專利名稱：胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT抑制劑在肝癌治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體XCT在肝癌檢測(cè)和預(yù)后方面的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體XCT抑制劑在肝癌治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)-Xe (system-xc) 一種異二聚體氨基酸運(yùn)輸載體，由輕鏈xCT和重鏈4F2hc兩種亞基組成，在介導(dǎo)胱氨酸攝入同時(shí)伴隨著細(xì)胞內(nèi)谷氨酸排出。 胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT是氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)-Xe (system-xc)的一個(gè)功能性亞基。xCT在細(xì)胞攝取胱氨酸和維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘(Glutathione，GSH)肽含量及細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡方面起著重要作用。研究顯示一些疾病的發(fā)生與該基因的異常有關(guān)。然而，迄今為止尚沒(méi)有xCT與肝癌相關(guān)的報(bào)道。原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，占居民腫瘤死亡第二位。肝癌出現(xiàn)癥狀時(shí)多屬中晚期，切除后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高。因此，肝癌的早期診斷以及肝癌的預(yù)后判斷對(duì)采用合理的治療手段、延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間和降低肝
癌死亡率具有重要意義。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)與肝癌診斷和治療相關(guān)的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種與肝癌診斷和治療相關(guān)的蛋白xCT。本發(fā)明的另一目的是提供所述蛋白xCT及其拮抗劑在肝癌診斷和治療方面的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT基因或蛋白的用途，它被用于(a)制備檢測(cè)肝癌的試劑或試劑盒；或(b)制備進(jìn)行肝癌預(yù)后的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括對(duì)xCT進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)。在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)中記載了以下使用說(shuō)明對(duì)胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體XCT進(jìn)行定量檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果用于表征肝癌幾率高低和/或肝癌預(yù)后。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括xCT特異性抗體，或xCT的特異性引物。在另一優(yōu)選例中，上述的試劑包括檢測(cè)用芯片，包括核酸芯片和蛋白質(zhì)芯片。在另一優(yōu)選例中，所述的核酸芯片包括基片和點(diǎn)樣在基片上的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針，所述的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針包括與xCT的特異性結(jié)合的探針。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白質(zhì)芯片包括基片和點(diǎn)樣在基片上的癌癥相關(guān)蛋白的特異性抗體，所述的癌癥相關(guān)蛋白的特異性抗體包括抗xCT的特異性抗體。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體XCT的用途，它被用作肝癌預(yù)后的標(biāo)志物。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于檢測(cè)肝癌預(yù)后的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測(cè)胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)注明所述試劑盒用于檢測(cè)或診斷肝癌預(yù)后。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)試劑包括特異性抗體和/或特異性引物。在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)中注明以下內(nèi)容當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的xCT的mRNA表達(dá)量與P -肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量之比^ 0. 0025 (較佳地> 0. 003，更佳地> 0. 004)，則表明該對(duì)象的預(yù)后差(低于全體或一般肝癌患者的平均預(yù)后)；和/或當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的xCT的mRNA表達(dá)量與P -肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量之比< 0. 002 (較 佳地< 0. 002，更佳地< 0. 001)，則表明該對(duì)象的預(yù)后好(高于全體或一般肝癌患者的平均預(yù)后)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于檢測(cè)人肝臟樣品或血液樣品。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT拮抗劑的用途，所述的拮抗劑被用于制備抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的藥物，或用于制備治療肝癌的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑包括xCT的抗體、xCT的反義RNA、siRNA、以及xCT的活性抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的xCT的活性抑制劑是柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine,SASP)。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種體外非治療性的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，包括步驟在xCT拮抗劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括向癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加xCT拮抗劑，從而抑制抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。在另一優(yōu)選例中，所述的癌細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選治療肝癌的候選化合物的方法，所述方法包括步驟(a)測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT的表達(dá)量和/或活性；其中，如果測(cè)試組中細(xì)胞的xCT的表達(dá)量和/或活性小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)xCT的表達(dá)和/或活性有抑制作用的治療肝癌的候選化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞包括肝癌細(xì)胞、肝細(xì)胞以及其他非癌細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的xCT活性是通過(guò)活性氧(ROS)檢測(cè)而得出的。