專利名稱：大戟屬植物具有抗hiv潛伏作用的有效部位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種活性中藥有效部位的發(fā)現(xiàn)及其制備方法，以及在抗HIV潛伏治療上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由HIV感染引起的一種嚴(yán)重危害人們生命健康的傳染性疾病。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)全球艾滋病患者已超過4000萬，每年新增患者500萬，而每年死亡約為300萬。目前，艾滋病臨床治療方法主要是高效抗逆?zhèn)麂洸《警煼?Highlyactiveantiretroviral therapy, HAART),該療法不僅有效控制HIV復(fù)制，并且能重建AIDS患者的免疫功能，為AIDS的治療打開了希望之門。 人們曾寄希望于憑借HAART完全清除體內(nèi)的HIV，從而達(dá)到徹底治愈AIDS的目的。但隨后的實(shí)踐證明，雖然HAART可以最大限度地抑制患者體內(nèi)病毒復(fù)制，使血漿病毒載量(virus load)降低至現(xiàn)有常規(guī)檢測方法測不出的水平，但感染者體內(nèi)仍有病毒持續(xù)存在，一旦停止藥物治療，病毒載量又會反彈到治療前水平(Ho，D.D. Toward HIV eradication orremission the tasks ahead. Science,1998. 280 1866-1867)。HIV難以在體內(nèi)被完全清除的一個(gè)重要原因是HIV-I能夠潛伏在靜息的記憶⑶4+T細(xì)胞中，該潛伏感染細(xì)胞是由一小部分HIV感染的活化⑶4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的，其整合的前病毒缺乏轉(zhuǎn)錄活性，因此不會被免疫系統(tǒng)和抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的藥物攻擊。盡管感染個(gè)體攜帶潛伏感染細(xì)胞數(shù)量較少，但衰減率是如此之慢，以至于欲在個(gè)體生存期內(nèi)僅靠HAART治療將其徹底清除是不可能的。因此，HIV潛伏感染的靜息CD4+T細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體內(nèi)病毒儲藏庫(reservoir)的主要部分，同時(shí)也是目前臨床治療不能徹底清除HIV的巨大障石尋(Finzi, D. et al. Latent infection of CD4+T cells provides a mechanismfor lifelongpersi stence of HIV-1, even in patients on effective combinationtherapy. Nature Med.1999，5，512-517)。一般認(rèn)為，HIV-I潛伏感染細(xì)胞形成的分子機(jī)制與整合位點(diǎn)處的染色質(zhì)狀態(tài)、抑制性核小體nuc-1的存在、以乙酰化為代表的表觀遺傳修飾、宿主轉(zhuǎn)錄因子如NF- K B以及病毒轉(zhuǎn)錄活化因子Tat等因素有關(guān)(Coiras, M. , M. R. etal. UnderstandingHIV-llatency provides clues for the eradication oflong-term reservoirs. Nat.Rev. Microbiol. 2009.，7 :798-812)。據(jù)此機(jī)制，研究者提出了清除潛伏病毒儲存庫的治療策略，即試圖通過藥物誘導(dǎo)HIV潛伏感染細(xì)胞的前病毒表達(dá)，使其潛伏病毒再次激活，同時(shí)結(jié)合高效抗逆?zhèn)麂洸《警煼霸谌嗣庖呦到y(tǒng)作用下，來殺死激活的潛伏感染的細(xì)胞，以此加速病毒儲藏庫的清除(Richman et al. The Challenge of Finding a Cure forHIVInfection, Science, 2009，1304，323)。盡管，該策略已在臨床上已有幾個(gè)治療方案，但其結(jié)果仍未盡人意，不是激活劑無效，就是雖有效但其毒副作用大。因而，研發(fā)安全有效的能消除病毒儲藏庫的試劑及相應(yīng)的治療方案已是當(dāng)務(wù)之急。
