專利名稱：一種IVa2基因功能缺失的重組腺病毒載體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種IVa2基因功能缺失的新型重組腺病毒載體及其制備方法和用途。所述的重組腺病毒載體具有病毒基因組可復(fù)制而不產(chǎn)生子代病毒的特點(diǎn)。這種腺病毒載體在疫苗研究和基因治療中都有應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)背景腺病毒(Adenovirus, Ad)是一種雙鏈、無包膜的DNA病毒。完整的病毒顆粒為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑70-100nm。衣殼含有240個(gè)六聯(lián)體(Hexon)、12個(gè)五聯(lián)體(Penton)及12根纖毛(Fiber)，以及一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa等。在超過50種的腺病毒血清型中，Ad5常用作基因轉(zhuǎn)移的載體。哺乳動(dòng)物腺 病毒的基因組DNA長(zhǎng)約36kb，基因組的兩端各有約100的反向末端重復(fù)序列(Inverted terminal repeat, ITR)。ITR與末端蛋白(TP)相結(jié)合，與基因組復(fù)制以及早期基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。腺病毒的生活周期，以病毒基因組DNA的復(fù)制為節(jié)點(diǎn)，分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)。前者有E1A、E1B、E2、E3和E4共5個(gè)非連續(xù)的轉(zhuǎn)錄單位；晚期只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，受主要晚期啟動(dòng)子(Major late promoter,MLP)調(diào)控。晚期轉(zhuǎn)錄單位經(jīng)過mRNA的剪切加工，形成L1-L5共5種mRNA家族。所有的晚期轉(zhuǎn)錄mRNA的C末端都有一個(gè)共同的非翻譯前導(dǎo)序列，稱為三聯(lián)先導(dǎo)序列(Tripartite leader，TPL)。TPL由腺病毒基因組的3個(gè)不同位置拼接而成，長(zhǎng)203bp，與晚期mRNA的翻譯有關(guān)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)各區(qū)所編碼的蛋白均有所不同。El基因編碼區(qū)是病毒復(fù)制的必需區(qū)，在病毒進(jìn)入細(xì)胞核后立即被活化，其編碼的蛋白(ElA和ElB)調(diào)節(jié)所有的早期功能。E2區(qū)基因產(chǎn)物分E2A(DBP)和E2B(pTP和Pol)，提供病毒DNA的復(fù)制機(jī)器。E3區(qū)是病毒復(fù)制的非必需區(qū)，編碼參與病毒與宿主相互作用的多肽，可減弱感染細(xì)胞被機(jī)體免疫識(shí)別的概率，刪去E3區(qū)對(duì)病毒感染沒有明顯的影響；E4區(qū)編碼關(guān)閉宿主基因表達(dá)，使其有利于病毒繁殖的蛋白質(zhì)，還可調(diào)節(jié)其他區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄。主要晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼組成衣殼的大部分蛋白質(zhì)，為病毒顆粒的裝配提供“建筑材料”。圖I為5型腺病毒的基因組的示意圖。腺病毒載體因宿主范圍廣、外源基因表達(dá)水平高、不整合至染色體以及制備工藝成熟等特點(diǎn)而廣泛用于基因治療和疫苗研究[1_2]。最為常用的腺病毒載體是El缺失的復(fù)制缺陷性重組5型腺病毒，這種El基因缺失的重組腺病毒能在HEK293細(xì)胞(含有并表達(dá)腺病毒El基因)高效增殖，但在其它不表達(dá)腺病毒El基因的細(xì)胞中則不復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒。雖然El基因缺失所至的病毒復(fù)制缺陷很好地保證了腺病毒載體的安全性，但是對(duì)于疫苗載體而言，病毒載體基因組具有復(fù)制能力被證明能大大提高疫苗的免疫效果[3]。因此，本案發(fā)明一種缺失腺病毒中期基因的載體，為最終建立一種保留病毒基因組復(fù)制能力而不能產(chǎn)生子代病毒的新型腺病毒載體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。El基因是腺病毒生活周期中最早表達(dá)的調(diào)控基因，對(duì)于腺病毒基因組的復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)都是必需的。IVa2基因的表達(dá)介于腺病毒生活周期中早期基因和晚期基因表達(dá)之間，因此被稱為中期基因(intermediate gene)，也因?yàn)槠浔磉_(dá)緊接在早期基因之后而被稱為延遲的早期基因(delayed early gene)[7]。IVa2 是腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(major late promoter,MLP)的轉(zhuǎn)錄激活因子，對(duì)MLP的激活具有重要作用[8’9]。而腺病毒的主要外殼蛋白Hexon，Penton, Fiber等晚期蛋白的表達(dá)都受到MLP的調(diào)控。同時(shí)，IVa2在病毒外殼蛋白的裝配(assembly)以及病毒基因組入殼(encapsidation)過程中扮演了重要角色[4]。因此,缺失IVa2基因的重組腺病毒，理論上在結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)以及病毒顆粒的裝配和基因組入殼過程受阻，從而不能產(chǎn)生子代病毒。傳統(tǒng)上對(duì)病毒基因組的操作主要是通過體外分子克隆或者體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。對(duì)于長(zhǎng)達(dá)200kb的痘苗病毒之類基因組較大的病毒進(jìn)行基因工程操作，大多數(shù)策略都是利用在病毒DNA在復(fù)制過程中天然發(fā)生的體內(nèi)同源重組來進(jìn)行的。