專利名稱：包含皂礬的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)造血的藥物組合物以及制備該藥物組合物的方法。本發(fā)明還 涉及該藥物組合物在制備用于治療造血功能受損狀態(tài)的藥劑中的用途。
背景技術(shù)：
造血是人體生命活動的重要部分。成年動物的造血組織主要位于骨髓中。在生 理?xiàng)l件下，造血過程是造血干細(xì)胞(HSC)經(jīng)增殖、分化、直至形成各種成熟血細(xì)胞的動態(tài)過 程。臨床上多種常見的血液系統(tǒng)疾病，例如再生障礙性貧血、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常 綜合癥等，以及放療和化療引起的骨髓損傷都會導(dǎo)致骨髓造血功能受到抑制或衰竭，給機(jī) 體健康帶來嚴(yán)重危害。造血干細(xì)胞移植(HSCT)能夠促進(jìn)造血重建，在一定程度上恢復(fù)骨髓的造血功能， 已經(jīng)成為諸如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、再生障礙型貧血及一些遺傳性貧血等血液系統(tǒng)疾病 的重要治療手段。近年來，HSCT還被逐漸用于乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌等癌癥放療或 化療后的支持治療。已知其他一些電離輻射損傷，比如急性放射病造成的骨髓抑制也可通 過造血干細(xì)胞移植來治療。本發(fā)明人先前的研究表明給患急性放射病的動物移植轉(zhuǎn)染了細(xì) 胞因子基因的造血干細(xì)胞能有效地促進(jìn)骨髓造血重建[張勇等人，“中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜 志”第觀卷，第14-17頁]。但是，由于細(xì)胞擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染效率、體內(nèi)移植活力等問題的影響，單純的造血干細(xì)胞 移植對骨髓造血障礙的治療效果并不令人滿意。中藥制劑由于其較高的安全性，也被用于治療一些血液系統(tǒng)疾病。其中使用較多 的中藥成分為皂礬。皂礬的主要成分是硫酸亞鐵，還含有銅、砷、鈷等刺激骨髓造血的微量 元素。以皂礬為主藥的皂礬復(fù)方丸常用于輔助治療某些造血障礙型疾病，對輻射損傷動物 的造血功能也有一定的改善作用[肖揚(yáng)等人，“中藥新藥與臨床藥理”，第15卷，第387-389 頁]，但存在緩解慢、起效慢、治愈率低的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種藥物組合物，該組合物包含造血干細(xì)胞和皂礬以及藥 學(xué)上可接受的介質(zhì)，具有顯著促進(jìn)造血重建、恢復(fù)骨髓造血功能的作用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種藥物組合物的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供一種藥物組合物在制備治療造血功能受損狀態(tài)的藥 劑中的用途。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞為⑶34+造血干細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí) 施方案中，該⑶；34+干細(xì)胞為⑶34+臍帶血干細(xì)胞。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞可以是導(dǎo)入了表達(dá)載體的造血干細(xì) 胞，其中所述表達(dá)載體攜帶至少一種細(xì)胞因子基因。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體攜帶的細(xì)胞因子選自Flt3配 體(Flt3 ligand, FL)、白介素_3(IL_3)或其組合。更優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為 pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL 或其組合或 pIRES2_EGFP-FL-IL_3。最優(yōu)選地，所述載 體為 PIRES2-EGFP-FL-IL-3。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，藥物組合物中的藥學(xué)上可接受的介質(zhì)選自緩沖液、 生理鹽水、細(xì)胞培養(yǎng)基、平衡鹽溶液或其組合。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物的制備方法包括分離純化造血干 細(xì)胞并將其重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將上述細(xì) 胞重懸液與皂礬溶液混合。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物的制備方法包括分離純化造 血干細(xì)胞；將攜帶細(xì)胞因子的表達(dá)載體導(dǎo)入所述干細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞；將所述轉(zhuǎn)染 陽性細(xì)胞重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；然后將上述 細(xì)胞重懸液與皂礬溶液混合。