中藥作為我國所特有的醫(yī)藥資源，以其種類繁多、臨床應(yīng)用廣泛、作用溫和、副作用少等優(yōu)點(diǎn)而越來越受到現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)的關(guān)注。大戟科大戟屬植物在我國有廣泛的分布，其中大戟、甘遂、續(xù)隨子為常用中藥，有消腫散結(jié)的作用，現(xiàn)代藥理研究主要集中于抗腫瘤等方面。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的、有效誘導(dǎo)HIV潛伏感染細(xì)胞的前病毒表達(dá)的方法和藥物，從而用于抗HIV潛伏治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的、有效誘導(dǎo)HIV潛伏感染細(xì)胞的前病毒表達(dá)的方法和藥物，及其在抗HIV潛伏治療中的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種大戟屬植物、大戟屬植物的中藥材或大戟屬植 物提取物的用途，它們被(a)用于制備干預(yù)HIV病毒潛伏的組合物；(b)用于制備治療艾滋病的藥物；(C)用于制備與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用從而治療艾滋病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的干預(yù)HIV病毒潛伏包括誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)、和/或激活潛伏的HIV病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的治療艾滋病包括抗HIV潛伏治療。在另一優(yōu)選例中，所述的大戟屬植物提取物包括大戟屬植物的枝、葉、根、和/或莖的水溶性的和/或脂溶性的提取物。在另一優(yōu)選例中，所述的大戟屬植物提取物包括大戟屬植物的枝、葉、根、和/或莖的醇提取物。在另一優(yōu)選例中，所述的提取物含有選自下組的組分二萜、鞣質(zhì)、甾體。在另一優(yōu)選例中，所述的提取物是通過溶劑提取法、萃取法、和色譜法而獲得的并且含有二萜、鞣質(zhì)和甾體。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物還包括選自下組的額外組分抗逆?zhèn)麂洸《镜乃幬锘蛟鰪?qiáng)免疫力的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物或藥物包括口服制劑和非口服制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的制劑包括粉劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、酊劑、口服液、片劑或含片。在另一優(yōu)選例中,所述大戟屬植物包括大戟、甘遂、或續(xù)隨子。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種可用于治療艾滋病的有效部位，所述的有效部位具有以下特征(a)該有效部位是提取自大戟屬植物的枝、葉、根、和/或莖的水溶性的和/或脂溶性的提取物；或提取自大戟屬植物的枝、葉、根、和/或莖的醇提取物；(b)該有效部位含有選自下組的組分二萜、鞣質(zhì)、留體；和(c)該有效部位具有誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)、和/或激活潛伏的HIV病毒的功能。在另一優(yōu)選例中，該有效部位是通過溶劑提取法、萃取法、和色譜法而獲得的。在另一優(yōu)選例中，所述的有效部位是通過溶劑提取法、萃取法、和色譜法而獲得的并且含有二萜、鞣質(zhì)、和甾體。在另一優(yōu)選例中，所述的萃取法用二氯甲烷/乙酸乙酯進(jìn)行萃取。在另一優(yōu)選例中，所述的提取物具有圖I或圖2所示的圖譜。在本發(fā)明的第三方面，提供了 一種藥物組合物，它含有本發(fā)明第二方面中所述的有效部位和藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還包括選自下組的額外組分抗逆?zhèn)麂洸《镜乃幬?。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外非治療性誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)的方法,包括步驟在大戟屬植物提取物存在下,培養(yǎng)所述的HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中，使得潛伏的HIV前病毒表達(dá)，從而激活潛伏的HIV病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對被激活的HIV病毒進(jìn)行殺滅或抑制。在另一優(yōu)選例中，所述的大戟屬植物提取物的濃度為0. 01-100微克/ml，較佳地為 0. 1-10 微克/ml。