合采用本發(fā)明的上述制備方法來制備單取代的聚こニ醇化Exendin類似物。本發(fā)明中采用了具有4個(gè)Lys殘基的多肽序列來制備單取代的聚こニ醇化Exendin類似物，因?yàn)榫哂?個(gè)Lys殘基的Exendin類似物是結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的Exendin類似物。本發(fā)明的方法適于制備申請(qǐng)人在其中國專利申請(qǐng)CN 101125207A中所公開的所有Exendin類似物的聚こニ醇化制劑；CN 101125207A的所有公開內(nèi)容合并入本申請(qǐng)中。在本發(fā)明的制備方法中，PEG試劑(聚こニ醇化試劑)的聚こニ醇分子量可以為20，000-60，000道爾頓；進(jìn)ー步地，在本發(fā)明的制備方法中，可以采用CN 101125207A中所公開的具有支鏈結(jié)構(gòu)的聚こニ醇基團(tuán)。例如，本發(fā)明方法中一種實(shí)施方式為按照如下步驟制備并分離純化定點(diǎn)單取代聚こニ醇化Exendin-4類似物
I、合成帶有保護(hù)基的Exendin-4類似物如聚乙ニ醇化位點(diǎn)為N端氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的Exendin-4類似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-GlU-Ala-Val-(Dde)Lys_Leu_Phe_Ile_Glu_Trp_Leu_(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-GIy-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde； Lys如聚乙ニ醇化位點(diǎn)為Lys12側(cè)鏈氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的Exendin-4類
似物(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-GIu-Ala-Val-(Dde;Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde;Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys 或(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-GlU-Ala-Val- (Dde)Lys_Leu_Phe_Ile_Glu_Trp_Leu_(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-GIy-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde； Lys ；如聚乙ニ醇化位點(diǎn)為Lys2°側(cè)鏈氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的Exendin-4類似物(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser- (Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu- (Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys 或(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-GIu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde;Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-GIy-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde； Lys ；如聚乙ニ醇化位點(diǎn)為Lys27側(cè)鏈氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的Exendin-4類似物(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys 或 (Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-GIu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-GIy-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde； Lys ；如聚乙ニ醇化位點(diǎn)為Lys4°側(cè)鏈氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的Exendin-4類似物(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser- (Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu- (Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys 或(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-GIu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-^er-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-^er-Lys ；2、將上述帶有保護(hù)基的Exendin-4類似物及一定摩爾比例的分子量范圍在20，000-60, 000道爾頓的聚こニ醇化試劑(優(yōu)選40KD Y型PEG-NHS酷)溶解于適量有機(jī)溶劑中(優(yōu)選DMSO)，當(dāng)其完全溶解后加入適量不與聚こニ醇化試劑發(fā)生反應(yīng)但卻更夠提供足夠堿性環(huán)境的有機(jī)堿，一般可用三こ胺(TEA)、ニ異丙基こ胺(DIEA)、4_ ニ甲基氨基吡啶(DMAP)、2，4,6-三甲基批P定(colidine)、ニ甲基批P定(Iutidine)、批P定(pyridine)等。