在本發(fā)明提供的藥物組合物中，造血干細(xì)胞和皂礬具有協(xié)同促進(jìn)造血的作用，使 該藥物組合物在造血重建中具有起效快、有效率高、治愈率高的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述藥物組合物與單純的造血干細(xì)胞移植或單獨(dú)給予 皂礬相比，顯著提高了個體的生存率及外周血細(xì)胞的數(shù)量，顯示了本發(fā)明的組合物在治 療造血功能受損狀態(tài)中的優(yōu)勢。尤其是，本發(fā)明的PIRES2-EGFP-FL-IL-3比單獨(dú)使用 PIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2_EGFP_FL或其組合顯示出更好的效果。附圖簡要說明

圖1顯示IL-3的PCR產(chǎn)物電泳圖。第1泳道為分子量標(biāo)志物，第2、3泳道為IL_3 的PCR產(chǎn)物。圖2顯示重組體pIRES2-EGFP-IL-3的酶切結(jié)果。第1泳道為分子量標(biāo)志物；第 2泳道為未經(jīng)酶切的重組體pIRES2-EGFP-IL-3 ；第3泳道是經(jīng)HindIII單酶切的重組體 PIRES2-EGFP-IL-3 ；第 4 泳道是經(jīng) Bglll+Xmal 雙酶切的重組體 pIRES2-EGFP_IL_3。 圖3顯示重組體pIRES2-EGFP-FL的酶切結(jié)果。第1泳道為分子量標(biāo)志物 (DL2000)；第 2 泳道為經(jīng) SalI 和 BglII 雙酶切的 pUMVC3_hFL(3. 9kb+0. 8kb)；第 3 泳道 是未經(jīng)酶切的重組體pIRES2-EGFP-FL(6. Okb)；第4泳道是經(jīng)Nhel+Xhol雙酶切的重組體 pIRES2-EGFP-FL(5. 25kb+0. 75kb)。圖4顯示重組體pIRES2-EGFP-FL-IL-3的酶切結(jié)果。第1泳道為分子量 標(biāo)志物(DL2000)；第2泳道為重組體pIRES2-EGFP-IL-3 (7. 5kb)；第3泳道是重組 體pIRES2-EGFP-FL(6. Okb)；第4泳道是IL-3片段(2. 5kb)；第5泳道是重組體 PIRES2-EGFP-FL-IL-3 (8. 2kb)；第 6 泳道是經(jīng) Xmall+Xhol 雙酶切的 pIRES2_EGFP-FL-IL_3 (6. Okb+2. 2kb)；第 7 泳道是經(jīng) NheI+KpnI 雙酶切的 pIRES2_EGFP-FL-IL_3 (4. 7kb+3. 5kb)。圖5通過半定量RT-PCR分別檢測IL-3、FL在導(dǎo)入了 pIRES2-EGFP-IL_3、 PIRES2-EGFP-FL載體的⑶34+細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。A，第1泳道為分子量標(biāo)志物，第2泳道為未轉(zhuǎn) 染細(xì)胞，第3泳道是用PBS代替模板得到的PCR產(chǎn)物，第4、5泳道是轉(zhuǎn)染了 IL-3的⑶34+細(xì)胞；B，第1泳道為分子量標(biāo)志物，第2泳道為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，第3-5泳道是轉(zhuǎn)染了 FL的⑶34+ 細(xì)胞。圖 6 顯示在導(dǎo)入了 pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL 或 pIRES2_EGFP-FL-IL_3 載體的CD34+細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)L及IL-3的蛋白表達(dá)。A，在導(dǎo)入pIRES2_EGFP-IL_3和 PIRES2-EGFP-FL兩種載體的⑶34+細(xì)胞中，IL-3的蛋白表達(dá)，第1泳道為對照，第2泳 道為雙載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；B，在導(dǎo)入pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2_EGFP_FL兩種載體的 ⑶34+細(xì)胞中，F(xiàn)L的蛋白表達(dá)，第1泳道為對照，第2泳道為雙載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；C，在導(dǎo)入 PIRES2-EGFP-FL-IL-3載體的CD34+細(xì)胞中，IL-3的蛋白表達(dá)，第1泳道為對照，第2泳道 為共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；D，在導(dǎo)入pIRES2-EGFP-FL-IL-3載體的CD34+細(xì)胞中，F(xiàn)L的蛋白 表達(dá)，第1泳道為對照，第2泳道為共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一方面提供了促進(jìn)造血的藥物組合物，該藥物組合物包含造血干細(xì)胞和 皂礬以及藥學(xué)上可接受的介質(zhì)。本發(fā)明所述的“造血干細(xì)胞”可以是骨髓造血干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞、臍帶血干細(xì) 胞，優(yōu)選臍帶血干細(xì)胞。