但天然的同源重組效率相對(duì)較低，非重組子的本底過高，區(qū)分重組病毒和野病毒則是一件比較繁瑣的事情。在腺病毒基因組上直接缺失IVa2基因是有困難的。因?yàn)橄俨《净蚪M較大，長(zhǎng)度約為36kb，難以找到合適的酶切位點(diǎn)直接去除IVa2基因，并且其5’端編碼區(qū)與E2B基因部分重疊而不能全部去除，因此我們利用一種基于X-RED重組酶系統(tǒng)[]的PCR打靶方法直接在腺病毒基因組上進(jìn)行IVa2基因序列的精確缺失。已有利用Red重組酶系統(tǒng)改造大腸桿菌基因組，鏈霉菌以及桿狀病毒等的成功報(bào) 道[13_15]。有研究表明，當(dāng)入噬菌體Red重組酶(Gam，Bet，Exo三個(gè)亞基組成)存在的時(shí)候，線性DNA片段能在大腸桿菌內(nèi)高效的與靶序列發(fā)生序列特異的同源重組，并且只需要很短的同源臂( 40bp)。而這樣長(zhǎng)度的同源臂，可以通過PCR引物很方便的加在DNA的兩端[12]。而常規(guī)的同源重組是將含有同源臂的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到宿主中去。在大腸桿菌中，由于內(nèi)源性的外切核酸酶recBCD (Exo V)的存在，線性的DNA片段會(huì)被其降解，不能轉(zhuǎn)化[11]。發(fā)明概述為了建立一種保留腺病毒基因組復(fù)制能力而阻斷其產(chǎn)生子代病毒能力的新型腺病毒載體系統(tǒng)，本發(fā)明采用了保留El基因功能而缺失IVa2基因的策略，通過基因操作手段獲得一種能表達(dá)El基因而不能表達(dá)IVa2基因的新型腺病毒載體。本發(fā)明還描述了獲得這種新型腺病毒載體的方法。具體地，這種可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的腺病毒基因組里缺失了 IVa2基因的大部分(1140bp)，使病毒不能產(chǎn)生子代病毒；在操作上是在原來El和E3基因缺失的基礎(chǔ)上，插入人工構(gòu)建的El基因(E1A，E1B)表達(dá)單元，使病毒獲得基因組復(fù)制能力；這種可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體包裝系統(tǒng)，最終有兩種形式I)該系統(tǒng)包括以下3個(gè)要素HeLa_IVa2細(xì)胞；pBHGAIVa2;pDC316-MCS- (PGK-E I -po I yA) (El表達(dá)單元插在原El區(qū))，這是其中一種形式。2)另一種形式是，該系統(tǒng)包括以下3個(gè)要素HeLa-IVa2細(xì)胞，pBHG A IVa2 (PGK-E I-po IyA)，pDC316 (El 表達(dá)單元插在原 E3 區(qū))。該系統(tǒng)用途是疫苗載體和腫瘤基因治療，特點(diǎn)是可以用較少劑量達(dá)到更高劑量的效果，減少針對(duì)載體的免疫反應(yīng)。發(fā)明詳述為了建立一種保留腺病毒基因組復(fù)制能力而阻斷其產(chǎn)生子代病毒能力的新型腺病毒載體系統(tǒng)，本發(fā)明采用了保留El基因功能而缺失IVa2基因的策略，通過基因操作手段獲得一種能表達(dá)El基因而不能表達(dá)IVa2基因的新型腺病毒載體。本發(fā)明還描述了獲得這種新型腺病毒載體的方法。El基因缺失的腺病毒載體，也被稱為第一代腺病毒載體，其E3區(qū)也往往刪除以獲得更大的容量。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步缺失E2和或部分E4的腺病毒載體被稱為第二代腺病毒載體。缺失所有腺病毒編碼基因的腺病毒載體被稱為第三代。目前最廣為應(yīng)用的腺病毒載體是第一代。
由于El基因是腺病毒生活周期中最早啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的基因，它對(duì)于其它早期基因和中晚期基因的轉(zhuǎn)錄激活都是必不可少的，因此缺失El基因是構(gòu)建復(fù)制缺陷性腺病毒載體的最為重要的策略，并且J1EK293細(xì)胞中穩(wěn)定攜帶的El基因能充分補(bǔ)充腺病毒復(fù)制所需的El基因功能。El基因缺失的腺病毒載體因其不能在正常細(xì)胞中產(chǎn)生子代病毒而變得十分安全，因此得到了大量的應(yīng)用。然而，El基因缺失的腺病毒載體也因?yàn)镋l缺失而不能進(jìn)行基因組復(fù)制，因此感染細(xì)胞后不能產(chǎn)生“放大”效應(yīng)，即不能由少數(shù)基因組復(fù)制成較大量的基因組，從而產(chǎn)生更高的外源基因表達(dá)。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種保留El基因功能而缺失IVa2基因功能的重組腺病毒，使得其保留基因組復(fù)制功能而在結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)以及病毒顆粒的裝配和基因組入殼過程受到阻礙，從而不能產(chǎn)生子代病毒。IVa2基因長(zhǎng)1628bp，位于腺病毒基因組的IX基因與E2B基因之間，其編碼基因的5’端有488bp與E2B基因編碼區(qū)的3’末端重疊。由于E2B基因是腺病毒復(fù)制的必需基因，因此在刪除IVa2基因時(shí)要把這部分重疊序列保留。在設(shè)計(jì)上我們針對(duì)IVa2基因編碼區(qū)3’ 端包括終止密碼子的長(zhǎng)1140bp片段進(jìn)行缺失操作。在腺病毒基因組上直接缺失IVa2基因是有困難的。因?yàn)橄俨《净蚪M較大，長(zhǎng)度約為36kb，難以找到合適的酶切位點(diǎn)直接去除IVa2基因，因此我們利用一種基于\ -RED重組酶系統(tǒng)的PCR打靶方法直接在腺病毒基因組上進(jìn)行IVa2基因1140bp序列的精確缺失。該方法的示意圖見圖4。已有利用Red重組酶系統(tǒng)改造大腸桿菌基因組，鏈霉菌以及桿狀病毒等的成功報(bào)道[ 15]。該方法的原理是當(dāng)入噬菌體Red重組酶(Gam，Bet, Exo三個(gè)亞基組成)存在的時(shí)候，線性DNA片段能在大腸桿菌內(nèi)高效的與靶序列發(fā)生序列特異的同源重組，并且只需要很短的同源臂( 40bp)。而這樣長(zhǎng)度的同源臂，可以通過PCR引物很方便的加在DNA的兩端[12]。