專利名稱：一種知母多糖提取物及其制備方法和醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種知母多糖提取物和其制備方法，及將該知母多糖提取物用作免疫抑制活性，用于治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
知母為百合科知母屬植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的根莖，性味苦、甘、寒，歸肺、胃、腎經(jīng)。具有清熱瀉火、滋陰潤燥功能，用于外感熱病，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)知母中的化學(xué)成分以留體皂苷、雙苯吡酮類為主，尚有木脂素類、黃酮類、有機(jī)酸類等，是現(xiàn)代醫(yī)藥研究中的熱點(diǎn)藥物之一，近年來的研究進(jìn)展迅速，但大都集中于知母皂苷類、雙苯吡酮類成分上，認(rèn)為知母皂苷為知母的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)知母多糖研究較少，尚未見其具有免疫抑制活性的報(bào)道。本發(fā)明通過深入的化學(xué)、藥理學(xué)、藥效學(xué)研究，發(fā)明了一種制備知母多糖的新方法，該方法操作簡單，經(jīng)濟(jì)節(jié)能，并且能得到較高純度和較大含量的多糖組分；同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)知母多糖具有免疫抑制活性，可用于治療與免疫炎性損傷相關(guān)的各種疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病。這與知母以往研究中皂苷類、雙苯吡酮類藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究是完全不同的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種具有免疫抑制活性的知母多糖提取物。本發(fā)明目的之二是提供一種上述知母多糖提取物的制備方法，知母多糖的含量占提取物重量百分比的60 %以上。本發(fā)明目的之三是將上述知母多糖提取物制成各種劑型的免疫抑制劑，用于治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病的醫(yī)藥用途。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的—種知母多糖提取物的制備方法，其特征在于知母原料藥材脫脂后，再經(jīng)過水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖經(jīng)過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分子化學(xué)成分，制成較高純度的知母多糖提取物。一種制備上述知母多糖提取物的方法，其包括以下具體步驟(1)將知母用高濃度乙醇回流除去脂溶性雜質(zhì)；(2)殘?jiān)铀亓魈崛?，濾液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉淀；C3)沉淀依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌；(4)洗滌后的沉淀用蒸餾水復(fù)溶，透析；( 透析液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得多糖沉淀；(6)多糖沉淀依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌；(7)洗滌后的沉淀用蒸餾水復(fù)溶，采用弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂串聯(lián)法脫去多糖中的色素和蛋白質(zhì)，即得知母多糖提取物。為了達(dá)到更好的提取效果，優(yōu)選的，步驟(1)中將知母用6 12倍重量的80 95%乙醇回流脫脂2 3次，每次回流2 池；步驟O)中將殘?jiān)? 12倍重量的蒸餾水回流提取2 3次，每次回流提取2 3h，將濾液濃縮至藥材0. 2 1. 0體積，加入80 95%乙醇醇沉，離心得沉淀；步驟C3)、(6)中將沉淀依次用2 4倍重量的無水乙醇，丙酮分別洗滌；步驟中的沉淀以0. 5 2. 0倍重量的蒸餾水復(fù)溶，以分子量大小為 3. OXlO3-L 2X IO4的透析袋透析24 72h。將從知母中分離出的多糖依次采用DEAE-kpharose F. F和DEAE-52離子交換色譜柱(洗脫相為0. 1-lmol/L的NaCl溶液)，收集液可以選擇但不限于如下瓊脂糖凝膠柱色譜做進(jìn)一步純化分離S印hadex G50、S印hacryl S100、S印hacryl 200、S印hacryl S300 和kphacryl S400(洗脫相為0. 1-lmol/L NaCl溶液)。本發(fā)明知母多糖提取物中總多糖的含量占提取物重量百分比的60%以上，進(jìn)一步純化甚至可以得到知母多糖單體。所述的知母多糖提取物，具有免疫抑制活性對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能呈抑制作用，提示具有非特異性免疫抑制功能；降低綿羊紅細(xì)胞所致實(shí)驗(yàn)大鼠溶血素生成的含量，表示具有體液免疫抑制功能。知母多糖提取物通過免疫抑制機(jī)制，可用于治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病。本發(fā)明知母多糖提取物可以加入制備不同劑型時(shí)所需的各種輔料和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑后，以常規(guī)的中藥制劑方法制備成任何一種適宜的臨床制劑，例如可以是注射劑(粉針、凍干粉針、水針、輸液等)、口服制劑(片劑、口服液、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊或滴丸)等。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1取知母藥材約2. ^ig，用90%乙醇回流提取3次，每次池，過濾，將濾渣晾干，殘?jiān)诱麴s水10倍量，回流提取3次，每次池，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑至藥材1倍體積， 用95%乙醇調(diào)至含醇量為80%，靜置過夜，2000rpm/min離心，沉淀依次用4倍量無水乙醇、 丙酮洗滌，得總多糖。