臍帶血干細(xì)胞免疫細(xì)胞的抗原性較弱，與移植有關(guān)的移植物抗宿主 病的發(fā)生相對骨髓和外周血少而輕，且采集保存容易，對供者無任何傷害。因此，臍帶血被 認(rèn)為是理想的造血干細(xì)胞來源。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述造血干細(xì)胞為⑶34+造血干細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，該⑶34+干細(xì)胞為⑶34+臍帶血干細(xì)胞?！癈D34”是指高度糖基化的I型跨膜蛋白，其選擇性分布在造血干細(xì)胞表面，隨著 造血細(xì)胞的不斷分化成熟，其表達(dá)也逐漸減少直至消失。研究者通常把CD34+細(xì)胞作為進(jìn) 行HSC生物學(xué)特性研究與臨床應(yīng)用的源細(xì)胞。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，造血干細(xì)胞可以是導(dǎo)入了表達(dá)載體的造血干細(xì)胞，其 中所述表達(dá)攜帶至少一種細(xì)胞因子基因。本發(fā)明所述的“表達(dá)載體”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列允 許特定的核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特異性核酸元件。本發(fā)明的表達(dá)載體可以是諸如 PIRES2-EGFP、pcDNA3. 1、pCI-neo、pDC516、ρ VAC, pcDNA4. 0、pGEM-T、pDC315 的質(zhì)粒載體， 或者是諸如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒(sFv)載體的病毒載體。 病毒載體因其易整合到靶細(xì)胞染色體內(nèi)，導(dǎo)致安全性差。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案 中，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒載體，優(yōu)選PIRES2-EGFP載體，因?yàn)楹笳甙僭鰪?qiáng)型綠色熒光 蛋白(EGFP)，易于與目的基因融合以及便于檢測；②含有SV40 ori復(fù)制元件，有可能隨宿 主細(xì)胞分裂，跟隨胞漿遺傳給子代細(xì)胞，可以在一定程度上保證目的基因穩(wěn)定傳遞；③含有 IRES,能夠增強(qiáng)目的基因翻譯水平的表達(dá)。本發(fā)明所述的“細(xì)胞因子”是指對造血干細(xì)胞的生存、調(diào)亡、增殖和分化起著重要 調(diào)控作用的蛋白質(zhì)家族。細(xì)胞因子通常是通過在其靶細(xì)胞表面結(jié)合特異的受體以激活信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。所述細(xì)胞因子的實(shí)例包括，但不限于，諸如FL、IL-I、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、 粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)和干細(xì)胞因子(SCF)等作用于GO期 的細(xì)胞因子，例如IL-3、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4等作用于分化狀態(tài)的HSC的細(xì)胞因子，以及例如促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、巨噬細(xì)胞集落刺激 因子(M-CSF)和IL-5等作用于分化后期的細(xì)胞因子。其中FL是新近發(fā)現(xiàn)的，能夠刺激早 期造血的細(xì)胞因子，其能夠調(diào)節(jié)最原始的造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化，可與多種細(xì)胞因 子協(xié)同作用，提高造血功能。IL-3又稱多系集落刺激因子，它主要由激活的T淋巴細(xì)胞所產(chǎn) 生，對造血細(xì)胞具有廣譜的刺激分裂和分化的作用。IL-3在FL或SCF存在下，能夠有效擴(kuò) 增有核細(xì)胞總數(shù)，是增強(qiáng)造血及集落形成細(xì)胞的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體攜帶的細(xì)胞因子選自IL-3、FL或其組
I=I O本發(fā)明所述的“藥學(xué)上可接收的介質(zhì)”是指不干擾活性成分的生物活性有效性的 載體。本發(fā)明的介質(zhì)包括但不限于細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖液、生理鹽水和平衡鹽溶液。細(xì)胞培養(yǎng) 基的實(shí)例包括BME、MEM、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199等。緩沖液的實(shí)例包括磷酸 鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽以及碳酸鹽。所述介質(zhì)還可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形 劑、佐劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等的一種或多種成分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述介質(zhì)為等滲緩沖液，優(yōu)選為等滲磷酸鹽緩沖液 (PBS)。