而常規(guī)的同源重組是將含有同源臂的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到宿主中去。在大腸桿菌中，由于內(nèi)源性的外切核酸酶recBCD (Exo V)的存在，線性的DNA片段會(huì)被其降解而不能發(fā)生有效重組。該方法的特點(diǎn)是在大基因組上直接進(jìn)行插入、刪除、替換等操作，避免繁瑣的亞克隆過程，本發(fā)明將該方法用于腺病毒基因組的改造。用基于RED重組酶的PCR-targeting技術(shù)方法成功地缺失了腺病毒基因組質(zhì)粒pFG140(pFG140的基因的示意圖見圖2和圖8，Microbix公司產(chǎn)品)和pBHGloxp (delta) E3, ICre (Microbix公司)上腺病毒基因組中的IVa2(1140bp)片段，構(gòu)建了 IVa2缺失的腺病毒基因組質(zhì)粒pFG140/AIVa2(其基因的示意圖見圖 2 和圖 9)及 pBHGAIVa2。注pFG140/A IVa2 與 pFG140/A IVa2kan 是一致的，kan表示該質(zhì)粒是卡那霉素抗性陽性的?！髋cdelta是一致的，表示該基因缺失的含義。在Microbix公司的AdMax系統(tǒng)基礎(chǔ)上進(jìn)行改造。具體本發(fā)明以穿梭質(zhì)粒pDC316和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxp (delta)E3，ICre為材料進(jìn)行改造。通過缺失IVa2基因(1140bp)使病毒無法組裝和出毒并抑制晚期蛋白的表達(dá)，缺失的IVa2基因序列為IVa2基因的524至1627位序列，共1104bp。通過引入人工構(gòu)建的El表達(dá)單元(PGK啟動(dòng)子-ElAElB_SV40polyA)使病毒基因組能夠復(fù)制，并且該人工構(gòu)建的El表達(dá)單元與野生型腺病毒的El基因表達(dá)單元相比是一種組成性表達(dá)的，不受到病毒生活周期晚期對(duì)El基因表達(dá)抑制的影響，使病毒基因持續(xù)復(fù)制。
由于IVa2基因產(chǎn)物對(duì)于腺病毒的完成生活周期是必需的，因此缺失了 IVa2基因的重組腺病毒的生產(chǎn)必須在反式互補(bǔ)IVa2功能的細(xì)胞株上進(jìn)行。因此我們構(gòu)建了包含IVa20RF全長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pAAV2neo-IVa2。其組成是在2個(gè)AAV2ITR之間有“CMV啟動(dòng)子-IVa2基因-牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)polyA”，質(zhì)粒骨架上有neo基因表達(dá)盒，使得該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以用G418篩選抗性克隆。為了證明所構(gòu)建的pAAV2neo-IVa2具有反式互補(bǔ)功能，將該質(zhì)粒與pFG140-AIVa2(1104)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，成功獲得了 IVa2基因缺失的重組腺病毒Ad5 A IVa2(1104)，而直接用pFG140_ A IVa2 (1104)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞就無法獲得重組病毒。Ad5AIVa2(1104)病毒經(jīng)過PCR鑒定和測(cè)序證明在預(yù)計(jì)位置成功缺失掉了 IVa2基因1140bp 片段。Western blot 也證實(shí) Ad5 A IVa2 (1104)感染 HEK293 細(xì)胞后，檢測(cè)不到 IVa2的表達(dá)。而重組病毒Ad5AIVa2(1104)也只能在轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo_IVa2的HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增。經(jīng)過pFG140/ A IVa2與pAAV2neo_IVa2共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得了 IVa2缺失的重組腺病毒Ad5AIVa2(1104);該重組病毒Ad5 A IVa2 (1104)不能在正常的HEK293細(xì)胞中增 殖，而只能在轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo-IVa2的HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增。表明獲得的Ad5 A IVa2 (1104)病毒的增殖依賴于外源提供IVa2的功能。為了獲得穩(wěn)定表達(dá)IVa2基因的細(xì)胞株用作生產(chǎn)細(xì)胞，將我們構(gòu)建的pAAV2neo-IVa2轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，加G418篩選獲得HeLa_IVa2 ;將轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，共59個(gè)細(xì)胞株，挑選出能穩(wěn)定表達(dá)IVa2基因并支持IVa2基因缺失的重組腺病毒復(fù)制的單克隆細(xì)胞HeLa-IVa2-C009，用于IVa2基因缺失重組腺病毒的大量制備。同樣，還將我們構(gòu)建的pAAV2neo-IVa2轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，加G418篩選獲得HEK293_IVa2。為了獲得復(fù)制型的腺病毒載體，本發(fā)明構(gòu)建了人工設(shè)計(jì)的El基因表達(dá)質(zhì)粒PPGK-E1AE1B，其中攜帶了 El基因表達(dá)單元，由PGK啟動(dòng)子-El基因編碼區(qū)_SV40polyA組成。為了驗(yàn)證該質(zhì)粒的功能，將pPGK-ElAElB導(dǎo)入HeLa細(xì)胞獲得了 HeLa/pGK-ElAElB穩(wěn)定細(xì)胞株。