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種預(yù)防或治療艾滋病的方法，包括步驟給需要的對象施用本發(fā)明第二方面中所述的有效部位或本發(fā)明第三方面中所述的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的對象是哺乳動物，包括人。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種激活潛伏的HIV病毒的方法，包括步驟將HIV病毒潛伏感染細(xì)胞與大戟屬植物提取物接觸，或者給需要的對象施用本發(fā)明第二方面中所述的有效部位或本發(fā)明第三方面中所述的藥物組合物，從而激活潛伏的HIV病毒。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備用于治療艾滋病的藥物組合物的方法，包括步驟將本發(fā)明第二方面中所述的有效部位與藥學(xué)上可接受的載體混合，從而形成藥物組合物。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中，大戟有效部位的LC-MS組分分析圖，結(jié)果表明主要成分為二萜、鞣質(zhì)、甾體等。其中包括色譜圖(上，A)、負(fù)離子流圖(中，B)和正離子流圖(下，C)。圖2顯示了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，甘遂有效部位的HPLC-ESI-MS分析。其中包括HPLC-UV圖譜(上)，檢測波長203nm?？傟栯x子流圖譜(下)，數(shù)字標(biāo)出保留時(shí)間。圖3顯示了甘遂有效部位對HIV潛伏誘導(dǎo)激活熒光顯微鏡圖片，其中a為熒光照片，b為同一視野白光照片。為了便于在打印文本上識別，熒光照片經(jīng)去色處理后，其熒光細(xì)胞為白色。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外發(fā)現(xiàn)大戟屬植物或大戟屬植物提取物具有抗HIV潛伏的作用。具體地，本發(fā)明人采用獨(dú)創(chuàng)的活性篩選方法發(fā)現(xiàn)具有抗艾滋病中藥大戟屬植物，并用溶劑提取法、溶劑萃取法、色譜法等工藝，結(jié)合活性篩選確定和制備有效部位，制成的大戟屬植物有效部位可作為抗艾滋病的活性成分。本發(fā)明的有效部位具有干預(yù)HIV潛伏的作用，與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用，可清除被激活的潛伏感染的細(xì)胞，以此加速潛伏病毒儲藏庫的清除，將為艾滋病的徹底治愈提供新的途徑。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。大戟屬植物 如本文所用，術(shù)語“大戟屬植物”指大戟科大戟屬的植物，為一年生或多年生草木，包括大卓戈(Euphorbia pekinensis Rupr.)、甘遂(E. kansui)、續(xù)隨子(E. Iathyris Linn.)、九牛造(E.hylonoma)等多種種類。大戟的其他名稱包括下馬仙、邛巨等。甘遂的其他名稱包括主田、重澤等。續(xù)隨子的其他名稱包括打鼓子、菩薩豆等。九牛造的其他名稱包括五朵云、九牛七等。有效部位及其制法本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的提取物”、“本發(fā)明的有效部位”和“本發(fā)明的抗HIV潛伏的有效部位”可互換使用，都指提取自大戟屬植物的、具有誘導(dǎo)HIV潛伏感染細(xì)胞的前病毒表達(dá)從而使?jié)摲《炯せ畹淖饔玫奶崛∥?。在本發(fā)明中，抗HIV潛伏的有效部位可用大戟屬植物為原料進(jìn)行提取。此外，雖然抗HIV潛伏的有效部位可來自于大戟屬植物的全草，優(yōu)選非果部分，其中包括根、莖等部位，但是也可從大戟屬植物的地上部分如枝、葉等部位提取。如本文所用，術(shù)語“提取物”或“有效部位”包括水溶性的和/或脂溶性的提取物。該術(shù)語還包括醇提物、或水提物。此外，還包括有效部位群，即含有脂溶性有效部位和水溶性有效部位的萃取物或其混合物。經(jīng)分析，本發(fā)明有效部位所含的化學(xué)成分至少包括選自下組的物質(zhì)二萜、鞣質(zhì)、