本發(fā)明的另一方面提供了促造血的藥物組合物的制備方法，它包括分離純化造 血干細(xì)胞并將其重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將上 述細(xì)胞重懸液與皂礬溶液混合。本發(fā)明的另一方面提供了促造血的藥物組合物的制備方法，其包括分離純化造 血干細(xì)胞；將攜帶細(xì)胞因子的表達(dá)載體導(dǎo)入所述干細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞；將所述轉(zhuǎn)染 陽性細(xì)胞重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；將上述細(xì)胞 重懸液與皂礬溶液混合。在本發(fā)明中，重懸細(xì)胞的介質(zhì)與溶解皂礬的介質(zhì)可以相同或不同。在本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施方案中，重懸細(xì)胞的介質(zhì)與溶解皂礬的介質(zhì)相同，且為等滲磷酸鹽緩沖液。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，造血干細(xì)胞的重懸濃度為5X104/ml至lX107ml，優(yōu)選 為 5 X 105/ml 至 5 X 106/ml，最優(yōu)選為 2. 5 X 106/ml。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，皂礬的溶解濃度為0. 5mg/ml至50mg/ml，優(yōu)選為ang/ml 至10mg/ml，最優(yōu)選為5mg/ml。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，細(xì)胞重懸液與皂礬溶液的混合體積比為1 2至3 1， 優(yōu)選體積比為1 1至2 1，最優(yōu)選為2 1。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體，優(yōu)選是質(zhì)粒 載體，且最優(yōu)選為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體。所述“轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞”是指成功導(dǎo)入了表達(dá)載體 的細(xì)胞。所述表達(dá)載體攜帶促造血細(xì)胞因子的基因，在干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)細(xì)胞因子。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將攜帶細(xì)胞因子基因的表達(dá)載體導(dǎo)入分離純化的干 細(xì)胞，優(yōu)選⑶；34+干細(xì)胞，最優(yōu)選⑶34+臍帶血干細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供了促造血的藥物組合物在制備治療造血功能受損狀態(tài)的 藥劑中的用途。本發(fā)明所述的造血干細(xì)胞與皂礬的“協(xié)同”作用是指包含造血干細(xì)胞和皂礬的藥 物組合物對造血重建的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于單純的造血干細(xì)胞移植或單獨(dú)的皂礬的作用。
本發(fā)明所述的“造血功能受損狀態(tài)”是指骨髓造血功能受到抑制，導(dǎo)致一種或多種 血細(xì)胞的生成數(shù)量降低到危害機(jī)體健康的狀態(tài)。本發(fā)明的造血功能受損狀態(tài)包括但不限 于再生障礙性貧血、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、放 療和化療引起的骨髓損傷以及諸如急性放射病的其他電離輻射損傷導(dǎo)致的骨髓造血障礙。 “急性放射病”是指全身短時間內(nèi)受到1戈瑞(Gy)以上照射后發(fā)生的全身性疾病，主要表現(xiàn) 為造血功能障礙。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，在幾分鐘內(nèi)給予嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠 2. 0-8. OGy的照射，復(fù)制急性輻射損傷的動物模型；骨髓病理結(jié)果顯示，骨髓造血功能衰竭 程度與輻射劑量呈正相關(guān)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予SCID小鼠8. OGy (劑量率為 1. 07Gy/min)的照射，以便更好地觀察本發(fā)明藥物組合物的效果。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將藥物組合物給予個體的方法可以是靜脈注射或靜脈點(diǎn) 滴，優(yōu)選靜脈注射。本發(fā)明所述的“個體”，是指哺乳動物，包括但不限于靈長類動物、牛、馬、豬、綿羊、 山羊、狗、貓以及諸如大鼠和小鼠的嚙齒類動物。上述公開內(nèi)容總體上描述了本發(fā)明，通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步示例本發(fā)明。