用非復(fù)制的Ad5-EGFP感染HeLa和HeLa/pGK_ElAElB，2d后可見在HeLa/pGK-EIAEIB細(xì)胞上見到明顯CPE變化，并且EGFP熒光亮度也明顯強(qiáng)；復(fù)制的Ad5_EGFP感染HeLa/pGK-ElAElB病變后的細(xì)胞凍融裂解后，再次感染HeLa和HeLa/pGK_ElAElB，見到在HeLa/pPGK-ElAElB細(xì)胞上有明顯CPE變化，而在HeLa細(xì)胞上變化不明顯，證明HeLa/pGK-EIAEIB細(xì)胞能支持El缺失性的腺病毒載體復(fù)制和傳毒。在此基礎(chǔ)上，將pPGK-ElAElB質(zhì)粒中的El基因表達(dá)單元插入腺病毒基因組的E3缺失區(qū)或El缺失區(qū)，然后通過與穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞重組獲得可復(fù)制而不產(chǎn)毒的腺病毒載體。將El基因表達(dá)單元插入穿梭質(zhì)粒pDC316或該系列的其它穿梭質(zhì)粒(Microbix公司)的mCMV啟動(dòng)子上游，獲得攜帶El基因表達(dá)單元的通用型穿梭質(zhì)粒；在其mCMV啟動(dòng)子啟動(dòng)子下游插入外源基因(如EGFP)，獲得攜帶El基因表達(dá)單元的穿梭質(zhì)粒；將其與pBHG A IVa2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa-IVa2_C009細(xì)胞得到Ad5_ A El/El+- A IVa2_X病毒，該病毒能在HeLa-IVa2_C009上連續(xù)傳代。將El基因表達(dá)單元插入到pBHG A IVa2質(zhì)粒中腺病毒基因組缺失的E3區(qū)，獲得了 pBHG A IVa2-El+ ;用pBHG A IVa2_El+與攜帶外源基因X的穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞株HeLa-IVa2-C009,獲得了 Ad5_ A IVa2_ A E3/E1+-X 病毒，該病毒能在 HeLa-IVa2_C009 上連續(xù)傳代。本發(fā)明建立了一種獲得保留El基因功能及缺失IVa2基因功能的重組腺病毒載體系統(tǒng)及方法，用此載體系統(tǒng)和方法可以獲得IVa2基因功能缺失的重組腺病毒Ad5_ AEl/El+- A IVa2-X 及 Ad5- A IVa2- A E3/E1+-X。重組腺病毒 Ad5_ A El/El+- A IVa2-X 的特點(diǎn)是在腺病毒基因組的El缺失區(qū)插入了人工構(gòu)建的El基因表達(dá)單元；重組腺病毒Ad5-AIVa2-AE3/El+-X的特點(diǎn)是在腺病毒基因組E3缺失區(qū)插入了人工構(gòu)建的El基因表達(dá)單元。 這種可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體包裝系統(tǒng)，最終有兩種形式I)該系統(tǒng)包括以下3個(gè)要素HeLa_IVa2細(xì)胞；pBHGAIVa2;pDC316-MCS- (PGK-E I -po I yA) (El表達(dá)單元插在原El區(qū))，這是其中一種形式。2)另一種形式是，該系統(tǒng)包括以下3個(gè)要素HeLa-IVa2細(xì)胞，pBHG A IVa2 (PGK-E I-po IyA)，pDC316 (El 表達(dá)單元插在原 E3 區(qū))。傳統(tǒng)上對(duì)病毒基因的操作主要是通過體外分子克隆或者體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。對(duì)于基因組較小的病毒，如腺相關(guān)病毒(野生型腺相關(guān)病毒2型基因組大小為4680bp)，猴多瘤病毒SV40(基因組大小為5243bp)等，只需要通過體外酶切連接等常規(guī)的分子克隆手段，即可方便的達(dá)到改造目的。而類似于腺病毒之類基因組中等大小的病毒(基因組36kb左右)，雖然也能夠通過酶切連接的方式，但由于基因組偏大，合適的酶切位點(diǎn)不多，操作起來頗為費(fèi)力。有時(shí)候?yàn)榱朔奖悴僮?，還得先獲得酶切位點(diǎn)改變的突變株，常見的腺病毒5型突變株dl309即是將野生腺病毒中4個(gè)Xba I突變?nèi)コ?個(gè)后的產(chǎn)物[9]。該過程步驟繁瑣，工作量大。此外對(duì)于長(zhǎng)達(dá)200kb的痘苗病毒之類基因組較大的病毒進(jìn)行基因工程操作，大多數(shù)策略都是利用病毒DNA在復(fù)制過程中天然發(fā)生的體內(nèi)同源重組來進(jìn)行的。但天然的同源重組效率相對(duì)較低，非重組子的本底過高，區(qū)分重組病毒和野病毒則是一件比較繁瑣的事情。常規(guī)的同源重組，是將含有同源臂的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到宿主中去。在大腸桿菌中，由于內(nèi)源性的外切核酸酶recBCD (Exo V)的存在，線性的DNA片段會(huì)被其降解，不能轉(zhuǎn)化[1°]。但有研究表明，當(dāng)\噬菌體Red重組酶(Gam，Bet, Exo三個(gè)亞基組成)存在的時(shí)候，線性DNA片段能在大腸桿菌內(nèi)高效的與靶序列發(fā)生序列特異的同源重組，并且只需要很短的同源臂( 40bp)。而這樣長(zhǎng)度的同源臂，可以通過PCR引物很方便的加在DNA的兩端[11]。已有成功利用Red重組酶系統(tǒng)改造大腸桿菌基因組，鏈霉菌以及桿狀病毒等的報(bào)道[12_14]。除了大腸桿菌基因組外，鏈霉菌和桿狀病毒的改造，大多是基于構(gòu)建在粘粒(Cosmid)上的克隆實(shí)現(xiàn)的，而在病毒學(xué)研究中，大量的感染性克隆都是構(gòu)建在質(zhì)粒(Plasmid)骨架上。本案利用Red重組酶，以腺病毒感染性克隆PFG140為改造對(duì)象，通過缺失腺病毒IVa2基因?yàn)槔?，建立了一種快速精確的改造構(gòu)建在質(zhì)粒骨架上的病毒基因組的方法。為了建立PCR打靶方法，構(gòu)建了通用型模板質(zhì)粒pAK。該質(zhì)粒是將卡那霉素基因表達(dá)盒克隆到PMD18-T載體中，同時(shí)在卡那霉素表達(dá)盒的兩端加入了罕見內(nèi)切酶Swa I位點(diǎn)。重組成功后，只需要用Swa I酶切重組子后自連，即可去掉多余的卡那霉素抗性基因序列。