專利名稱：抑制miR-27b表達的化合物、含有該化合物的藥物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及miR-27b作為心臟疾病治療的靶標分子的應(yīng)用，尤其涉及一種以 miR-27b為靶標治療心臟疾病的藥物。
背景技術(shù)：
近幾年來，心臟疾病的發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢，大多數(shù)心臟疾病患者最終會因為形成心衰而死亡，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，心臟疾病已成為目前導(dǎo)致死亡的主要原因之一。 心衰的發(fā)生和發(fā)展是多種因素參與的復(fù)雜變化過程，心肌肥厚和心肌纖維化是其中重要的兩個因素。心肌肥厚通常是在眾多病理刺激下，如心肌缺血、高血壓，心瓣膜缺陷等，心肌發(fā)生的肥大反應(yīng)，主要表現(xiàn)為心室壁增厚，心肌細胞體積增大和某些胚胎期基因表達升高等。 盡管早期心肌肥厚代償期被認為是心臟的一種適應(yīng)性反應(yīng)，有利與增強心臟的功能，但是心肌長期處于肥厚狀態(tài)會導(dǎo)致心律不齊、心衰和心臟猝死。因此研究形成心肌肥厚的分子機制將有助于我們更好的了解心衰形成早期的機制，有利于心衰的早期診斷和防治，并可為臨床上心臟疾病的基因治療提供重要的靶標分子。近期的研究表明miRNAs在心臟疾病發(fā)生過程中也扮演著極其重要的角色。在橫大動脈縮窄或過表達活性鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin)時，小鼠心臟組織中miRNA的表達發(fā)生變化，部分miRNA表達變化與人類衰竭心臟組織中的miRNAs變化相似，體內(nèi)外實驗表明其中一些miRNA的過表達足以誘發(fā)心肌細胞發(fā)生肥大。在TAC致小鼠心肌肥厚早期 miR-Ι表達水平明顯降低，體外轉(zhuǎn)染miR-1可以抑制ET-I引起的心肌肥厚。此外，在人類心肌肥厚標本和小鼠心肌肥厚模型中發(fā)現(xiàn)miR-133表達水平降低，體外過表達miR-133抑制心肌肥大的發(fā)生，miR-133的敲減可促進心肌肥厚的發(fā)生。另有兩個研究小組利用基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)研究miR-208在心臟中的功能，發(fā)現(xiàn)miR-208在應(yīng)激依賴的心肌細胞生長和基因調(diào)節(jié)方面起到重要的調(diào)節(jié)作用。除了在心肌肥厚中發(fā)揮功能外，還有一些miRNA被證實在調(diào)節(jié)心肌纖維化和心肌細胞凋亡方面發(fā)揮了重要作用。在病理性心肌肥厚中，miR-133和miR-30的表達水平降低，CTGF表達水平升高，容易發(fā)生纖維化改變，說明 miR-133和miR-30在調(diào)節(jié)心肌纖維化過程中發(fā)揮了重要作用。在急性心肌梗死中，miR-四家族分子表達水平下調(diào)。通過對其靶分子的分析發(fā)現(xiàn)其作用的靶分子多為纖維化相關(guān)蛋白，miR-四的下調(diào)使這些分子表達升高，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。這些研究表明miRNAs在心臟疾病中的確發(fā)揮了重要的功能。鑒于miRNAs在心臟中發(fā)揮的重要功能，近幾年來，國內(nèi)外研究者陸續(xù)開展了利用針對miRNA的調(diào)節(jié)來進行心臟疾病的治療和預(yù)防，取得了一些良好的結(jié)果。目前應(yīng)用較廣泛的形式是Antagomir，Antagomir是根據(jù)microRNA成熟體序列而設(shè)計，經(jīng)過特殊標記與修飾的單鏈RNA，專門用于抑制內(nèi)源性microRNA的高效阻斷劑。2008年有學(xué)者報導(dǎo)在心臟組織中利用Antagomir-21抑制miR-21的表達可有效地預(yù)防和治療由壓力性負荷升高引起的心肌肥厚和心衰。在小鼠中敲減miR-23a可預(yù)防異丙腎上腺素引起的心肌肥厚。體內(nèi)應(yīng)用 Antagomir-320可減輕由缺血-再灌注引起的心臟纖維化。最近又有兩個國外的研究小組的研究結(jié)果顯示miR-210和miR-494可作為治療缺血性心臟疾病的新的治療靶標分子。