描述 這些實(shí)施例僅為說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。盡管本文中使用了特殊的術(shù)語和 值，這些術(shù)語和值同樣被理解為示例性的，并不限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1分離與純化臍帶血干細(xì)胞，獲?、?4+細(xì)胞無菌采取正常足月順產(chǎn)男性新生兒臍帶血(由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院提 供)，用肝素抗凝，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077g/ml)分離單個核細(xì)胞，以含有 10%胎牛血清的IMDM洗滌2次，重懸于300 μ 1含有0. 5% BSA和2mmol/L EDTA的PBS溶 液中，用免疫磁珠分選系統(tǒng)(mini-MACS)從單個核細(xì)胞中分離出CD34+細(xì)胞。具體方法如 下在上述細(xì)胞重懸液中分別加入100 μ 1封閉液(3%羊血清)和抗⑶34單抗，混勻，4°C放 置15min。用IOml上述PBS緩沖液離心洗滌后，加入100 μ 1羊抗鼠IgG免疫磁珠，4°C放置 15min。將細(xì)胞用上述方法洗滌后重懸于Iml PBS緩沖液中，滴加到置于磁場的分離柱中， 使細(xì)胞懸液自然流出。用所述緩沖液洗柱4次，每次0.5ml。將分離柱移出磁場，加入Iml 緩沖液，使用分離柱針芯將細(xì)胞推出。所得細(xì)胞主要為CD34+細(xì)胞。分別取篩選前及篩選后的IXlO5個單個核細(xì)胞與藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗⑶34單 抗于4°C下孵育30min。將細(xì)胞用緩沖液洗滌后，用300 μ 1的2%多聚甲醛固定30min。棄 去多聚甲醛，將細(xì)胞用緩沖液洗滌后，再用常規(guī)免疫組化的方法測定CD34+細(xì)胞百分率。結(jié)果篩選前的單個核細(xì)胞中，⑶34+細(xì)胞僅為0.62% -9. 05%，平均為3. % 士0.46% (χ士sx)。篩選后的單個核細(xì)胞中，⑶34+細(xì)胞為46.42 %-95.61%，平均為 79. 35% 士 5. M % (χ士 sx)。篩選純化前后⑶34+細(xì)胞濃度平均增加了 24. 49倍。實(shí)施例2IL-3、FL及共表達(dá)FL和IL-3雙順反子真核載體的構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP購自Clontech公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5 α菌株由本 實(shí)驗(yàn)室保存。含全長鼠IL-3 cDNA(2. 5kb)質(zhì)粒MXIL_3neo由瑞士巴塞爾大學(xué)Moroni教授 惠贈；含全長人FL cDNA(0. 8kb)質(zhì)粒pUMVC3_hFL購自美國Michigan大學(xué)基因治療中心。
1. pIRES2-EGFP-IL-3 的構(gòu)建1) IL-3目的片段的擴(kuò)增利用引物設(shè)計(jì)軟件ft~imer5. 0設(shè)計(jì)引物如下上游:5-GGAATTCCCTGTGGCTTCTTCA-3(SEQ ID NO :1)(含 EcoRI 位點(diǎn))；下游5-TCCCCGCGGGGAAAACCCATTTGTTC-3(SEQ ID NO :2)(含 SacII 位點(diǎn))。以MXIL-3ne0質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C變性5min (1個循環(huán))； 94°C變性30sec，56°C退火lmin，72°C延伸:3min(30個循環(huán))；最后72°C延伸lOmin。結(jié)果 如圖1所示，擴(kuò)增得到2501bp的IL-3片段(圖1)。2)將IL-3片段定向克隆至pIRES2-EGFP載體分別利用EcoRUacII雙酶切PCR 產(chǎn)物IL-3片段和pIRES2-EGFP，回收后連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，從卡那抗性平板上 挑取數(shù)個單菌落提取質(zhì)粒DNA。分別用HindIII單酶切和Bglll+Xmal雙酶切重組體進(jìn)行鑒 定，并進(jìn)行DNA測序證實(shí)。陽性重組體命名為pIRES2-EGFP-IL-3。重組體pIRES2-EGFP-IL-3酶切結(jié)果如圖2所示，HindIII單酶切在pIRES2_EGFP 的623、892bp處和IL-3片段的801bp處有HindIII位點(diǎn)，因此陽性重組體經(jīng)該酶切后出 現(xiàn) 0. 8kb、l. 7kb 和 5. Okb 的三個片段。Bglll+Xmal 雙酶切在 pIRES2_EGFP 的 621、657bp 處分別有Bglll、Xmal位點(diǎn)，因此陽性重組體經(jīng)該雙酶切后出現(xiàn)2. 2kb和5. 3kb 二個片段。 DNA序列測定表明IL-3基因的核苷酸序列與GenebankK03233的完全一致。2. pIRES2-EGFP-FL真核表達(dá)載體構(gòu)建1)FL目的片段的擴(kuò)增利用ft~imer5. O設(shè)計(jì)引物如下上游5-ATTGTGGCTTACCCTTGGTCTTCA-3(SEQID NO 3)；下游5-GTTGCGGGGAACTCCCCATTTGTTC-3(SEQID NO 4)。