以pAK為模板，制備用于同源重組的線性DNA片段如果缺失某個(gè)基因，只需要擴(kuò)增含Swa I酶切位點(diǎn)的卡那霉素基因，同時(shí)通過引物在PCR產(chǎn)物兩端引入39bp的同源臂，即可獲得用于缺失突變的線性DNA片段；如果插入某個(gè)基因，方法與缺失相似，只是在擴(kuò)增前需要將該基因克隆到PAK的多克隆位點(diǎn)MCSl或MCS2中，pAK的質(zhì)粒圖見圖3。復(fù)制型腺病毒載體疫苗能模擬病原在體內(nèi)的復(fù)制過程，長(zhǎng)時(shí)間地反復(fù)刺激免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈、持久、全面的免疫反應(yīng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。但針對(duì)腺病毒載體本身的免疫反應(yīng)會(huì)對(duì)腺病毒載體疫苗的應(yīng)用造成不利影響，而腺病毒晚期蛋白如果六鄰體蛋白(Hexon)、五鄰體蛋白(Penton)等是載體自身免疫的主要抗原。因此一種保留基因組復(fù)制能力，同時(shí)抑制腺病毒晚期蛋白表達(dá)的載體系統(tǒng)，在腺病毒載體疫苗的研究 中具有潛在的價(jià)值。我們通過缺失腺病毒IVa2基因的策略來構(gòu)建這種載體系統(tǒng)。pAAV2neo-IVa2以CMV為啟動(dòng)子，表達(dá)IVa20RF全長(zhǎng)。將該質(zhì)粒與PFG140- A IVa2 (1104)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，獲得了 IVa2基因缺失的重組腺病毒Ad5AIVa2(1104)。為了降低回復(fù)突變產(chǎn)生野毒的可能性，pFG140-A IVa2 (1104)缺失的IVa2基因序列與pAAV2neo-IVa2表達(dá)的IVa20RF只有一端同源。Ad5 A IVa2 (1104)在轉(zhuǎn)染pAAV2neo-IVa2的HEK93細(xì)胞中，多次傳代(3次以上)后沒有檢測(cè)到回復(fù)突變產(chǎn)生的野毒(未發(fā)表數(shù)據(jù))，說明回復(fù)突變的概率很低。重組病毒經(jīng)過PCR鑒定證明在預(yù)期位置缺失突變了 IVa2基因；Western blot也證實(shí)Ad5 A IVa2 (1104)感染HEK293細(xì)胞后，檢測(cè)不到IVa2的表達(dá)。說明PCR打靶的方法精準(zhǔn)的缺失了 IVa2基因，同時(shí)沒有改變感染性克隆PFG140的結(jié)構(gòu)和功能。重組病毒Ad5 A IVa2 (1104)只能在轉(zhuǎn)染pAAV2neo_IVa2的HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，表明缺失IVa2的重組病毒不能產(chǎn)生子代病毒，而構(gòu)建的pAAV2neo-IVa2能有效的反式互補(bǔ)IVa2的功能。本案為我們下一步研究重組腺病毒Ad5AIVa2(1104)晚期蛋白的表達(dá)、病毒顆粒的組裝打下了基礎(chǔ)。具體的工作包括本案應(yīng)用了基于RED重組酶的PCR-targeting技術(shù)方法，將該方法用于腺病毒基因組的改造。該方法的特點(diǎn)是在大基因組上直接進(jìn)行插入、刪除、替換等操作，避免繁瑣的一步步亞克隆過程。本案用基于RED重組酶的PCR-targeting技術(shù)方法成功構(gòu)建了 IVa2缺失的腺病毒基因組質(zhì)粒pFG140/A IVa2及pBHG A IVa2。IVa2基因是腺病毒生活周期中的中期基因(intermediate gene), IVa2功能缺失可以使腺病毒的晚期蛋白表達(dá)以及病毒基因組包裝入病毒顆粒受阻，但不影響腺病毒基因組的復(fù)制。從腺病毒基因組中擴(kuò)增出100K和IVa2基因編碼序列，插入到表達(dá)載體pAAV2neo中，構(gòu)建成pAAV2neo-IVa2 (圖5)和pAAV2neo_100K (圖12A)。這部分工作目的是為缺失100K或IVa2基因的腺病毒反式提供必需元件。酶切鑒定(圖12B)和測(cè)序分析表明構(gòu)建完全正確，轉(zhuǎn)染J1EK293細(xì)胞，G418選擇培養(yǎng)獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。為了獲得穩(wěn)定表達(dá)IVa2基因的細(xì)胞株用作生產(chǎn)細(xì)胞，將我們構(gòu)建的pAAV2neo-IVa2 轉(zhuǎn)染至 HEK293 細(xì)胞中，加 G418 篩選獲得 HEK293_IVa2 ；完成了 100K，IVa2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定和HEK293細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立。完成了表達(dá)質(zhì)粒pPGK-ElAElB和pPGK-ElA的構(gòu)建構(gòu)建獲得了表達(dá)Ela和ElaElb基因的表達(dá)質(zhì)粒pPGK_ElAElB和pPGK_ElA兩個(gè)質(zhì)粒(圖13)，酶切鑒定及序列測(cè)定分析正確。為我們構(gòu)建復(fù)制型腺病毒載體奠定了基礎(chǔ)。建立了HeLa/pGK-ElAElB 穩(wěn)定細(xì)胞株將pPGK-ElAElB導(dǎo)入HeLa細(xì)胞獲得了 HeLa/pGK-ElAElB穩(wěn)定細(xì)胞株。用非復(fù)制的Ad5-EGFP感染HeLa和HeLa/pGK-ElAElB，2d后可見在HeLa/pGK-ElAElB細(xì)胞上見到明顯CPE變化，并且EGFP熒光亮度也明顯強(qiáng)(圖14);復(fù)制的Ad5-EGFP感染HeLa/pGK-ElAElB病變后的細(xì)胞凍融裂解后，0. 22um過濾，感染HeLa和HeLa/pGK-ElAElB，5d后可以見到在HeLa/pPGK-ElAElB細(xì)胞上有明顯CPE變化(圖15)。以上結(jié)果證明HeLa/pGK-ElAElB細(xì)胞能支持El缺失性的腺病毒載體復(fù)制和傳毒；這為我們?nèi)蘸蠼⑿碌腅l缺失的腺病毒載體包裝細(xì)胞株打下了基礎(chǔ)。經(jīng)過pFG140/ A IVa2 與 pAAV2neo_IVa2 共轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞，獲得了 IVa2 缺失的重組腺病毒Ad5AIVa2(1104);該重組病毒Ad5 A IVa2 (1104)不能在正常的HEK293細(xì)胞中增殖，而只能在轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo-IVa2的HEK293細(xì)胞 中擴(kuò)增。