以往的研究顯示miR_27b在發(fā)生心肌肥厚的小鼠模型及主動脈硬化的人類標本中表達水平明顯升高，提示其在心臟疾病發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要的作用，但關(guān)于其在心臟中的具體功能尚未見報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制miR_27b表達的化合物以及含有該化合物的藥物。對miR-27b在心臟中的功能的研究發(fā)現(xiàn)miR_27b在心肌肥厚中發(fā)揮重要功能，而在體內(nèi)抑制miR-27b的表達可以緩解由壓力性負荷引起的心肌肥厚和心臟功能受損，說明 miR-27b可成為心臟疾病治療新的靶標分子。為此，本發(fā)明提供了特異性抑制miR_27b表達的化合物在制備治療心臟疾病的藥物中的應(yīng)用。其中，所述心臟疾病為心肌肥厚、心肌纖維化及其導(dǎo)致的心功能異常。本發(fā)明提供一種治療心臟疾病的藥物，其包括特異性抑制miR_27b表達的化合物。其中，所述化合物為小分子干擾核糖核酸、小分子干擾核糖核酸化學(xué)修飾物或在體內(nèi)產(chǎn)生小分子干擾核糖核酸的載體等。優(yōu)選地，所述小分子干擾核糖核酸為SiRNA或shRNA。優(yōu)選地，所述siRNA的核苷酸序列為5，-GCAGAACUUAGCCACU⑶GAA-3，。優(yōu)選地，所述載體為含有以5’ -GCAGAACTTAGCCACTGTGAA-3’為外源基因的表達盒的病毒載體。其中，所述病毒載體可用腺病毒載體。將所述的抑制miR_27b表達的病毒載體線性化，可獲得線性雙鏈DNA分子。線性雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)染細胞可獲得抑制miR-27b表達的病毒。該抑制miR_27b表達的病毒的基因組DNA為所述的線性雙鏈DNA分子。本發(fā)明還提供了兩種治療心臟疾病如心肌肥厚、心肌纖維化及其導(dǎo)致的心功能異常的藥物，其有效成分別為所述的抑制miR-27b表達的病毒和RNA抑制劑 (5，-GCAGAACUUAGCCACU⑶GAA-3，)。上述治療心臟疾病的藥物可通過靜脈注射方式給藥，腺病毒劑量為2. SXKTpfu， 僅注射一次；RNA抑制劑的劑量為80mg/kg/d并連續(xù)三天給予注射。本發(fā)明通過心肌細胞實驗確定miR_27b在心肌肥厚中的功能，通過包裝特異性抑制miR-27b表達的的腺病毒及合成的針對miR-27b的抑制劑，對TAC手術(shù)建立的壓力性負荷引起心肌肥厚的小鼠模型進行治療，結(jié)果顯示這兩種抑制劑均能有效地緩解TAC手術(shù)引起的心肌肥厚和纖維化，小鼠心室壁厚度明顯變薄，心臟收縮功能也得到了明顯的緩解，因此miR-27b可作為心臟疾病治療新的靶標分子。


圖1體外心肌細胞尺寸測定結(jié)果。圖2利用抑制miR_27b進行心臟疾病治療的策略示意圖。圖3Ad-anti-miR_27b抑制效果的檢測。圖4TAC手術(shù)后小鼠心臟組織中miR_27b表達水平的檢測。 圖 5 利用 Ad-anti-miR-27b 和 Antagomir_27b 對 TAC手術(shù)小鼠進行治療后 miR_27b表達水平的檢測。圖6利用Ad-anti-miR-27b對TAC手術(shù)小鼠進行治療后心臟功能檢測結(jié)果。圖7利用Antagomir-27b對TAC手術(shù)小鼠進行治療后心臟功能檢測結(jié)果。圖8利用Ad-anti-miR-27b對TAC手術(shù)小鼠進行治療后心臟形態(tài)學(xué)觀察及分子標志物檢測結(jié)果。圖9利用Antagomir-27b對TAC手術(shù)小鼠進行治療后心臟形態(tài)學(xué)觀察及分子標志物檢測結(jié)果。圖10利用Ad-anti-miR-27b對TAC手術(shù)小鼠進行治療后心臟組織學(xué)觀察結(jié)果。圖11利用Antagomir-27b對TAC手術(shù)小鼠進行治療后心臟組織學(xué)觀察結(jié)果。圖12利用Ad-anti-miR-27b和Antagomir_27b對TAC手術(shù)小鼠進行治療后對 miR-27b靶分子PPAR- γ表達水平進行檢測的結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明的第一方面是miR_27b過表達腺病毒的包裝和體外細胞實驗，包括以下步驟將包含miR_27b前體的基因序列連入pAcKTrack載體，經(jīng)Riie I線性化后與 pAd-easy載體在BJ5183菌中進行重組，獲得pAd_miR-27b。