留體等?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的大戟屬植物提取物的方法沒有特別限制?？梢杂贸Ｒ?guī)方法，以大戟屬植物為原料，獲得水溶性的和/或脂溶性的提取物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，有效部位的制備通過溶劑提取法、萃取法、和/或色譜法進(jìn)行。在本發(fā)明中，對于溶劑提取法，其所用的溶劑沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或幾種溶劑的混合溶劑。提取次數(shù)可以是一次或多次。在本發(fā)明中，對于溶劑萃取法，其所用的溶劑沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、環(huán)己烷、石油醚中的一種或幾種溶劑的混合溶劑。萃取次數(shù)可以是一次或多次；在本發(fā)明中，對于柱色譜法，其柱色譜沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)活性碳、硅膠、反相硅膠、大孔樹脂、葡聚糖凝膠中的一種或幾種的組合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，以大戟屬植物大戟為原料，以2-10倍藥材重的70-99%乙醇(或乙醇水溶液)提取1-5次，回收乙醇，得到乙醇提取物。乙醇提取物溶于0. 5-2倍重量的水(優(yōu)選50-99°C的熱水)，冷卻后以乙酸乙酯萃取，經(jīng)過活性篩選，表明該提取物可有效干擾或干預(yù)HIV病毒潛伏。
對提取物經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚乙酸乙酯為洗脫溶劑，除去油脂等化學(xué)成分，得到脂溶性的部位，篩選發(fā)現(xiàn)具有最強(qiáng)活性，即為有效部位，有效部位經(jīng)LC-MS分析，其主要成分為二萜、鞣質(zhì)、留體等。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，以大戟屬植物甘遂為原料，以2-10倍藥材重的水提取1-5次，濃縮得到水 提取物。水提取物溶于0. 5-2倍重量的水(優(yōu)選50-99°C的熱水)，冷卻后水提取物經(jīng)大孔吸附柱色譜，以乙醇水溶液為洗脫溶劑，以水除去無機(jī)鹽的水溶性部分，以乙醇洗脫得到乙醇洗脫部位，篩選發(fā)現(xiàn)具有最強(qiáng)活性，即為有效部位，有效部位經(jīng)LC-MS分析，其主要成分為二萜、鞣質(zhì)、留體等。組合物和施用方法如本文所用，術(shù)語“組合物”包括(a)治療和/或預(yù)防艾滋病的組合物，(b)激活潛伏的HIV病毒的組合物。此外，所述的組合物包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物。本發(fā)明的抗HIV潛伏的有效部位具有干預(yù)HIV潛伏的作用。因此，當(dāng)在治療上施用或給予本發(fā)明的抗HIV潛伏的有效部位時(shí)，可促進(jìn)潛伏的HIV病毒的表達(dá)，進(jìn)而激活潛伏的HIV病毒。通常，可將本發(fā)明的有效部位配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的有效部位以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。作為預(yù)防和抗艾滋病藥物，可以制成口服和非口服制劑?？诜o藥可制成片劑、散齊U、顆粒劑、膠囊劑等常用劑型，所用的賦型劑可以為淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羥甲基纖維素等中的一種或幾種。崩解劑可以為馬鈴薯淀粉、羥甲基纖維素等中的一種或幾種。粘合劑可以為阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠、糊精等中的一種或幾種。口服制劑除上述劑型外，還可以制成乳劑、糖衆(zhòng)劑等。非口服制劑可以制成注射劑，可以與注射用水、生理鹽水、葡萄糖水制成注射劑，也可以在其中加入一定比例的乙醇、丙醇、乙二醇等。此外，本發(fā)明的有效部位還特別適合與其他抗HIV的藥物聯(lián)用。尤其是本發(fā)明的有效部位可與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用，清除潛伏感染的細(xì)胞，從而用于艾滋病的治療。作為預(yù)防和抗HIV的有效部位，大戟屬植物有效部位的用量可以為成年人每日
0.1-lOOOOmg，優(yōu)選5-500mg/天，每日服用1_3次。兒童的用量和次數(shù)需在成人的基礎(chǔ)上酌情遞減。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(a)發(fā)現(xiàn)了一種新的有效抗HIV潛伏的藥材及其提取物，該發(fā)現(xiàn)對于新型抗艾滋病藥物的開發(fā)具有重要意義。