結(jié)果表明獲得的Ad5AIVa2(1104)病毒的增殖依賴于外源提供IVa2的功能。為了獲得復(fù)制型的腺病毒載體，將El基因表達(dá)單元PGK-El-SV40polyA插入腺病毒基因組，插入的位置先后選擇了 E3區(qū)和原El區(qū)；然后重組獲得可復(fù)制而不產(chǎn)毒的腺病毒載體及受miRNA調(diào)控復(fù)制或產(chǎn)毒的腺病毒載體。完成了Ad5-CMV-EGFP-E1AE1B+ 和 Ad5-CMV-EGFP_E1A+ 重組腺病毒的構(gòu)建、拯救，以及復(fù)制功能的研究將pGK-ElAElB和pGK-ElA分別插入腺病毒基因組的E3區(qū)(圖16)，獲得新型復(fù)制型腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG-pGK-ElAElB和pBHG-pGK_ElA (圖17)。將構(gòu)建好的復(fù)制型腺病毒基因組質(zhì)粒分別與pDC-316-EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，拯救出Ad5-CMV-EGFP_E1AB+和Ad5-CMV-EGFP-E1A+病毒(圖18)。以腺病毒E3區(qū)兩端DNA序列設(shè)計(jì)引物，以Ad5-CMV-EGFP-E1AE1B+基因組為模板能擴(kuò)增出預(yù)期3. 8kb的片段(圖19)。研究表明Ad5-CMV-EGFP-E1AE1B+具有自主復(fù)制和產(chǎn)毒能力。該病毒能在HeLa細(xì)胞和A549細(xì)胞中復(fù)制并產(chǎn)生子代病毒(圖20，圖21);但病毒的“毒力”明顯減弱，原因還有待研究，這種復(fù)制性的腺病毒載體用作疫苗載體可能具有更好的免疫效果。完成了重組腺病毒Ad5-CMV-EGFP_E1AB+的ElA表達(dá)鑒定重組腺病毒Ad5-CMV-EGFP_E1AB+感染HeLa細(xì)胞(M0I 5)，24小時(shí)后收獲細(xì)胞，裂解，Western blot證明有ElA的表達(dá)(圖22)，一抗為Ad5 ElA單克隆抗體M58 (Abeam,ab76552)。同時(shí)將dl309和復(fù)制缺陷型Ad5-CMV_EGFP以相同的MOI感染HeLa細(xì)胞，分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了第3部分構(gòu)建的HeLa/pGK-ElAElB穩(wěn)定細(xì)胞株中，也有ElA蛋白的表達(dá)(圖22泳道E)，雖然HeLa/pGK-ElAElB細(xì)胞株中ElA的表達(dá)量較低，但仍然能夠支持復(fù)制缺陷型腺病毒的復(fù)制。Western blot的鑒定,有力的證明了構(gòu)建的重組腺病毒Ad5-CMV-EGFP-E1AB+的復(fù)制，是由于插入的pGK_ElAElB片段造成的。將PCR-Targeting技術(shù)用于pFG140腺病毒基因組質(zhì)粒中IVa2基因的敲除取得成功(圖23)，測(cè)序正確(圖24)。表明所建立的PCR-Targeting技術(shù)成功地用于質(zhì)粒載體上的病毒基因組任意位點(diǎn)的改造，為大基因組病毒載體的定向改造提供了有效的新技術(shù)。完成了 IVa2基因缺失的重組腺病毒Ad5 A IVa2 (1104)的拯救及鑒定將腺病毒感染性克隆pFG 140以及缺失IVa2基因的重組質(zhì)粒pFG140-AIVa2(1104)分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，前者獲得了重組病毒AdpFG140，但后者沒有觀察到重組病毒的產(chǎn)生(圖25A，B)。將pAAV2neo-IVa2與pFG140_ A IVa2 (1104)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，觀察到細(xì)胞病變(圖25C)。將病變的HEK293細(xì)胞凍融裂解，離心后取上清分別感染HEK293和轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo-IVa2質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，結(jié)果只在轉(zhuǎn)染pAAV2neo_IVa2質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞能觀察到細(xì)胞病變，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上未出現(xiàn)病變(圖2 ，E)，說明獲得了重組腺病毒Ad5AIVa2(1104)。以缺失的IVa2兩端骨架序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定，AdpFG140 (IVa2基因完整的腺病毒)能擴(kuò)增出1314bp的DNA片段，而IVa2缺失的重組腺病毒Ad5AIVa2(1104)只能擴(kuò)增出1089bp的片段(圖26)，符合預(yù)期。將Ad5 A IVa2 (1104)和AdpFG140分別感染HEK293細(xì)胞，前者檢測(cè)不到IVa2的表達(dá)，而后者則能檢測(cè)到(圖27)。建立了 HEK293_IVa2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株將pAAV2neo-IVa2 導(dǎo)入 HEK293 細(xì)胞，G418 篩選獲得了 HEK293_IVa2 穩(wěn)定細(xì)胞株。將IVa2基因缺失的重組病毒Ad5 A IVa2 (1104)感染HEK293_IVa2細(xì)胞后，能觀察到細(xì)胞病變，但Ad5AIVa2(1104)感染HEK293細(xì)胞，觀察不到細(xì)胞病變。說明HEK293_IVa2細(xì)胞能支持IVa2基因缺失的重組腺病毒的復(fù)制。 構(gòu)建了含El和ElA表達(dá)盒的穿梭質(zhì)粒pDC316-RFP_El(圖7)和PDC316-RFP-E1A(圖28)。構(gòu)建了 IVa2基因缺失的腺病毒骨架質(zhì)粒pBHG A IVa2(圖10)。缺失的IVa2基因序列為IVa2基因的524至1627位序列,共1104bp。pAAV2neo-IVa2 載體PCR 擴(kuò)增 pBHGlox (delta) El，3Cre :5519_7146bp 片段插入到pAAV2neo中，引物中增加kozak序列。圖5見pAAV2-neo_IVa2帶kozak序列。pBHGlox (delta) El, 3Cre 缺失 IVa2 基因，同時(shí)去掉 Kan 表達(dá)盒的，見 pBHG (delta)IVa2。構(gòu)建pGK-El-SV40LpolyA 表達(dá)盒，圖 13B 見 18TS-pGK-El_SV40LpA。