將獲得的載體經(jīng)I^c I線性化回收后轉(zhuǎn)染細胞獲得過表達miR-27b的腺病毒(pAd_miR-27b)，將病毒擴增后按IOOmoi 感染心肌細胞48h，(同時以Ad-GFP作為陰性對照，以Ad-GFP感染同時加PE處理的作為陽性對照)，通過免疫熒光染色和計量軟件測量，分析miR-27b過表達對心肌細胞尺寸的影響，同時提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測肥大標志基因的變化。本發(fā)明的第二方面敲低miR_27b腺病毒的包裝，包括以下步驟將成串的與miR_27b成熟序列反向互補的序列(anti_miR-27b) (5 ‘ -GCAGAACTTAGCCACTGTGAA-3 ‘)連入 pAd-Track 載體，經(jīng) Rne I 線性化后與 pAd-easy 載體在BJ5183菌中進行重組，獲得pAd-anti-miR-27b。將獲得的載體經(jīng)Rne I線性化回收后轉(zhuǎn)染細胞獲得敲低miR-27b的腺病毒(Ad-anti_miR-27b)。本發(fā)明的第三方面是TAC手術(shù)模型建立心肌肥厚小鼠模型并確定治療開始的時間，包括利用結(jié)扎心臟升主動脈手術(shù)建立壓力性負荷引起的心肌肥厚小鼠模型(對照組小鼠進行同樣的手術(shù)，但是不進行升主動脈結(jié)扎)。手術(shù)前及手術(shù)后lw，2w分別進行超聲檢測，確定發(fā)生明顯心肌肥厚的時間為治療實驗開始的時間。利用northern-blot驗證 miR-27b在TAC術(shù)后Iw和2w表達水平也是明顯升高的。本發(fā)明的第四方面是將Ad-anti-miR-27b和Antag0mir-27b (其所含核苷酸序列為5’ -GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3’ )經(jīng)靜脈注射方式導(dǎo)入部分TAC小鼠體內(nèi)，對照組及另一部分TAC手術(shù)小鼠經(jīng)靜脈注射相同體積的生理鹽水。本發(fā)明的第五方面是對治療后3周的小鼠進行系統(tǒng)的表型分析，包括用Trizol提取小鼠組織的總RNA，取25 μ g總RNA進行microRNA Northern雜交， 以 miR-27b 探針進行 Northern blot 雜交，發(fā)現(xiàn) Ad-anti_miR-27b 和 Antagomir_27b 可有效地降低由于TAC手術(shù)引起的miR-27b表達水平的升高。
取Siam組，TAC組及TAC治療組進行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，TAC手術(shù)組小鼠心臟較Siam 組心臟明顯增大，而TAC治療組的心臟較TAC組心臟明顯減小，測量的心臟體重比值及心臟脛骨長度比值也反映了這一趨勢。對這幾組小鼠進行了 H&E，Masson和Laminin染色，結(jié)果顯示TAC手術(shù)后小鼠的心肌細胞尺寸增加，纖維化明顯增加，而應(yīng)用Ad-anti-miR-27b或 Antagomir-27b治療后的TAC組小鼠較TAC組小鼠相比，心肌細胞尺寸減少，心肌纖維化也明顯減少。對小鼠進行功能檢測也發(fā)現(xiàn)相似的趨勢。本發(fā)明人通過Ad-anti-miR-27b和Antagomir_27b，對由TAC手術(shù)引起的壓力性負荷導(dǎo)致的心肌肥厚小鼠模型進行治療實驗，發(fā)現(xiàn)這兩種抑制劑能有效地降低由TAC手術(shù)引起的miR-27b表達升高并能有效地減輕由壓力性負荷增加引起的心臟增大、心肌細胞尺寸增加、纖維化增加及心臟功能的受損，結(jié)果表明該miRNA有可能成為心臟疾病治療新的靶標分子，而對其產(chǎn)生抑制作用的腺病毒或抑制劑將有可能成為心臟疾病治療的新型藥物。以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明。但是，這些實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的任何限定。