專利名稱：一種vegf165類似物的制備的制作方法
技術領域：
人血管內皮生長因子165突變體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備屬于長效重組融合蛋白藥物技術領域涉及DNA重組技術，藥物蛋白與HSA的融合使得藥物成為長效藥物。
背景技術：
血管內皮生長因子(vascularendothelium growth factor，VEGF)是血管內皮細胞的特異絲裂原，1989年由!^errara等在牛垂體濾泡星形膠質細胞體外培養(yǎng)液中分離純化出來的，具有細胞質的鈣聚集作用，促進血管內皮細胞增殖，誘導血管生成，增加血管通透性，血管保護等生物學作用。人的VEGF基因位于染色體的6p21. 3，編碼VEGF的基因長141Λ，由8個外顯子和 7個內含子交替組成，分子量35 45kD。VEGF根據(jù)VEGFmRNA剪接方式不同分為多個變構體，有 VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189 和 VEGF206。VEGF165 以同源二聚體的形式存在，糖基化的VEGF165 二聚體相對分子質量約為45000，非糖基化的相對分子質量約為43000。血管內皮生長因子165(VEGF16Q是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的腫瘤血管形成促進劑之一，具有促血管形成和增加血管通透性的雙重功能，在腫瘤的發(fā)展和轉移中起著重要作用。VEGF165在體內的半衰期比較短，大約為90分鐘。容易受到體內纖溶酶和其他蛋白酶的作用而降解。VEGF165在血管內皮細胞培養(yǎng)、相關科學研究有著廣泛的應用，并且在傷口愈合及冠心病的治療上顯示了廣闊的前景。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血漿中的主要蛋白成分，它除了具有維持血漿滲透壓功能以外，還能擔當許多內源因子和外源藥物的載體，從而調節(jié)激素活性，所載物質的毒性，以及藥物的利用度。成熟的HSA有585個氨基酸殘基組成，含有17對二硫鍵，分子量約為66. 5KDa，如此大的分子量減小了它在內循環(huán)時經腎排泄的量，再正常情況下，不易被腎小球慮過，血漿半衰期在20天左右。同時，HSA在人體內沒有酶學和免疫學活性，是一種理想的生物活性蛋白載體。針對VEGF165的缺陷和HSA的優(yōu)點，我們通過對VEGF165的結構特征分析，設計了高活性且穩(wěn)定的VEGF165類似物，實現(xiàn)了在畢赤酵母中分泌表達和制備。結合白蛋白融合技術，獲得高度穩(wěn)定的VEGF165類似物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個內容是提供hVEGF165突變體與HSA生理特性于一體的人血管內皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，該融合蛋白在保持了人血管內皮生長因子165 生理特性的基礎上，增加了作用位點，延長了體內半衰期，改善了溶解度，具有優(yōu)良的藥學特性。本發(fā)明的技術方案在前期的研究中本實驗室保藏了重組質粒PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA質粒。我們對VEGF165的纖溶酶位點進行突變，這樣使得VEGF165的體內的穩(wěn)定性大大增加。再利用HSA高度穩(wěn)定的特性，將突變的VEGF165與白蛋白進行融合，得到的VEGF165與白蛋白的融合分子在保持VEGF165生物學活性的同時具有高度的穩(wěn)定性。這將使得該產品在細胞培養(yǎng)以及冠心病藥物的開發(fā)上具有目前市場產品不可比擬的優(yōu)越性。本發(fā)明hVEGF165和HSA之間不加任何連接肽，可以避免因連接肽的加入而帶來的融合蛋白穩(wěn)定性和免疫源性方面的問題。本發(fā)明的第二個內容是提供表達該融合蛋白編碼區(qū)的宿主和攜帶該融合蛋白編碼區(qū)的重組表達載體。表達融合蛋白的宿主可以是細菌、酵母、動物細胞或植物細胞。表達出來的融合蛋白可以存在于宿主細胞內，也可以從宿主細胞中分泌出來；分泌所用的信號肽可以是大然的人血清白蛋白的信號肽，也可以是釀酒酵母阿爾法交配因子的信號肽，或者這兩種信號肽的類似物；目的基因可以被整合到宿主的染色體中，也可以插入到質粒中。本發(fā)明優(yōu)選的宿主系統(tǒng)是酵母表達系統(tǒng)，優(yōu)選的酵母表達系統(tǒng)是畢赤酵母表達系統(tǒng)，優(yōu)選的畢赤酵母表達系統(tǒng)是GS115和X33。這種表達系統(tǒng)除了具備原核表達系統(tǒng)的易操作、生長迅速、營養(yǎng)要求簡單、易工業(yè)放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白后修飾系統(tǒng)，有利于大量生產高質量的重組蛋白。與宿主對應的表達載體大多可以購買商品化的，如畢赤酵母表達系統(tǒng)對應的載體，分泌型的有 PPIC9K、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6，胞內型有 pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、 pGAPZ.pGAPZa等。優(yōu)選的是畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有纖氨酸缺陷型的選擇性標記基因HIS4、AOXl啟動子、MFa分泌信號肽和G418抗性基因等元件。AOXl (醇氧化酶操縱子)5’序列、3’序列用于方便編碼基因整合至酵母基因組和控制編碼基因的表達。轉化帶有融合cDNA的表達載體到宿主細胞中，可以用鋰鹽法、PEG法、原生質體法、電穿孔法或化學轉化等方法。轉化之后，可以用多種方法鑒定是否成功，如提取基因組 DNA進行PCR鑒定，或者對細胞培養(yǎng)上清中的蛋白進行HSA抗體和hVEGF165多抗檢測。生產本發(fā)明的融合蛋白可以通過培養(yǎng)帶有本發(fā)明構件的DNA的宿主系統(tǒng)來進行， 具體的培養(yǎng)方法可以用搖瓶或生物反應器。培養(yǎng)分為兩個階段宿主系統(tǒng)生長階段和融合蛋白合成階段。之后可以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構建體的細胞培養(yǎng)物中分離純化融合蛋白，包括鹽析、沉淀、超濾、層析、制備電泳等技術及這些技術的組合。