圖I 5型腺病毒的基因組的示意圖。圖2 pFG140的基因的示意圖。圖3pAK的質(zhì)粒圖。圖4基于入-RED重組酶系統(tǒng)的PCR打靶方法直接在腺病毒基因組上進(jìn)行IVa2基因1140bp序列的精確缺失的方法的示意圖。圖5pAAV2neo_IVa2 的質(zhì)粒圖。圖6IVa2 基因缺失的構(gòu)建策略。A :Lane I pFG140-A IVa2 (1104), Lane 2 pFG140_ A IVa2 (1104) digest with Swa I，Lane 3 PCR product of kanamycincassette, Lane 4 pFG140 digest with HindIII， Lane 5 pFG140-AIVa2(1104)digestwith HindIII ;B !sequencing of pFG140-AIVa2 (1104)prove the deletion of IVa2圖7pDC316-RFP-El，帶 El 的穿梭質(zhì)粒。先將 18TS-pGK-El_SV40LpA 中的 Pacl 改造為NheI，然后插入到TOC316-RFP的XbaI酶切位點(diǎn)。圖8pFG140的質(zhì)粒圖。圖9pFG140/ A IVa2 的質(zhì)粒圖。pFG140/ A IVa2 與 pFG140/ A IVa2 kan 是一致的，kan表示該質(zhì)粒是卡那霉素抗性陽性的。A與delta是一致的，表示該基因缺失的含義。PFG140缺失IVa2基因，但還留有Kan表達(dá)盒的，在pFG140(delta)IVa2 Kan中。該質(zhì)粒也是已經(jīng)出毒的質(zhì)粒。圖10 HindIII酶切鑒定IVa2基因缺失的腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGAIVa2的電泳圖。I pBHGlox (delta) El, 3Cre HindIII 酶切；2 :pBGH A IVa2 (k) HindIII 酶切；3 :pBGHA IVa2HindIII 酶切；M :DL15000。圖llpDC316-RPF_El與pBHG共轉(zhuǎn)染的，出現(xiàn)的毒斑。圖12pAAV2neo_100K，IVa2 的構(gòu)建和鑒定。其中，圖 A 為 pAAV2neo_100K 和/或pAAV2neo-IVa2的質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖B為pAAV2neo_100K，IVa2的酶切電泳鑒定圖，I泳道pAAV2neo SmaI 酶切；2 泳道pAAV2neo-100K SmaI 酶切鑒定；3 泳道pAAV2neo_IVa2SmaI
酶切鑒定。圖13 表達(dá)質(zhì)粒 pPGK-ElAElB 和 pPGK-ElA 的結(jié)構(gòu)圖。圖 A 為pPGK_ElA，質(zhì)粒圖中標(biāo)示為18TS-pGK-ElA-SV40LPA ;圖B為pPGK_ElAElB，質(zhì)粒圖中標(biāo)示為18TS-pGK-El-SV40LPA。 圖14非復(fù)制的Ad5_EGFP感染HeLa和HeLa/PGK_ElAElB細(xì)胞。上行圖為HeLa細(xì)胞，上左圖為未感染病毒，上中和上右為感染非復(fù)制的Ad-EGFP的普通光鏡和熒光顯微鏡。下行圖為HeLa/PGK-ElAElB細(xì)胞，下左圖為未感染病毒，下中和下右為感染非復(fù)制的Ad-EGFP的普通光鏡和熒光顯微鏡。圖I5Ad5-EGFP 在 HeLa 和 HeLa/pPGK-ElAElB 細(xì)胞的傳代。圖16E1基因摘入腺病韋基因組E3區(qū)不意圖。圖 17pBHG-pGK_ElAElB 質(zhì)粒的酶切鑒定。Lane I :BamH I 酶切鑒定；Lane 2 HindIII酶切鑒定。圖18Ad5-CMV-EGFP-ElAB+病毒的拯救。圖19重組病毒Ad5-CMV-EGFP-E1AB+的PCR鑒定。以腺病毒E3區(qū)兩端DNA序列設(shè)計(jì)引物，A 以Ad5-CMV-EGFP-E1AB+基因組為模板，B :以復(fù)制缺陷型Ad5-CMV_EGFP基因組為模板。圖20Ad5-CMV-EGFP_ElAB+ 在 HeLa 細(xì)胞中復(fù)制和傳代。圖21Ad5-CMV-EGFP-EIAB+ 能在 A549 細(xì)胞中復(fù)制。A :Ad5-CMV-EGFP_EIAB+ 感染A549 細(xì)胞，MOI 0. 01 ；B :復(fù)制缺陷型 Ad5-CMV_EGFP 感染 A549 細(xì)胞，MOI 0. 01。圖 22Western blot 鑒定 ElA 的表達(dá)。A HEK 293 細(xì)胞；B Ad5-CMV-EGFP-ElAB+感染HeLa細(xì)胞；C :復(fù)制缺陷型Ad5-CMV_EGFP感染HeLa細(xì)胞；D dl309感染HeLa細(xì)胞；E HeLa/pGK-ElAElB 細(xì)胞株；F =HeLa 細(xì)胞。圖 23pFG140 A IVa2(1104)的酶切鑒定。A pFG140 A IVa21# ；B pFG140 A IVa22# ；C pFG140 A IVa21#SwaI 酶切；D pFG140 A IVa2 2#SwaI 酶切；E Kan cassettePCR產(chǎn)物；F pFG140HindIII 酶切；G pFG140 A IVa2 l#HindIII 酶切；H pFG140 A IVa22#SwaI 酶切。圖24測(cè)序證明pFG140 A IVa2在預(yù)期位置缺失了 IVa2基因。圖25 重組病毒 Ad5AIVa2(1104)的拯救(100X)。A :pFG140 轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞；B pFG140 A IVa2(1104)轉(zhuǎn)染 HEK29 細(xì)胞；C pAAV2neo-IVa2and pFG140-A IVa2 (1104)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞；D :轉(zhuǎn)染pAAV2neo_IVa2的HEK293細(xì)胞感染C的細(xì)胞裂解產(chǎn)物；E HEK293細(xì)胞感染C的細(xì)胞裂解產(chǎn)物。圖26重組腺病毒Ad5AIVa2(1104)的PCR鑒定。以缺失的IVa2兩端骨架序列設(shè)計(jì)引物。I :以腺病毒AdpFG140基因組為模板，得到1314bp的PCR產(chǎn)物；2 :以腺病毒Ad5AIVa2(1104)基因組為模板(IVa2gene被刪除)，得到1089bp的PCR產(chǎn)物。