以 PUMVC3_hFL 質(zhì)粒為模 板進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為94°C變性5min (1個循環(huán))；94°C變性30sec, 56°C退火lmin, 72°C 延伸3min(30個循環(huán))；最后72°C延伸IOmin02) FL雙順反子真核表達(dá)載體構(gòu)建&ill和BglII雙酶切pUMVC3_hFL，得到全長人 FL序列(0. 81Λ)，兩端抹平后克隆至pIRES2-EGFP載體的BglII位點(diǎn)。NheI和BioI酶切鑒 定后，將正向連接的重組體命名為PIRES2-EGFP-FL。酶切結(jié)果如圖3所示，pUMVC3_hFL經(jīng)Mll+Bglll酶切后得到3. 9kb+0. 8kb片段， 重組體pIRES2-EGFP-FL經(jīng)Nhel+Xhol酶切后得到5. 25kb+0. 75kb片段。DNA序列測定表明 FL基因的核苷酸序列與GenebankK03233的完全一致。3. pIRES2-EGFP-FL-IL-3 共表達(dá)載體構(gòu)建利用EcoRI和SacII位點(diǎn)雙酶切已構(gòu)建成功的pIRES2-EGFP-IL_3，回收IL-3目的 片段后克隆至PIRES2-EGFP-FL的對應(yīng)位點(diǎn)。分別使用XhoI和XmalI雙酶切、NheI和KpnI 雙酶切鑒定，將陽性重組體命名為PIRES2-EGFP-FL-IL-3。酶切結(jié)果如圖4所示，經(jīng)Xmall+Xhol酶切后，該重組體出現(xiàn)6. Okb和2. 2kb兩個 片段；經(jīng)Nhel+Kpnl酶切后，出現(xiàn)4. 7kb和3. 5kb兩個片段。DNA測序表明結(jié)果正確，無移 碼等錯誤。實(shí)施例3基因轉(zhuǎn)染取處于指數(shù)生長期的經(jīng)分離純化的臍帶血⑶34+細(xì)胞，當(dāng)其融合至60-80%時進(jìn)行 轉(zhuǎn)染。將 5 μ 1 質(zhì)粒載體 DNA (53 μ g/ml)加入 20 μ 1 轉(zhuǎn)染緩沖液(20mmol/L HEPES, 150mmol/L NaCl,pH 7.4)中混勻，得到A液；將15 μ 1 DOTAP脂質(zhì)體加入35 μ 1上述轉(zhuǎn)染緩沖液中混 勻，得到B液；室溫下將A液和B液輕輕混均，1，200rpm離心30sec，靜置15min，將之緩慢配 入含10%胎牛血清的IMDM中。將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸棄，用0. 01mol/L PBS洗1次細(xì)胞，然 后將含有轉(zhuǎn)染體系的培養(yǎng)液加入培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育Mh，之后換液。 將G418按800 μ g/ml濃度加入培養(yǎng)瓶中約1月，半月?lián)Q1次液，維持G418濃度不變。將篩 選后的細(xì)胞擴(kuò)增備用。實(shí)施例4轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的鑒定1.檢測EGFP的綠色熒光 將普通蓋玻片泡酸、洗凈、烘干后，放入直徑6cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)6tlCo γ -射線常規(guī)照 射消毒。用0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染了細(xì)胞因子基因的細(xì)胞，然后將細(xì)胞以約lX105/ml的濃 度，接種于上述照射消毒的培養(yǎng)皿中。24h后棄去培養(yǎng)液，用0. 01mol/L的PBS洗滌細(xì)胞2 次。然后取出蓋玻片，置于載玻片上，在488nm的藍(lán)色激光激發(fā)下，用熒光顯微鏡觀察EGFP 的綠色熒光。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞的胞體均發(fā)出綠色熒光，表明質(zhì)粒成功導(dǎo)入 ⑶；34+細(xì)胞中。2.半定量RT-PCR檢測FL及IL-3的表達(dá)①利用hvitrogen公司的一步法總RNA提取試劑盒，提取實(shí)施例3中的經(jīng)轉(zhuǎn)染篩 選并擴(kuò)增的細(xì)胞的總RNA。②引物的設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用ft~imer5. 0軟件設(shè)計(jì)引物如下，IL-3 上游(Pl) :5-TGTTTCCACTCCGTCCAT-3 (SEQ ID NO 5)；下游(P2):5-CCAAAGCAGGGCTCTTAC-3 (SEQ ID NO :6)。(Tm53 "C ；30 個循環(huán)； 585bp)；FL :P1 :5-CTGGAGCCCAACAACCTATC-3(SEQ ID NO :7)；P2 :5-TCTGGACGAAGCGAAGACA-3 (SEQ ID NO :8)。(Tm 57°C ；27 個循環(huán)；353bp)。③RT-PCR 采用兩步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄42°C 30分鐘，99°C 5分鐘，5 °C 5分鐘，1個循環(huán)。