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(b)對(duì)于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制作用。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中包括步驟測(cè)試組中，肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，如果測(cè)試組中肝癌細(xì)胞的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖有抑制作用的治療肝癌的候選化合物。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種抑制或治療癌癥的方法，包括步驟給需要治療的對(duì)象(哺乳動(dòng)物)施用安全有效量的胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT拮抗劑的用途。在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括肝癌。在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑包括xCT的抗體、xCT的反義RNA、siRNA、以及xCT的活性抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的xCT的活性抑制劑是柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine,SASP)。 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了 xCT在癌組織中的表達(dá)水平要明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織及正常肝組織(圖1A)并且低表達(dá)xCT的病人的相對(duì)于高表達(dá)的病人有更好的預(yù)后(圖1B)。圖2顯示了 xc的兩個(gè)亞基(xCT亞基和4F2hc亞基)在多種肝癌細(xì)胞系中mRNA相對(duì)表達(dá)(基于P -肌動(dòng)蛋白進(jìn)行歸一化處理)(圖2A和2B)，以及xCT蛋白在多種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)(圖2C)。圖3顯示了 xCT的抑制劑SASP能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞Huh_7和SK-H印-I的生長(zhǎng)。圖4顯示了針對(duì)xCT的拮抗劑siRNAs可以抑制Huh_7和SK-Ifep-I細(xì)胞內(nèi)的xCT表達(dá)，并且進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。圖5顯示了 xCT拮抗劑能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh-7和SK-Hep-I的克隆形成能力。圖中，"blank"表示空白對(duì)照。圖6顯示了 xCT拮抗劑能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh-7體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，xCT在各種肝癌細(xì)胞系中均有高表達(dá)，可作為肝癌檢測(cè)的標(biāo)志物用于檢測(cè)或輔助性檢測(cè)肝癌。此外，xCT的表達(dá)或活性高低與病人的預(yù)后相關(guān)，可作為病人預(yù)后的判斷指標(biāo)。此外，xCT的拮抗劑可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明人通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，xCT在各種不同肝癌細(xì)胞系中有高表達(dá)，并且在病人的在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織或正常肝臟組織。此外，高表達(dá)或高活性的xCT和病人的預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。因此，xCT在肝癌細(xì)胞或組織中表達(dá)情況，可用于輔助性診斷或判斷檢測(cè)對(duì)象患肝癌的幾率高低、以及肝癌病人的預(yù)后。試驗(yàn)還證明，應(yīng)用xCT的特異抑制劑柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine, SASP)及干擾RNA(siRNA)可以在體外明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆形成能力；SASP還能在體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，使用xCT拮抗劑來(lái)抑制xCT的功能，可以抑制體外和體內(nèi)的肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而為肝癌的治療提供了新的途徑。xCT蛋白和多核苷酸在本發(fā)明中，“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明多肽”、“xCT蛋白”可互換使用，指胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT。應(yīng)理解，所述術(shù)語(yǔ)還包括xCT的活性片段和衍生物。在本發(fā)明中，“本發(fā)明基因”、“本發(fā)明多核苷酸”指編碼xCT蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“xCT蛋白”、“xCT多肽”或“肝癌標(biāo)志物xCT”可互換使用，都指具有人蛋白xCT氨基酸序列的蛋白或多肽。胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT的核苷酸和氨基酸序列可參見(jiàn)Primary GenBankAccession :NM—014331，Entrez Gene ID :23657, UniProt ID :Q9UPY5。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。如本文所用，“分離的xCT蛋白或多肽”是指xCT蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化xCT蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼xCT的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼xCT蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的人xCT核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或xCT蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的xCT蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟 (I).用本發(fā)明的編碼人xCT蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人xCT編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CH0、COS、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
口 o抗體本發(fā)明還包括對(duì)人xCT蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人xCT基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人xCT基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