3、上述溶液體系在一定溫度下(不超過40°C )保溫一段時(shí)間，聚こニ醇化反應(yīng)即已完成，然后加入足夠量的試劑(優(yōu)選聯(lián)胺)脫除Fmoc和Dde保護(hù)基，在一定溫度下(不超過40°C )保溫一段時(shí)間，所有保護(hù)基即可完全脫除。4、將上述終反應(yīng)液用純水稀釋10倍并立即用HCL或醋酸調(diào)pH致5. 0-6. O以保證樣品的穩(wěn)定性，然后使用SOURCE 30RPC填料，使用含有20mM醋酸的水こ腈或者水こ醇系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度分離純化，收集目標(biāo)產(chǎn)物聚こニ醇化Exendin-4類似物。
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5、將上述SOURCE純化的含有一定有機(jī)溶劑(こ腈或こ醇)的聚こニ醇化Exendin-4類似物樣品，使用陽離子交換樹脂，使用IOmM檸檬酸緩沖鹽I. 5M NaCL洗脫液進(jìn)行性梯度分離純化，除去有機(jī)溶剤，收集目標(biāo)產(chǎn)物聚こニ醇化Exendin-4類似物。6、將上述離子交換純化的聚こニ醇化Exendin-4類似物用IOKD超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，然后將樣品用分子篩色譜，使用純水進(jìn)行脫鹽處理，得到的聚こニ醇化Exendin-4類似物純水溶液進(jìn)行凍干處理，最終得到聚こニ醇化Exendin-4類似物原料藥。另ー方面，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了ー種按上述方法制備的聚こニ醇化Exedin類似物。再一方面，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了一種聚こニ醇化Exedin類似物，其中，該Exedin類似物具有如下的序列結(jié)構(gòu)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys，其中，Z 是 Leu(SEQ ID No. I)或 Ile(SEQ ID No. 2)，并且上述結(jié)構(gòu)中有一個(gè)Lys殘基上的氨基連接有聚こニ醇基團(tuán)。優(yōu)選地，在上述的序列結(jié)構(gòu)中的Lys2°殘基或Lys27殘基的氨基上連接有聚こニ醇基團(tuán)。又一方面，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了聚こニ醇化Exedin類似物在制備治療糖尿病或肥胖癥藥物方面的用途。本發(fā)明的方法中由于采用穩(wěn)定性更好的保護(hù)基Dde作為主要保護(hù)基，避免了 Fmoc不穩(wěn)定所帯來的多取代副反應(yīng)，從而可以以低的反應(yīng)摩爾比制備高得率的單取代的聚こニ醇化Exedin類似物，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明的聚こニ醇化Exedin類似物中副產(chǎn)物少,是ー種定點(diǎn)的單取代的Exedin類似物，避免了副產(chǎn)物所帯來的各種副作用。為了更詳細(xì)的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖，通過具體的實(shí)施方式，來詳細(xì)地說明本發(fā)明。但本發(fā)明的范圍并非局限于這些具體的實(shí)施方式上。


圖I是定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物MALDI-T0F質(zhì)譜圖；圖2是定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物聚こニ醇化前后HPLC色譜圖；圖3是聚こニ醇化Exendin-4類似物SOURCE純化色譜圖4是聚こニ醇化Exendin-4類似物SP陽離子交換純化色譜圖；圖5是聚乙ニ醇化Exendin-4類似物分子篩除鹽色譜圖；圖6顯示了 HYBR-003-peg單取代物在C57 BL/6小鼠腹腔糖耐受試驗(yàn)(η = 8)，圖中，a P < O. 01 V. S blank, b P < O. 01 V. S control。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I(I)合成所用的氨基酸單體Fmoc-Hi s (Trt) -OH, Dde-His (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-0H,Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-0H,Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-ILe-OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH,, Fmoc-Asn (Trt) -0H,Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH上面縮寫為=Fmoc 9_芴基甲氧羰基；Boc叔丁氧羰基；Trt三苯甲基；0tBu叔丁基氧基；tBu叔丁基；Dde N-[l-(4，4-ニ甲基-2，6_ ニ氧代環(huán)己亞基)(2)試劑N，N-ニ異丙基こ胺、ニ異丙基碳ニ亞胺(DIC)、N，N-ニ甲基甲酰胺(DMF)、ニ氯甲烷、六氫吡啶、I-羥基苯并三唑、Rink Amide樹脂、茚三酮、甲醇、三異丙基硅烷、三氟こ酸。(3)操作A合成以O(shè). 