(b)大戟屬植物早已長期廣泛使用，是一種安全的低毒副作用的常用中藥材。(c)制備有效部位的工藝簡單實(shí)用，獲得有效部位在低濃度時(shí)即能明顯干預(yù)HIV潛伏。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。實(shí)施例I大戟抗HIV潛伏作用有效部位的制備大戟(1kg，粉末或切碎的藥材)以95%乙醇提取回流(8L x 3)，回收乙醇得乙醇 提取物(0. 26kg)。乙醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后用乙酸乙酯萃取(300mL x 3)，得到乙酸乙酯提取物(47g)。乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱色譜(2kg，柱徑10.0cm)，以石油醚乙酸乙酯(100 I) (20L)洗脫除去油脂部分，而后以二氯甲烷甲醇(I 2) (20L)洗脫得到有效部位(43. 4g)。對得到的有效部位進(jìn)行LC-MS，方法如下分析色譜條件色譜柱為Zorbax SB_C18column (5 u m, 250mmX 4. 6mm ;AgilentTechnologies,USA);流動相為A相0. 5%醋酸水，B相為0. 5%醋酸乙腈。梯度如下30mi n內(nèi)從25% B相到 40% B 相，30min-45min 從 40% B 相到 50% B 相，45min_125min 從 50% B 相到 70%B相，125min-130min從70% B相到80% Bffio流速為0. 5mL/min,柱溫為25°C，進(jìn)樣體積10 u L，紫外檢測波長280nm。質(zhì)譜條件流動相及梯度同色譜條件；ESI離子源為正負(fù)離子檢測；毛細(xì)管電壓為-15V ;離子噴霧電壓為-4. 5V;透鏡偏置電壓為-30V ;噴霧氣和鞘氣均為高純氮?dú)?N2),流速為30a. u.;輔助氣為高純氮?dú)?N2)，流速為10a. u.;碰撞氣為高純氦氣(He) ;MSn碰撞能量為30% -40% ;毛細(xì)管溫度為350°C ;質(zhì)荷比掃描范圍為m/z 100-2000 ;掃描寬度為3. 0 Th。LC-MS結(jié)果如圖I所示,其中包括色譜圖(上)、負(fù)離子流圖(中)和正離子流圖(下)。結(jié)果表明，該有效部位的成分包括二萜、鞣質(zhì)、留體等。實(shí)施例2甘遂抗HIV潛伏作用有效部位的制備甘遂(1kg，粉末或切碎的藥材)以水提取(10L X 2)，濃縮得水提取物(0. 33kg)。水提取物溶于300mL熱水(90°C )，冷卻后進(jìn)行大孔吸附樹脂色譜(IL)，依次用60%乙醇-水(4L)、90%乙醇-水(4L)，得到90%乙醇-水洗脫物(49g)，為有效部位。對得到的有效部位進(jìn)行LC-MS，方法如下分析色譜條件色譜柱為Zorbax SB_C18column (5 u m, 250mmX 4. 6mm ;AgilentTechnologies,USA);流動相為A相0.5%醋酸水，B相為0.5%醋酸乙腈。梯度如下30min內(nèi)從25% B相到 40% B 相，30min-45min 從 40% B 相到 50 % B 相，45min_125min 從 50% B 相到 70%B相，125min-130min從70% B相到80% B相。流速為0. 5mL/min，柱溫為25°C，進(jìn)樣體積10 u L，紫外檢測波長280nm。質(zhì)譜條件流動相及梯度同色譜條件；ESI離子源為正負(fù)離子檢測；毛細(xì)管電壓為-15V ;離子噴霧電壓為-4. 5V ;透鏡偏置電壓為-30V ;噴霧氣和鞘氣均為高純氮?dú)?N2),流速為30a. u.;輔助氣為高純氮?dú)?N2)，流速為10a. u.;碰撞氣為高純氦氣(He) ;MSn碰撞能量為30% -40% ;毛細(xì)管溫度為350°C ;質(zhì)荷比掃描范圍為m/z 100-2000 ;掃描寬度為3. OTh0分析結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，該有效部位的成分包括二萜、鞣質(zhì)、留體等。實(shí)施例3 有效部位對HIV潛伏誘導(dǎo)激活的影響3. I、方法Cll細(xì)胞是一種HIV潛伏感染細(xì)胞模型，是將攜帶EGFP報(bào)告基因的HIV-I的慢病毒感染人T淋巴細(xì)胞系Jurkat，通過細(xì)胞分選和HIV整合檢測，而獲得的具有HIV整合但未表達(dá)EGFP的T淋巴細(xì)胞系。Cll細(xì)胞是被攜帶報(bào)告基因GFP的HIV慢病毒感染同時(shí)又不表 達(dá)的Jurkat穩(wěn)定株，因而用于篩選激活潛伏感染HIV-I藥物(參見申請?zhí)?00810038851.X，發(fā)明名稱“一種篩選激活潛伏感染HIV-I化合物的T淋巴細(xì)胞及其制備方法”的中國專利申請)，保藏號為CCTCC NO. C200821。