PCR :94°C預(yù)變性4分鐘；然后94°C變性30秒，56°C退火45秒，72°C延伸 1分鐘，共40個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘補(bǔ)齊末端。結(jié)果如圖5所示，以正常未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照，轉(zhuǎn)染后CD34+細(xì)胞的IL_3(圖5A)和 FL表達(dá)(圖5B)均明顯上調(diào)。3. Western blot檢測FL及IL-3的蛋白表達(dá)情況提取實(shí)施例3中經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選并擴(kuò)增的細(xì)胞的總蛋白，用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量。 取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜用TBST (TBS，0. 05 % Tween20)稀釋的封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉1小時后，用1 800的IL-3—抗(Sigma) 稀釋液(稀釋于TBST中)或1 500的FL —抗(Sigma)稀釋液4°C孵育過夜。一抗孵育 結(jié)束后，用TBST洗膜3次，每次10分鐘。再分別用1 300的對應(yīng)的二抗(兔抗人)稀釋 液(稀釋于TBST中)于37C孵育lh。然后用TBST洗膜3次，每次10分鐘。接著將膜在 TBST稀釋的1 500的辣根酶鏈親合素三抗稀釋液中于37°C孵育lh。最后用DAB顯色，將 顯色清晰條帶的PVDF膜置于Gel Doc2000凝膠掃描系統(tǒng)上分析，以樣本掃描值/對照掃描值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖6所示，同時導(dǎo)入pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2_EGFP_FL兩種載體的 CD34+細(xì)胞中，IL-3蛋白的表達(dá)高于對照組(圖6A)，F(xiàn)L蛋白的表達(dá)高于對照組(圖6B)； 導(dǎo)入pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體的CD34+細(xì)胞中，表達(dá)的IL-3和FL蛋白也均高于 對照組(圖6C，6D)。實(shí)施例5包含⑶34+臍帶血干細(xì)胞的藥物組合物的制備皂礬購自陜西郝其軍制藥有限公司；CD34+臍帶血干細(xì)胞由實(shí)施例1獲得。制備步 驟如下(1)將來自實(shí)施例1的5 X IO5個⑶34+臍帶血干細(xì)胞重懸在200 μ 1等滲磷酸鹽 緩沖液(0. 03mol/L, pH 7. 4)中，得到濃度為2. 5X 106/ml的干細(xì)胞懸液。(2)將500 μ g皂礬溶于100 μ 1上述磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的皂礬 溶液。(3)將上述干細(xì)胞懸液與皂礬溶液混合，即得到藥物組合物注射液。實(shí)施例6包含導(dǎo)入了表達(dá)載體的⑶34+臍帶血干細(xì)胞的藥物組合物的制備皂礬購自陜西郝其軍制藥有限公司；導(dǎo)入了表達(dá)載體的⑶34+臍帶血干細(xì)胞來自 實(shí)施例3。1.包含同時導(dǎo)入了 pIRES2-EGFP-IL-3 和 pIRES2_EGFP_FL 兩種載體的 CDiM+臍帶 血干細(xì)胞的藥物組合物的制備如實(shí)施例5 的制備方法，將5X105個導(dǎo)入了 pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL 表達(dá)載體的⑶；34+臍帶血干細(xì)胞重懸在200 μ 1等滲磷酸鹽緩沖液(0. 03mol/L,pH 7. 4)中， 得到濃度為2. 5 XlOVml的轉(zhuǎn)染了 IL-3基因的細(xì)胞懸液；將500 μ g皂礬溶于100 μ 1上述 磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的皂礬溶液；將上述兩種液體混合，得到300 μ 1藥物 組合物注射液。2.包含導(dǎo)入了 pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表達(dá)載體的CDM+臍帶血干細(xì)胞的藥物組 合物的制備與上面的制備方法基本相同，不同之處在于⑶34+臍帶血干細(xì)胞導(dǎo)入的是 PIRES2-EGFP-FL-IL-3 共表達(dá)載體。實(shí)施例7觀測來自實(shí)施例5的本發(fā)明的藥物組合物的療效實(shí)驗(yàn)對象48只4-6周齡，體重18_20g的SCID雌性小鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)動物所 提供)。實(shí)驗(yàn)方法小鼠飼養(yǎng)于無菌層流柜中。飼料經(jīng)6tlCo照射，飲用水及墊料均經(jīng)高壓消 毒無菌處理，給藥前3天開始飲用經(jīng)高壓消毒酸化后加入二性霉素B (80mg/L)和環(huán)丙沙星 (80mg/L)的水。對小鼠的所有操作均在無菌層流條件下進(jìn)行。小鼠置于無菌透氣的塑料盒 中，外罩無菌消毒巾，用6°Co γ射線一次全身性照射2. 0-8. OGy (劑量率為1. 07Gy/min)，復(fù) 制輻射損傷的動物模型。