25mmol規(guī)模為例,稱取O. 5g Rink Amide樹脂置于反應(yīng)器中，將氨基酸稱取lmmol，用DIC/HOBt方法活化，按照多肽序列從C端到N端依次進(jìn)行合成。反應(yīng)在25°C室溫條件下進(jìn)行，按照下列步驟進(jìn)行操作I、用20%六氫吡啶的DMF溶液脫保護(hù)基Fmoc，每次10分鐘；2、用IOmL DMF洗三次，抽干；3、稱取保護(hù)的氨基酸(lmmol) ,HOBt(Immol),溶于 IOmLDMF 中，加入DIC(Immol)活化10分鐘；4、將此活化的氨基酸溶液加入反應(yīng)器內(nèi)，振搖反應(yīng)I小時(shí)；5、用DMF洗樹脂三次，抽干；6、如果茚三酮反應(yīng)顯陰性，進(jìn)行下ー循環(huán)，重復(fù)步驟I到5 ;如果茚三酮反應(yīng)顯陽性，重復(fù)步驟3到5。多肽鏈逐步合成完畢后，用甲醇洗樹脂，晾干。B脫保護(hù)基及切除多肽將帶有多肽的樹脂Ig置于反應(yīng)器中，加入裂解液(比例苯甲醚2mL ;甲醇2mL ;三異丙基娃燒2mL ;三氟こ酸6mL)。室溫振搖2小時(shí)后，過濾，收集濾液，樹脂用少量醋酸洗滌,合并收集液,濃縮后，加入こ醚產(chǎn)生沉淀，過濾沉淀，再用少こ醚洗滌后，得粗品。C制備型HPLC分離純化，凍干將得到的粗品溶于少量10%醋酸溶液，上柱，經(jīng)制備型HPLC分離純化，凍干的產(chǎn)品，所得多肽經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定證明為所求化合物。
色譜柱BostonC18, 5um, 100A,波長 214nm, Waters 制備型 HPLC梯度10%0· 05% TFA/CAN-45% O. 05% TFA/CAN 20min, 45% 0. 05% TFA/CAN 維持 IOmin。
圖I是定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物MALDI-TOF質(zhì)譜圖實(shí)施例2定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物聚こニ醇化的方法本實(shí)施例用常規(guī)的氨基聚こニ醇化修飾試劑如(SC-PEG，SS-PEG, NHS-PEG等)對(duì)定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物上唯一游離的可被聚こニ醇化反應(yīng)的側(cè)鏈氨基進(jìn)行結(jié)合修飾。其中，聚こニ醇化試劑優(yōu)選40KD Y型NHS-PEG，定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物優(yōu)選(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser- (Dde)Lys 或者(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val- (Dde)Lys_Leu_Phe_Ile_Glu_Trp_Leu_(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-ber-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—LySo 取定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物2g，40KD Y型NHS-PEG 26g (與多肽摩爾比約I. 5 I)溶解于400mL DMS0，40°C保溫?cái)嚢璐偃?。待樣品完全溶解后，加入三こ?TEA)200uL(0. 05% )促發(fā)聚こニ醇化反應(yīng)，并于40°C繼續(xù)保溫?cái)嚢琛?h后聚こニ醇化反應(yīng)基本完成(90%以上，按定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物計(jì))，加入聯(lián)氨8mL(2% )，40°C保溫?cái)嚢鐸h至保護(hù)基全部脫除反應(yīng)結(jié)束。終反應(yīng)溶液用純水稀釋10倍并立即用6M HCL調(diào)pH至6. O 4°C冷藏保存。圖2是定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物聚こニ醇化前后HPLC色譜圖。實(shí)施例3聚こニ醇化Exendin-4類似物分離純化方法定點(diǎn)保護(hù)Exendin-4類似物聚こニ醇化終反應(yīng)液分別經(jīng)反相HPLC,離子交換,超濾濃縮，分子篩及冷凍干燥可獲得純的聚こニ醇化Exendin-4類似物原料藥。A、SOURCE 反相 HPLC 純化流動(dòng)相A相A相20mM HAc 5%こ臆；B相20mM HAc 50%こ臆色譜柱GEFineline Pilot 35填料SOURCE30RPC 175mL流速30mL/min洗脫梯度上樣后平衡2個(gè)柱體積，0-30% 5min,30% -100% 5min圖3是聚乙ニ醇化Exendin-4類似物SOURCE純化色譜圖。B、SP陽離子交換純化流動(dòng)相A相 IOmM pH3. 5CBSBI 相 IOmM pH3. 5 CBS+0. 15Μ NaCLΒ2 相 IOmM pH3. 5 CBS+1. 5Μ NaCL色譜柱GEXK 50填料SPsepharose Fast Flow BOOmT,
流速30mL/min洗脫梯度0%-100% BI 相 20min，100% BI 相-100% B2 相 Omin圖4是聚こニ醇化Exendin-4類似物SP陽離子交換純化色譜圖。C、超濾裝置IOKD PALL剪切式超濾膜濾前樣品體積2400mL濾后體積400mL一般重復(fù)超濾 3 次(1000mL-400mL)D、G25 脫鹽