在本實(shí)施例中，按每孔2 X IO4個(gè)細(xì)胞，將Cl I細(xì)胞種植于96孔板，每孔加入100 ill含10% FBS(Gibco)的1640培養(yǎng)基(Gibco)。24小時(shí)后，加入實(shí)施例2中制備的甘遂有效部位至終濃度I U g/mL。每個(gè)濃度至少3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物處理細(xì)胞72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況，并收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，分析熒光細(xì)胞所占比例。3. 2、結(jié)果以終濃度為I y g/mL的有效部位處理HIV潛伏感染細(xì)胞模型，在藥物處理后的3天，通過對報(bào)告基因綠色熒光蛋白GFP的熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測，分析HIV潛伏感染細(xì)胞的激活效率，從而獲得藥物作用的劑量效應(yīng)關(guān)系。圖3結(jié)果顯示，HIV潛伏感染細(xì)胞經(jīng)甘遂有效部位處理后綠色熒光陽性的細(xì)胞比例達(dá)高達(dá)48% ;未加有效部位處理的HIV潛伏感染細(xì)胞，其熒光陽性的細(xì)胞比例僅有不到I %背景激活。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，甘遂有效部位對HIV潛伏感染細(xì)胞有極其顯著的干預(yù)作用。實(shí)施例4不同濃度的有效部位對HIV潛伏誘導(dǎo)激活的影響重復(fù)實(shí)施例3，不同點(diǎn)僅在于，用終濃度為0. g/mL、0. g/mL、2ii g/mL、或5 u g/mL的甘遂有效部位或替換原終濃度為I U g/mL的甘遂有效部位。重復(fù)實(shí)施例3,不同點(diǎn)僅在于,用終濃度為0. g/mL、0. 5 u g/mL、Iy g/mL>2u g/mL、或5 ii g/mL的大戟有效部位或替換原終濃度為I U g/mL的甘遂有效部位。結(jié)果表明，在上述濃度下，HIV潛伏感染細(xì)胞經(jīng)不同甘遂有效部位或大戟有效部位處理后綠色熒光陽性的細(xì)胞比例為22-90%，遠(yuǎn)高于對照不到1%的背景激活。這表明，本發(fā)明的有效部位對HIV潛伏感染細(xì)胞有顯著的干預(yù)作用。
實(shí)施例5-9重復(fù)實(shí)施例I的制備過程，不同點(diǎn)僅在于，分別用以下條件替換實(shí)施例I中的相應(yīng)條件。實(shí)施例5采用甲醇(95% )為提取溶劑；大戟(1kg，粉末或切碎的藥材)(Ikg)以甲醇提取回流(8L X 3)，回收甲醇得甲醇提取物(0.36kg)。甲醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后用乙酸乙酯(300mL x 3)萃取，得到乙酸乙酯提取物(53g)。乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱色譜(2kg，柱徑10. Ocm)，以石油醚乙酸乙酯(100 I) (20L)洗脫除去油脂部分，而后以二氯甲烷甲醇(I 2) (20L)洗脫得到有效部 位(35. 7g)。實(shí)施例6大戟(1kg，粉末或切碎的藥材)(Ikg)以95%乙醇提取回流(8L X 3)，回收乙醇得乙醇提取物(0. 26kg)。乙醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后用正丁醇萃取(300mL x 4)，得到正丁醇提取物(109g)。正丁醇提取物經(jīng)硅膠柱色譜(2kg，柱徑10. Ocm)，而后以二氯甲烷甲醇(I 2)(20L)洗脫得到有效部位(49. 7g)。實(shí)施例7大戟(1kg，粉末或切碎的藥材)(Ikg)以95%乙醇提取回流(8L X 3)，回收乙醇得乙醇提取物(0. 26kg)。乙醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后用正丁醇萃取(300mL x 3)，得到正丁醇提取物(109g)。正丁醇提取物經(jīng)硅膠柱色譜(2kg，柱徑10. Ocm)，而后以乙酸乙酯甲醇(I 2)(20L)洗脫得到有效部位(60g)。實(shí)施例8大戟(1kg，粉末或切碎的藥材)(Ikg)以95%乙醇提取回流(8L X 3)，回收乙醇得乙醇提取物(0. 26kg)。乙醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后用正丁醇萃取(300mL x 3)，得到正丁醇提取物(109g)。正丁醇提取物經(jīng)硅膠柱色譜(I.5kg，柱徑8.0cm)，而后以乙酸乙酯甲醇(I 2) (15L)洗脫得到有效部位(49. 7g)。實(shí)施例9采用甲醇(90% )為提取溶劑；大戟(1kg，粉末或切碎的藥材)(Ikg)以甲醇提取回流(8L X 3)，回收甲醇得甲醇提取物(0.36kg)。甲醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后用正丁醇(300mL x 3)萃取，得到正丁醇提取物(97. 8g)。正丁醇提取物經(jīng)硅膠柱色譜(2kg，柱徑10. Ocm)，以乙酸乙酯甲醇(I 2)(IOL)洗脫得到有效部位(55. 3g)。