取總多糖加水溶解，上清液裝入透析袋中流水透析48h，蒸餾水透析 Mh，透析液減壓濃縮至藥材1體積，加入95%乙醇調(diào)含醇量為85%，靜置過夜，2000rpm/ min離心，沉淀用4倍量無水乙醇、丙酮依次洗滌，蒸餾水復(fù)溶，經(jīng)過弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂(Amberlite FPA90C1+Amberlite IRC84)脫去總多糖中色素和蛋白質(zhì)冷凍干燥， 得精制知母多糖。用苯酚-硫酸法，在500nm處，紫外分光光度法測(cè)定總多糖含量，以葡萄糖 C6H12O6 計(jì)為 65%。實(shí)施例2取知母藥材約3kg，用80 %乙醇回流提取2次，每次3h，過濾，將濾渣晾干，殘?jiān)诱麴s水8倍量，回流提取2次，每次3h，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑至藥材1倍體積， 用95%乙醇調(diào)至含醇量為80%，靜置過夜，2000rpm/min離心，沉淀依次用3倍量無水乙醇、丙酮洗滌，得總多糖。取總多糖加水溶解，上清液流水透析48h，蒸餾水透析Mh，透析液減壓濃縮至藥材1體積，加入95%乙醇調(diào)含醇量為80%，靜置過夜，2000rpm/min離心，沉淀用3倍重量無水乙醇、丙酮依次洗滌，蒸餾水復(fù)溶，經(jīng)過弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂(Amberlite FPA90C1+Amberlite IRC84)脫去總多糖中色素和蛋白質(zhì)冷凍干燥，得精制知母多糖。用苯酚-硫酸法，在500nm處，紫外分光光度法測(cè)定總多糖含量，以葡萄糖C6H12O6 計(jì)為60%。實(shí)施例3制成輸液劑將知母總多糖經(jīng)過瓊脂糖凝膠柱kphacryl S300,Sephadex G50色譜做進(jìn)一步純化分離得到98%純度以上的知母多糖提取物，加入適量增溶劑，研磨，再加入少量注射用水進(jìn)行稀釋，混勻，然后加入氯化鈉適量，溶解后再加注射用水至規(guī)定量，濾過，灌封，滅菌， 即得。實(shí)施例4制成片劑取之母多糖提取物適量，加入稀釋劑、崩解劑等輔料適量，混勻，制成顆粒，干燥， 壓制成片，包衣或噴薄膜衣即得。實(shí)驗(yàn)例1知母多糖抗炎實(shí)驗(yàn)研究取ICR雄性小鼠，隨即分成知母高劑量G40mg/kg)、知母低劑量(110mg/kg)、陽性對(duì)照地塞米松(3. 6mg/kg)及空白對(duì)照組。秤取各組小鼠體重，計(jì)算均值標(biāo)準(zhǔn)差確定無組間差異，連續(xù)灌胃給藥三天，第三天于末次給藥后50min，每鼠右耳涂致炎劑(二甲苯20μ 1)， 左耳作為空白對(duì)照，3小時(shí)后將小鼠處死，剪下兩耳并打下圓耳片，分析天平稱重，計(jì)算小鼠耳腫脹度。比較4組腫脹度的差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。表1 知母多糖抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果(X ±S，n=10)
權(quán)利要求
1.一種知母多糖提取物，其特征在于所述知母多糖提取物中總多糖的含量占提取物重量百分比的60%以上。
2.一種知母多糖提取物的制備方法，其特征在于知母藥材脫脂后，經(jīng)過水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖再經(jīng)過透析、離子交換柱層析脫去蛋白、色素，再除去小分子化學(xué)成分，制成較高純度的知母多糖提取物。
3.—種權(quán)利要求1、2所述的知母多糖提取物的制備方法，包括以下步驟(1)將知母用高濃度乙醇回流除去脂溶性雜質(zhì)；(2)殘?jiān)铀亓魈崛?，濾液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉淀；(3)沉淀分別用無水乙醇，丙酮依次洗滌；(4)洗滌后的沉淀用蒸餾水復(fù)溶，進(jìn)行透析；(5)透析液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得多糖沉淀；(6)多糖沉淀分別用無水乙醇，丙酮依次洗滌；(7)洗滌后的多糖沉淀用蒸餾水復(fù)溶，采用弱酸弱堿型陰、陽離子交換樹脂串聯(lián)法脫去多糖中的色素和蛋白質(zhì)，制成知母多糖提取物。
4.按照權(quán)利要求2、3所述的知母多糖提取物的制備方法，其特征在于步驟(1)中將知母用6 12倍重量的80 95%乙醇回流脫脂2 3次，每次回流2 池；步驟O)中將殘?jiān)? 12倍重量的蒸餾水回流提取2 3次，每次回流提取2 池，將濾液濃縮至藥材0. 2 1. 0體積，加入80 95%乙醇醇沉，離心得沉淀；步驟C3)、(6)中將沉淀依次用2 4倍重量的無水乙醇，丙酮分別洗滌；步驟(4)中的沉淀以0. 5 2. 0倍重量的蒸餾水復(fù)溶，以分子量大小為3. OX IO3-L 2 X IO4的透析袋透析24 72h。
5.按照權(quán)利要求1、2、3所述的知母多糖，其特征在于知母多糖具有免疫抑制活性，可以用作制備各種劑型的免疫抑制劑或作為制備其他免疫抑制藥物的原料藥，用于治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病的醫(yī)藥用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種知母多糖提取物及制備方法和醫(yī)藥用途。制備方法包括原料脫脂后，再經(jīng)過水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖經(jīng)過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分子化學(xué)成分，制成較高純度的知母多糖提取物。本發(fā)明提取物中知母多糖的含量以葡萄糖計(jì)，所述多糖的含量占知母提取物重量百分比60％以上。本發(fā)明通過大量的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，知母多糖提取物具有免疫抑制活性，用于治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病的醫(yī)藥用途。
文檔編號(hào)A61P11/00GK102166294SQ20111008770
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者匡海學(xué), 夏永剛, 王知斌, 王秋紅, 穆光銳, 薛娟 申請(qǐng)人:匡海學(xué)