流動(dòng)相純水色譜柱GEXK 50填料G25;900mL流速30mL/min,上樣量200mL圖5是聚乙ニ醇化Exendin-4類似物分子篩除鹽色譜圖。E、凍干聚こニ醇化Exendin-4類似物純水溶液共溶點(diǎn)約在_5°C左右，因此凍干步驟一次干燥設(shè)定溫度為-10°c，二次干燥設(shè)定溫度為5°C。其它參數(shù)(凍干時(shí)間及出箱溫度等)按照樣品量的多少，凍干機(jī)的效能及具體氣候條件酌情設(shè)定。實(shí)施例4正常C57小鼠腹腔注射糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPTT)(I)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57小鼠，購自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，SPF級(jí)。飼養(yǎng)于公司臨時(shí)動(dòng)物房，CL級(jí)。數(shù)量60性別公試劑Exendin_4類似物(O. 125ug/ml);聚こニ醇化 Exendin-4 類似物(3. 125ug/ml，按裸肽計(jì))；葡萄糖試劑盒；20%葡萄糖注射液；注射用生理鹽水。(2)實(shí)驗(yàn)方法給藥組，姆只小鼠給予聚こニ醇化Exendin-4類似物(3. 125ug/ml,按裸肽計(jì))0. 2mL/20g ;空白組，每只小鼠給予注射用生理鹽水O. 2mL/20g ;對(duì)照組，每只小鼠給予Exendin-4類似物(O. 125ug/ml)O. 2mL/20g。糖負(fù)荷為測(cè)血糖前半小時(shí)腹腔注射20%葡萄糖水溶液O. 2ml/20g b. W0于給藥后24h和72h，觀察受試動(dòng)物的降糖作用維持時(shí)間。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果各個(gè)聚こニ醇化Exendin-4類似物降糖作用維持時(shí)間效果見圖6。
權(quán)利要求
1.一種制備聚こニ醇化Exendin類似物的方法,該方法包括如下的步驟 (1)合成Exendin類似物的多肽原料,該多肽原料的部分位點(diǎn)的Lys殘基上帶有Dde保護(hù)基，其中，Dde為N-α-I-(4，4-ニ甲基-2，6-ニ氧代環(huán)己亞基)； (2)將上述的多肽原料與聚こニ醇化試劑在偏堿性的有機(jī)溶劑中反應(yīng)，使得該多肽原料中不帶有Dde保護(hù)基的Lys殘基上連接有聚こニ醇基團(tuán)； (3)脫除步驟(2)所得產(chǎn)物上的保護(hù)基，井分離純化，得到聚こニ醇化Exendin類似物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述的多肽原料中只有一個(gè)位點(diǎn)的Lys殘基上不帶有Dde保護(hù)基。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述的多肽原料的N端帶有Dde保護(hù)基或Fmoc保護(hù)基，F(xiàn)moc為9-荷基甲氧羰基。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述的多肽原料具有如下的結(jié)構(gòu)(X) His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y1-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y2-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Y3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pr0-Ser-Y4,其中，X是 Fmoc 或 Dde ；Z 為 Leu 或 lie J1-Y4 為 Lys 或(Dde)Lys，而且 Y1-Y4 中至少ー個(gè)為Lys。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，在Y1-Y4中，只有Y2-Y4中的ー個(gè)為Lys，其余均為(Dde)Lys。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，Y2,Lys，Y1, Y3和Y4為(Dde)Lys0
7.一種按權(quán)利要求1-6之一所述方法制備的聚こニ醇化Exedin類似物。
8.一種聚こニ醇化Exedin類似物,其中，該Exedin類似物具有如下的序列結(jié)構(gòu) His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Va1-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro—ber—Lys, 其中，Z是Leu、或lie，并且上述結(jié)構(gòu)中有ー個(gè)Lys殘基上的氨基連接有聚こニ醇基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8所述的聚こニ醇化Exedin類似物，其中，在所述的序列結(jié)構(gòu)中的Lys2°殘基或Lys27殘基上連接有聚こニ醇基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求7-9之一所述的聚こニ醇化Exedin類似物在制備治療糖尿病藥物方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可以在Exendin類似物結(jié)構(gòu)中的任意氨基上定點(diǎn)單取代聚乙二醇化的化合物、其制備方法以及用途。本發(fā)明的方法通過采用更穩(wěn)定的保護(hù)基Dde(N-α-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代環(huán)己亞基))，避免了使用不穩(wěn)定保護(hù)基所帶來的多取代副反應(yīng)，從而可以以低的反應(yīng)摩爾比制備高得率的單取代的聚乙二醇化Exedin類似物。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102718868SQ20111007831
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者岳鵬 申請(qǐng)人:上海華誼生物技術(shù)有限公司