實(shí)施例10-15重復(fù)實(shí)施例2的制備過程，不同點(diǎn)僅在于，分別用以下條件替換實(shí)施例2中的相應(yīng)條件。實(shí)施例10 甘遂(Ikg)以95%乙醇提取(10L X 2)，濃縮得乙醇提取物(0.29kg)。乙醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后進(jìn)行大孔吸附樹脂色譜(IL)，依次用60%乙醇-水(4L)、90%乙醇-水(4L)，得到90%乙醇-水洗脫物(49g)為有效部位。實(shí)施例11甘遂(Ikg)以95%乙醇提取(10L X 3)，濃縮得乙醇提取物(0.31kg)。乙醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后進(jìn)行大孔吸附樹脂色譜(I. 5L)，依次用60%乙醇-水(4L) ,90%乙醇-水(4L)，得到90%乙醇-水洗脫物(50g)為有效部位。實(shí)施例12甘遂(Ikg)以95%乙醇提取(10L X 3)，濃縮得乙醇提取物(0.31kg)。乙醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后進(jìn)行大孔吸附樹脂色譜(I. 5L)，用90%乙醇-水(4L)洗脫，得到90%乙醇-水洗脫物(61g)為有效部位。實(shí)施例13甘遂(Ikg)以70%乙醇提取(10L X 3)，濃縮得乙醇提取物(0.39kg)。乙醇提取物溶于300mL熱水，冷卻后進(jìn)行大孔吸附樹脂色譜(I. 5L)，甲醇(8L)洗脫，得到甲醇洗脫物(72g)為有效部位。實(shí)施例14續(xù)隨子(1kg，粉末或切碎的藥材)(Ikg)以95%乙醇提取回流(8L X 3)，回收乙醇得乙醇提取物(0. 40kg)。乙醇提取物溶于400mL熱水，冷卻后用乙酸乙酯萃取(400mL x 3)，得到乙酸乙酯提取物(67g)。乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱色譜(2kg，柱徑10.0cm)，以石油醚乙酸乙酯(100 I) (IOL)洗脫除去油脂部分，而后以二氯甲烷甲醇(I 2) (20L)洗脫得到有效部位(69. 4g)。實(shí)施例15九牛造(Ikg)以水提取(10L X 2)，濃縮得水提取物(0.47kg)。水提取物溶于500mL熱水，冷卻后進(jìn)行大孔吸附樹脂色譜(IL)，先用水除去無機(jī)鹽等，后用95%乙醇-水(IOL)洗脫，得到95%乙醇-水洗脫物(83g)為有效部位。實(shí)施例16重復(fù)實(shí)施例3，不同點(diǎn)僅在于，用終濃度為10 ii g/mL的實(shí)施例5、6、10、11、14、15制備的大戟或甘遂有效部位或替換原終濃度為I U g/mL的甘遂有效部位。結(jié)果表明，HIV潛伏感染細(xì)胞經(jīng)上述各有效部位處理后綠色熒光陽性的細(xì)胞比例為35-66 %，遠(yuǎn)高于對照不到I %的背景激活。這表明，本發(fā)明的有效部位對HIV潛伏感染細(xì)胞有顯著的干預(yù)作用。實(shí)施例17大戟的醇提取物對HIV潛伏誘導(dǎo)激活的影響
大戟(0. 5kg，粉末或切碎的藥材)以95%乙醇提取回流(4L x 3)，回收乙醇得乙醇提取物(0. 14kg)。在本實(shí)施例中，按每孔2 X IO4個(gè)細(xì)胞，將Cl I細(xì)胞種植于96孔板，每孔加入100 U I含10% FBS(Gibco)的1640培養(yǎng)基(Gibco)。24小時(shí)后，加入實(shí)施例I中制備的大戟的醇提取物至終濃度IOii g/mL。每個(gè)濃度至少3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物處理細(xì)胞72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況，并收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，分析熒光細(xì)胞所占比例。