在輻射后4小時內(nèi)通過尾靜脈注射給藥，此后維持抗生素飼服。實(shí)驗(yàn)分組經(jīng)過照射的48只小鼠隨機(jī)分為空白組、⑶34+臍帶血干細(xì)胞組(⑶34組)、皂礬組、藥物組合物組，每組12只動物。其中⑶34組的每只小鼠給予300 μ 1細(xì)胞懸 液，含有5 X IO5個來自實(shí)施1的⑶34+臍帶血干細(xì)胞；皂礬組的每只小鼠給予300 μ 1皂礬 溶液(含皂礬500 μ g)；藥物組合物組的每只小鼠給予300 μ 1來自實(shí)施例5的藥物組合物， 即包含皂礬和⑶34+臍帶血干細(xì)胞的組合物。觀測指標(biāo)觀察小鼠生存情況；給藥后第2周、4周和6周尾靜脈取血進(jìn)行血常規(guī) 檢測。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以無表示，SPSS 10. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，小鼠存活率 用X 2檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組小鼠存活率如表1所示，空白組小鼠在2周內(nèi)因造血功能衰竭而全部死亡； ⑶34+組和皂礬組的存活率隨時間延長而降低；藥物組合物組的存活率顯著高于同期各組。外周血常規(guī)檢測結(jié)果如表2所示，空白組因全部死亡沒有相關(guān)數(shù)據(jù)；第2周和第4 周時，藥物組合物組的白細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞數(shù)量及血小板數(shù)量顯著高于⑶34組和皂礬組(ρ < 0. 05)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第6周時除空白組外的其余組的各指標(biāo)之間無明顯區(qū)別， 這可能是因?yàn)槊拷M能夠存活到6周的小鼠的造血恢復(fù)程度都較理想。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的藥物組合物與⑶34+臍帶血干細(xì)胞和皂礬相比，對輻射損 傷導(dǎo)致的造血功能受損狀態(tài)具有明顯的治療作用。表1各組小鼠存活數(shù)量及存活率
權(quán)利要求
1.制備包含造血干細(xì)胞和皂礬以及藥學(xué)上可接受的介質(zhì)的藥物組合物的方法，其包括分離純化造血干細(xì)胞并將其重懸在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中； 將皂礬溶于藥學(xué)上可接受的介質(zhì)中；以及 將上述細(xì)胞重懸液與皂礬溶液混合。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括將攜帶細(xì)胞因子基因的表達(dá)載體導(dǎo)入所述造 血干細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述造血干細(xì)胞為⑶34+造血干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述藥學(xué)上可接受的介質(zhì)選自緩沖液、生理鹽 水、細(xì)胞培養(yǎng)基、平衡鹽或其組合。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自Flt3配體、白介素-3或其組合。
6.如權(quán)利要求2或5所述的方法，其中所述表達(dá)載體為pIRES2-EGFP-IL-3、 PIRES2-EGFP-FL 或其組合。
7.如權(quán)利要求2或5所述的方法，其中所述表達(dá)載體為同時表達(dá)Flt3配體、白介素-3 的 pIRES2-EGFP-FL-IL-3。
8.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中造血干細(xì)胞的重懸濃度為5X104/ml至 1 X 107/ml，優(yōu)選為 5 X 105/ml 至 5 X 106/ml，最優(yōu)選為 2. 5 X 106/ml。
9.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中皂礬的溶解濃度為0.5mg/ml至50mg/ ml，優(yōu)選為2mg/ml至10mg/ml，最優(yōu)選為5mg/ml。
10.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞重懸液與皂礬溶液的混合體積比 為1 2至3 1，優(yōu)選體積比為1 1至2 1，最優(yōu)選為2 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)造血的藥物組合物，其包含造血干細(xì)胞和皂礬，其中所述造血干細(xì)胞優(yōu)選為導(dǎo)入了攜帶細(xì)胞因子基因的表達(dá)載體的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及該藥物組合物的制備方法以及在制備用于治療造血功能受損狀態(tài)的藥劑中的用途，其中造血干細(xì)胞和皂礬具有協(xié)同促進(jìn)造血的作用。
文檔編號A61K35/14GK102138935SQ20111008316
公開日2011年8月3日 申請日期2009年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日
發(fā)明者張勇, 杜宏偉, 董世武, 郭朝華 申請人:重慶西南醫(yī)院