實施例1過表達miR-27b腺病毒的包裝與細胞感染實驗將包含miR_27b前體的基因序列連入pAcKTrack載體，經(jīng)Riie I線性化后與 pAd-easy載體在BJ5183菌中進行重組，獲得pAd_miR-27b。將獲得的載體經(jīng)I^ac I線性化回收后轉(zhuǎn)染細胞獲得過表達miR-27b的腺病毒(pAd_miR-27b)。將病毒擴增后按 IOOmoi感染心肌細胞48h，(同時以Ad-GFP作為陰性對照，以Ad-GFP感染同時加去氧腎上腺素(PE)處理的作為陽性對照)，通過免疫熒光染色和計量軟件測量，分析miR-27b過表達對心肌細胞尺寸的影響，同時提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測肥大標志基因的變化。結(jié)果見圖 1，顯示了 miR-27b在體外促進心肌肥厚。實施例2敲低miR_27b腺病毒的包裝與鑒定將包含成串的與miR_27b成熟序列反向互補序列，連入pAcKTrack載體，經(jīng)Rne I 線性化后與pAd-easy載體在BJ5183菌中進行重組，獲得pAd-anti-miR-27b。將獲得的載體經(jīng)I^ac I線性化回收后轉(zhuǎn)染細胞獲得敲低miR-27b的腺病毒Ad-anti-miR-27b。將獲得的腺病毒Ad-anti-miR-27b擴增后感染分離的原代心肌細胞，48h后提RNA，進行miRNA northern blot的檢測，見圖3，發(fā)現(xiàn)這個腺病毒能成功地敲低miR_27b的表達。實施例3TAC手術(shù)模型的建立和miR_27b表達水平的檢測(一)手術(shù)模型的建立1、使用0. 125%三溴乙醇將動物麻醉，并對小鼠進行氣管插管；2、將小鼠移到解剖臺進行手術(shù)，固定四肢及小鼠尾部；3、在顯微鏡指導(dǎo)下，沿小鼠胸骨剪開胸腔，使用開胸器擴張并固定一個小切口，便于后面的結(jié)扎手術(shù)；4、分離出心臟升主動脈，使用沈號標準marker，在升主動脈周圍進行結(jié)扎，引起壓力性負荷增加；關(guān)閉胸腔，將小鼠放在保溫臺上直至蘇醒；5、對照組小鼠進行同樣的手術(shù)操作，但不進行升主動脈結(jié)扎。(二)miR_27b表達水平的檢測1.組織總RNA的提取(1)將小鼠心臟組織IOOmg放入aiil Trizol中，用勻漿器進行勻漿，于室溫培養(yǎng)5分鐘。(2)加入0.細1氯仿，蓋緊瓶蓋劇烈振蕩15秒，放置2-3分鐘。2-8 ， 10000-12000g 離心 15 分鐘。(3)將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入0. 5ml異丙醇，混勻，室溫放置10 分鐘，2-8°C ,10000-12000g 離心 10 分鐘。(4)棄上清，加入至少anl 75%的異丙醇洗滌，2-8で，不大于7500g離心5分鐘。(5)棄上清，空氣干燥5-10分鐘，加入無RNase的水500 ill，反復(fù)抽吸使RNA溶解。(6) 55-60で保溫10分鐘，-70で冰箱儲存?zhèn)溆谩?. miRNA Northern 雜交檢測 miR-27b 的表達(1)材料準備180で烤器皿三角錐瓶、量筒、鑷子等大于6小吋；電泳槽清洗梳 子和電泳槽，并用3%雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用；處理DEPC水OL)備用。(2)樣品處理25 U g總RNA加上樣緩沖液(1:1)，煮沸5分鐘，冰浴2分鐘，12000 轉(zhuǎn)離心30秒。(3)電泳15%PAGE/8M尿素/0.5XTBE;電流30mA;時間1小時左右，藍色到 底。電泳緩沖液0.5XTBE。(4)染膠用0. 5XTBE加EB進行染膠(專用皿)，RT lOmin。(5)轉(zhuǎn)膜半干法，電流200mA ；時間30分鐘；順序擦干凈，從下面起三層濾紙+ 膜+膠+三層濾紙；趕氣泡。(6)固定轉(zhuǎn)膜后放在濾紙上瞭干，紫外交聯(lián)2次，雜交爐80で烤1小吋，保鮮膜封存。(7)預(yù)雜交預(yù)雜交液于65で融化；膜置于TBE中，然后放入已倒入半瓶TBE的雜 交瓶中，然后倒出TBE，使膜緊貼在管壁上；放入雜交液anl (最少anl，鋒10cm7ml)；雜交 爐37で，預(yù)雜交2個小時以上。標記探針
探針1 ILil (濃度lOpmol)
PNK緩沖液 1 ILil
PNKinase 1 |li1
ddHsO:2 ILil