抗人xCT蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人xCT蛋白。拮抗劑和藥物組合物利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與xCT蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，尤其是抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明xCT蛋白的拮抗劑(包括抗體、抑制劑)，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可抑制xCT蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞(包括肝癌)的生長(zhǎng)或增殖。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明xCT拮抗劑(如抗體、反義序列(如siRNA)、或抑制劑)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。檢測(cè)方法和試劑盒本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人xCT蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人xCT蛋白水平，可以用于診斷腫瘤和用于肝
癌預(yù)后。一種檢測(cè)樣品中是否存在xCT蛋白的方法是利用xCT蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與xCT蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表不樣品中存在xCT蛋白。xCT蛋白或其多核苷酸可用于xCT蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷?？箈CT的抗體可以固定在蛋白質(zhì)芯片上，用于檢測(cè)樣品中的xCT蛋白。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肝癌或肝癌預(yù)后的的試劑盒，它含有特異性擴(kuò)增xCT的引物對(duì)和/或xCT特異性抗體。篩選方法本發(fā)明還提供了基于胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT進(jìn)行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響(抑制)xCT表達(dá)或活性的化合物，然后對(duì)篩選出的化合物進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)癌細(xì)胞。其中，代表性的癌細(xì)胞包括(但并不限于)肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞等。一種篩選方法可基于xCT的mRNA的表達(dá)水平。另一種篩選方法可基于活性氧檢測(cè)。活性氧(ROS)檢測(cè)是一種常規(guī)的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的方法，可通過(guò)檢測(cè)ROS可以確定xCT的活性。xCT的活性越高，則ROS越低?；钚匝?ROS)檢測(cè)可用市售的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。一種活性氧檢測(cè)試劑盒 (Reactive Oxygen Species Assay Kit)是利用突光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。DCFHDA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(a) xCT的表達(dá)水平和活性水平可用作肝癌檢測(cè)的標(biāo)志物。(b)xCT的表達(dá)水平和活性水平可用作肝癌預(yù)后的標(biāo)志物。(c)xCT拮抗劑可有效抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。實(shí)施例材料一、抗體籲Anti-xCT 抗體,購(gòu)自 LifeSpan BioSciences, Seattle, USA。# Anti-GAPDH 抗體，購(gòu)自 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO。二、引物引物序列見(jiàn)表I。表I 用于 Real-time PCR 的引物
權(quán)利要求
1.一種胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT基因或蛋白的用途，其特征在于，用于(a)制備檢測(cè)肝癌的試劑或試劑盒；或(b)制備進(jìn)行肝癌預(yù)后的試劑或試劑盒。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的試劑盒包括對(duì)xCT進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)。
3.—種胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT的用途，其特征在于，被用作肝癌預(yù)后的標(biāo)志物。
4.一種用于檢測(cè)肝癌預(yù)后的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測(cè)胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)注明所述試劑盒用于檢測(cè)或診斷肝癌預(yù)后。
5.一種胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT拮抗劑的用途，其特征在于，所述的拮抗劑被用于制備抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的藥物，或用于制備治療肝癌的藥物。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑包括xCT的抗體、xCT的反義RNA、siRNA,以及xCT的活性抑制劑。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的xCT的活性抑制劑是柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine, SASP)。
8.—種體外非治療性的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，其特征在于，包括步驟在xCT拮抗劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。
9.一種篩選治療肝癌的候選化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟 (a)測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT的表達(dá)量和/或活性； 其中，如果測(cè)試組中細(xì)胞的xCT的表達(dá)量和/或活性小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)xCT的表達(dá)和/或活性有抑制作用的治療肝癌的候選化合物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟 (b)對(duì)于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)體xCT抑制劑在肝癌治療中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種肝癌中高表達(dá)的標(biāo)志物xCT。此外，xCT的表達(dá)或活性高低與病人的預(yù)后相關(guān)，因此，xCT在肝癌細(xì)胞或組織中表達(dá)情況，可用于輔助性診斷或判斷檢測(cè)對(duì)象患肝癌的幾率高低以及用于肝癌病人的預(yù)后。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的檢測(cè)方法、試劑盒和篩選方法。
文檔編號(hào)A61K31/635GK102719521SQ20111008018
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者何祥火, 張振峰, 郭維杰 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所