圖1 重組質粒pPIC9K-HSA-hVEGF165物理圖譜圖2 重疊PCR獲得VEGF165的突變體1 重疊PCR獲得的VEGF165突變片段圖3 :融合蛋白的SDS-PAGE分析M 為低分子量蛋白質標準；1-12為GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165的發(fā)酵液上清具體實施方法一、實驗材料JM109 空菌、DH5a/pPIC9K、畢赤酵母 GS115(his4Mut+)、PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA質粒為本實驗室保藏；質粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；pyrobest DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA Ladder Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司；所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司代為合成；所有測序服務由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。二、實驗方法實施例1 :pPIC9K-HSA-VEGF165mut畢赤酵母表達質粒的構建。以PIC9K-hVEGF165為模板，通過重疊PCR擴增出hVEGF165突變體基因(圖2)，用 2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，回收500bp左右的片斷，用Bsu361I、NotI對回收片斷和pBluescript-HSA質粒進行雙酶切，連接再轉化到新鮮制作的JM109感受態(tài)細胞。挑選陽性轉化子進行酶切驗證。陽性重組子提取質粒再通過EcoRI/NotI雙酶切獲得片斷插入到pPIC9K對應的酶切位點，獲得正確的pPIC9K-HSA-VEGF165mut畢赤酵母表達質粒(圖 1)，并通過EcoRI/NotI雙酶切及測序進行驗證。實施例2 重組酵母表達系統(tǒng)構建及融合蛋白的表達；活化并過夜培養(yǎng)JM109/pPIC9K-HSA-hVEGF165mut，提取的質粒，經Mil線性化， 電擊轉化畢赤酵母GSl 15，轉化物涂布與含0. 25mg/ml G418的MD平板上，30°C培養(yǎng)72小時，挑取所有的長出的菌落到含0. 5mg/ml G418的YPD平板上，30°C培養(yǎng)2_3大。挑取長勢好的菌落到20ml液體YPD培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，提取GSl 15全基因組DNA，PCR 鑒定出陽性重組子，并把它保存在含20%甘油的YPD中，凍存于-80°C，命名為GS115/ pPIC9K-HSA-hVEGF165。將GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165mut 接種到裝有 30ml BMGY (IOOmM 磷酸鉀，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4Χ1(Γ5%生物素；3%甘油)的 250ml 三角瓶中，215rpm，30C培養(yǎng) 24-36 小時，冷凍沉降菌體，棄去上清，加入25ml BMMY(1 OOmM磷酸鉀，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4X10_5% 生物素；2. 5%甲醇)。每M小時補加一次甲醇，誘導3天。SDS-PAGE檢測重組融合蛋白的表達情況采用5%濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮藍R-250染色 (圖幻。挑選表達量較高的菌株擴大培養(yǎng)，收集離心得上清，上清液經IOkDa分子截留量的膜超濾濃縮，再經Blue-S印harose層析分離，IM精氨酸洗脫獲得較純的HSA_hVEGF165融合蛋白。
權利要求
1.hVEGF165纖溶酶酶切位點突變體與人血清白蛋白的融合蛋白。
2.人血管內皮生長因子165突變體與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是hVEGF165與人血清白蛋白融合基因，中間不加任何連接肽對應的核苷酸序列；得到的 HSA-hVEGF165mut融合基因插入到克隆載體，轉化到宿主系統(tǒng)中進行表達，融合基因被整合到宿主的染色體中。
3.權力要求1、2和3所述的人血管內皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包括與人血管內皮生長因子165至少95%序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少95%序列同源的第二區(qū)。
4.權力要求1、2和3所述的人血管內皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包括與人血管內皮生長因子165氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述兩區(qū)的功能等同物。
5.權力要求4所述的人血管內皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是 所述的功能等同物是在不改變所述的融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白的個別氨基酸的殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6.權力要求1、2和3所述的人血管內皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是提供攜帶編碼融合蛋白的基因序列的重組表達載體，pPIC9K-HSA-hVEGF165。
7.權力要求1、2和3所述的人血管內皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是表達融合蛋白的宿主優(yōu)選是酵母，酵母中優(yōu)選畢赤酵母，畢赤酵母中優(yōu)選是GS115， X-33。
8.權力要求1、2和3所述的人血管內皮生長因子165與人血清白蛋白的融合蛋白在替代hVEGF165的應用。
全文摘要
人血管內皮生長因子165(hVEGF165)突變體與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制備技術的發(fā)明屬于長效重組融合蛋白技術領域。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血管內皮生長因子165至少85％序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)。利用重疊PCR的方法獲得VEGF165的突變體，利用限制性酶切連接的方法將hVEGF165與HSA拼接，中間不加入任何連接肽。該融合蛋白可以在不改變融合蛋白特性的前提下，進行個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入，它們在保留了hVEGF165活性的基礎上，可望顯著延長在體內的半衰期，是藥學領域中，能夠替代hVEGF165的，有良好前景的藥用融合蛋白。
文檔編號A61K47/48GK102212140SQ20111008130
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權日2011年4月1日
發(fā)明者儲敏, 周曉晶, 朱瑞宇, 李琪, 臧嫻, 辛鑫, 金堅, 陳蓉 申請人:江南大學