p32(同位素)5 ILil離心后，37°C反應(yīng)1小時(8)探針純化G-25層析柱，振搖柱子使介質(zhì)落入管中，折斷尾巴，輕輕開蓋， 3800rpm(IOOOg)離心1分鐘；將探針混合物加到柱子中間，3300rpm(IOOOg)離心4分鐘。(9)雜交將純化后的探針放入雜交瓶，37°C雜交過夜。(10)洗膜洗膜液OXSSC/0. 1% SDS)，37で在雜交爐中，2次，鋒次20-30分鐘。(11)壓片，顯影。①PAGE混合物(300ml配方)
丙烯酰胺42.56 g
亞甲雙(bis) 2.24 g
尿素144 g
ΙΟχΤΒΕ:30 ml
ddH20:到 300 ml②尿素PAGE膠(每塊膠配方):PAGE 混合物 6ml10% AP 30 μ 1TEMED 6 μ 1③20 X SSC(ILmS)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCL調(diào)pH值到7. 0，水定容至1L。結(jié)果見圖4和表1。表1統(tǒng)計結(jié)果表明TAC手術(shù)后2w，小鼠出現(xiàn)明顯的心肌肥厚， 圖4結(jié)果說明與Siam手術(shù)組相比較，TAC術(shù)后Iw和2w時，miR_27b表達水平明顯升高。表ITAC術(shù)后2w小鼠心臟超聲檢測結(jié)果
TAC術(shù)后2w
假手術(shù)組侯選用于生理鹽水處理組侯選用于 Ad-anti-miR-27b 處理組侯選用于 Antagomir-27b 處理組N=IlN=9N=4N=5左心室舒張末期內(nèi)徑,mm3.75 土 0.083.77 ±0.083.77 ±0.043.64 土 0.12左心室后壁舒張末期厚度mm0.67 土 0.020.85 ±0.03 *0.82 ±0.20*0.89 土 0.05 *左心室收縮末期內(nèi)徑,mm2.76 土 0.102.74 ±0.082.68 ±0.012.58 ±0.11左心室后壁收縮末期厚度,mm1.02 土 0.031.17 ±0.04*1.15 ±0.02*1.25 土 0.06*左心室前壁舒張末期厚度,mm0.67 土 0.020.84 ±0.02*0.81 ±0.01 *0.88 土 0.04*左心室前壁收縮末期厚度,mm1.04 土 0.021.19 ±0.03*1.25 ±0.03 *1.22 土 0.07*左心室舒張期容積,mm60.76 ±3.1961.11 土 3.1460.87 土 1.3955.98 ±4.43左心室舒張期容積,mm29.08 ±2.7528.44 土 1.9426.58 土 0.3224.39 ±2.42射血分數(shù),％52.75 ±2.6153.59 土 1.7356.26 土 0.9556.48 ±2.57縮短分數(shù),％26.78 ± 1.5627.21 土 1.0928.86 土 0.6429.02 ±1.64左心室質(zhì)量,mg66.56 ±2.9292.51 土 5.81 *87.00 土 0.77"92.44 ±5.03"*P < 0.05(代表與Sham組相比較)。實施例4將Ad-anti-miR-27b和Antagomir_27b分別導(dǎo)入TAC手術(shù)后小鼠體內(nèi)后檢測miR-27b表達水平的變化具體實驗設(shè)計如下共取小鼠28只，其中11只小鼠是Siam手術(shù)組，其余17小鼠為TAC手術(shù)組。將TAC手術(shù)組小鼠隨機分為Saline (生理鹽水組，8只)，Ad-anti-miR-27b組G只)及Antagomir-27b組(5只)，按照圖2中的實驗策略進行處理。(Siam手術(shù)組亦同時給予生理鹽水進行處理)。(一)小鼠尾靜脈注射1、將小鼠固定好，將尾巴拉直，繃緊；2、用酒精棉球擦拭尾巴，使血管擴張；或者用熱水或者熱毛巾焐熱，使靜脈擴張； 選用適當?shù)尼橆^，越細越好；在尾部較靠近上段的地方注射(此處血管較粗)。用酒精或熱水擦拭，擦拭的時候，可把尾巴用力扯在桌面上。注射狀態(tài)為尾巴發(fā)白，緊靠白色的尾骨兩側(cè)清晰可見兩根紅色靜脈；3、用左手的食指，中指，無名指及大拇指將小鼠尾巴固定；4、注射時左手扯尾，使尾巴緊貼桌面，尾巴與桌邊緊貼轉(zhuǎn)彎處為進針部位，一般選擇距尾尖1/4或1/3處進針，此處皮膚較薄，血管清晰，進針容易；5、通過看有無回血來測試針是否在靜脈內(nèi)；6、注射 Ad-anti-miR-27b 和 Antagomir_27b。