以終濃度為10 U g/mL的醇提取物處理HIV潛伏感染細(xì)胞模型，在藥物處理后的3天，通過對報(bào)告基因綠色熒光蛋白GFP的熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測，分析HIV潛伏感染細(xì)胞的激活效率，從而獲得藥物作用的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，HIV潛伏感染細(xì)胞經(jīng)甘遂有效部位處理后綠色熒光陽性的細(xì)胞比例達(dá)高達(dá)52% ;未加有效部位處理的HIV潛伏感染細(xì)胞，其熒光陽性的細(xì)胞比例僅有不到I %背景激活。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大戟醇提取物對HIV潛伏感染細(xì)胞有干預(yù)作用。
實(shí)施例18藥物組合物用實(shí)施例I相同方法制備提取物40g與藥用淀粉IOOg為原料，不添加任何其他成分，灌制成膠囊，凈重每粒200mg。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種大戟屬植物、大戟屬植物的中藥材或大戟屬植物提取物的用途，其特征在于，(a)用于制備干預(yù)HIV病毒潛伏的組合物；(b)用于制備治療艾滋病的藥物；或(C)用于制備與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用從而治療艾滋病的藥物。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的大戟屬植物提取物包括大戟屬植物的枝、葉、根、和/或莖的水溶性的和/或脂溶性的提取物。
3.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的大戟屬植物提取物包括大戟屬植物的枝、葉、根、和/或莖的醇提取物。
4.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的提取物含有選自下組的組分二萜、鞣質(zhì)、甾體。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述大戟屬植物包括大戟、甘遂、或續(xù)隨子。
6.一種可用于治療艾滋病的有效部位，其特征在于，所述的有效部位具有以下特征 (a)該有效部位是提取自大戟屬植物的枝、葉、根、和/或莖的水溶性的和/或脂溶性的提取物；或提取自大戟屬植物的枝、葉、根、和/或莖的醇提取物； (b)該有效部位含有選自下組的組分二萜、鞋質(zhì)、甾體；和 (c)該有效部位具有誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)、和/或激活潛伏的HIV病毒的功能。
7.—種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求6所述的有效部位和藥學(xué)上可接受的載體。
8.—種體外非治療性誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)的方法，其特征在于，包括步驟在大戟屬植物提取物存在下，培養(yǎng)所述的HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中，使得潛伏的HIV前病毒表達(dá)，從而激活潛伏的HIV病毒。
9.一種激活潛伏的HIV病毒的方法，其特征在于，包括步驟將HIV病毒潛伏感染細(xì)胞與大戟屬植物提取物接觸，給需要的對象施用權(quán)利要求6所述的有效部位或權(quán)利要求7所述的藥物組合物，從而激活潛伏的HIV病毒。
10.一種制備用于治療艾滋病的藥物組合物的方法，其特征在于，包括步驟將權(quán)利要求6所述的有效部位與藥學(xué)上可接受的載體混合，從而形成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大戟屬植物具有抗HIV潛伏作用的有效部位及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明采用獨(dú)創(chuàng)的活性篩選方法發(fā)現(xiàn)了具有抗艾滋病中藥大戟屬植物，并用溶劑提取法、萃取、柱色譜等工藝，結(jié)合活性篩選確定和制備有效部位，制成的大戟屬植物有效部位作為抗艾滋病的活性成分。本發(fā)明的有效部位具有干預(yù)HIV潛伏的作用，可與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用，加速潛伏病毒儲藏庫的清除，為艾滋病的徹底治愈提供新的途徑。
文檔編號A61K36/47GK102727563SQ20111008636
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者朱煥章, 馬忠俊 申請人:上海鑫昊生物科技有限公司