腺病毒劑量為 2. 5 X 10lclpfu，只需注射一次，RNA抑制劑的劑量為80mg/kg/d并連續(xù)三天進行注射。( 二 ) Northern blot 檢測 miR_27b 表達情況方法同實施例3，結(jié)果見圖5，說明Ad-anti-miR-27b和Antagomir_27b均能有效地降低由于TAC手術(shù)引起的miR-27b表達水平的升高。實施例5利用腺病毒和抑制劑對TAC手術(shù)小鼠進行治療后心臟功能檢測對實施例4的幾組小鼠用三溴乙醇胺麻醉后，剔去胸前區(qū)的被毛，利用帶有 12-MHz微型探頭的Vivid 7超聲檢測儀(GE公司)進行心臟M型超聲的檢測。結(jié)果見圖6、7和表2。圖6和圖7的結(jié)果顯示TAC手術(shù)后2w小鼠出現(xiàn)明顯的心肌肥厚和心臟功能受損，幾個代表性數(shù)據(jù)如左心室舒張末期厚度(LVPWd)增加，縮短分數(shù) (FS)降低，左心室質(zhì)量(LVM)增加。在隨后經(jīng)過不同因素處理后3w再進行檢測發(fā)現(xiàn)，給生理鹽水組小鼠心肌肥厚程度進一步加重(見LVPWd及LVM值)，心臟收縮功能進一步受損 (見FS值)，而經(jīng)Ad-anti-27b或Antagomir_27b治療后可有效地降低LVPWd和LVM，而FS 值的降低也得到了有效地緩解。其他的測量指標見表2。表2小鼠治療后心臟超聲檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.特異性抑制miR-27b表達的化合物在制備治療心臟疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述心臟疾病為心肌肥厚、心肌纖維化及其導(dǎo)致的心功能異常。
3.一種治療心臟疾病的藥物，其包括特異性抑制miR-27b表達的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于，所述化合物為小分子干擾核糖核酸、小分子干擾核糖核酸化學(xué)修飾物或在體內(nèi)產(chǎn)生小分子干擾核糖核酸的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于，所述小分子干擾核糖核酸為siRNA或 shRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列為 5’ -GCAGAACUUAGCCACU⑶GAA-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于，所述載體為含有以 5’ -GCAGAACTTAGCCACTGTGAA-3’為外源基因的表達盒的病毒載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物，其特征在于，所述病毒載體為腺病毒載體。
9.線性雙鏈DNA分子，其是線性化的權(quán)利要求7或8所述的抑制miR-27b表達的病毒載體。
10.抑制miR-27b表達的病毒，其基因組DNA為權(quán)利要求9所述的線性雙鏈DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性抑制miR-27b表達的化合物及含有該化合物的藥物，所述化合物在體內(nèi)生成的功能性分子的核苷酸序列為5’-GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3’。在體內(nèi)抑制miR-27b的表達能緩解由壓力性負荷引起的心肌肥厚和心臟功能受損。本發(fā)明通過心肌細胞實驗確定miR-27b在心肌肥厚中的功能，通過包裝特異性抑制miR-27b表達的腺病毒及合成針對miR-27b的抑制劑，對TAC手術(shù)建立的壓力性負荷引起心肌肥厚的小鼠模型進行治療，發(fā)現(xiàn)分別利用以上兩種抑制劑對TAC術(shù)后小鼠進行處理后，能有效地緩解TAC手術(shù)引起的心肌肥厚和纖維化，心室壁厚度明顯變薄，心臟收縮功能也得到了明顯的緩解。
文檔編號A61K31/713GK102205124SQ20111008315
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者侯寧, 孫強, 張彥, 楊曉, 王劍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所