圖 27Western blot 檢測(cè) IVa2 的表達(dá)。I :pAAV2neo_IVa2 轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞；2 AdpFGHO 感染 HEK293 細(xì)胞；3 Ad5 A IVa2 (1104)感染 HEK293 細(xì)胞；4 HEK293 細(xì)胞。圖28pDC316-RFP_ElA 質(zhì)粒圖。圖29E1表達(dá)盒通過pDC316插入到El區(qū)后拯救的復(fù)制型腺病毒在HeLa細(xì)胞上傳毒。以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明中所述的“ー種IVa2基因功能缺失的重組腺病毒載體及制備方法”及其具體過程做了詳盡的說明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。本案的實(shí)施過程中所使用的實(shí)驗(yàn)材料包括載體、菌株、細(xì)胞和試劑等。其中，質(zhì)粒 pET30a(+)購自 Novagen 公司，pFG140 購自 Microbix 公司，pDM18_T 購自 Takara 公司，pAAV2-neo載體由北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所提供。含有表達(dá)Red重組酶pIJ790質(zhì) 粒的大腸桿菌BW25113,由德國(guó)Tuebingen大學(xué)Bertolt Gust博士惠贈(zèng)，感受態(tài)ElectroMAXtmDHIOB購自Invitrogen公司。HEK 293細(xì)胞購自ATCC，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)。Taq DNA聚合酶和高保真的Pyrobest DNA聚合酶購自Takara公司，L-阿拉伯糖購自Merck公司，各種內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購自NEB公司。引物合成和測(cè)序都在Invitrogen公司完成。DNA純化和膠回收試劑盒購自天根公司。PR0-PREP 蛋白提取溶液購自賽百盛。轉(zhuǎn)染試劑 Lipofactamine2000 購自 Invitrogen 公司。IVa2 小鼠多抗購自 Abeam(ab21939),IRDye 800標(biāo)記的羊抗鼠ニ抗購自Rockland公司。實(shí)施例I模板質(zhì)粒pAK的構(gòu)建首先構(gòu)建了通用型的PCR模板質(zhì)粒pAK。pAK質(zhì)粒中卡那霉素基因表達(dá)盒的兩端各引入了ー個(gè)SwaI位點(diǎn)。該位點(diǎn)可方便卡那霉素基因表達(dá)盒的切除。圖3為PCR模板pAK結(jié)構(gòu)示意圖。以PET30a(+)載體為模板擴(kuò)增其中的卡那霉素抗性基因表達(dá)盒，在其兩端通過引物引入Swa I酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)識(shí))。引物序列為Kan_F和Kan_R。Kan_F :5' -ATTTAAATACAATAAAACTGTCTGCT-3'Kan_R 5' -ATTTAAATCTTAGAAAAACTCATCGA-3'PCR 擴(kuò)增條件為 94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18_T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOB后用氨芐青霉素和卡那霉素雙篩選，獲得雙抗性的克隆命名為pAK，送Invitrogen公司測(cè)序分析插入的卡那霉素抗性基因表達(dá)盒及兩側(cè)的Swa I酶切位點(diǎn)。實(shí)施例2 pFG140-AIVa2(1104)的獲得，見圖 2用質(zhì)粒PFG140 (見圖8，是ー個(gè)腺病毒感染性克隆，細(xì)菌質(zhì)粒骨架插在El基因中)證明缺失IVa2基因后，在反式提供IVa2功能情況下可以拯救出重組腺病毒。與pFG140相關(guān)的研究是ー個(gè)驗(yàn)證過程，不是最終的發(fā)明產(chǎn)品形式。缺失IVa2 基因的 pFG140(留有 Kan 表達(dá)盒)的結(jié)構(gòu)，見 pFG140 (delta) IVa2 Kan。該質(zhì)粒也可用于重組產(chǎn)生腺病毒。具體地，以Del_IVa2_F和Del_IVa2_R為引物，以Xmn I線性化的pAK質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了用于靶向性缺失IVa2基因的線性DNA片段。片段中的卡那霉素基因，用于重組子的篩選，兩端通過引物引入了 39bp的同源臂。將pFG140和該線性DNA片段先后轉(zhuǎn)化到BW5113/pIJ790后用氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性篩選出重組克隆(圖4)。用Swa I及HindIII進(jìn)行酶切鑒定，挑選出正確的重組子pFG140-AIVa2(1104)。結(jié)果表明，用Swa I酶切pFG140-A IVa2(1104)能切出870bp片段，長(zhǎng)度與卡那霉素基因片段大小相符。用HindIII分別酶切pFG140和pFG140_ A IVa2 (1104)的結(jié)果顯示兩者帶型僅有一條片段大小有明顯差異(箭頭所指條帶)，前者為應(yīng)為3437bp，而后者為3212bp，與預(yù)期相符。同時(shí)測(cè)序鑒定證實(shí)了腺病毒IVa2被卡那霉素表達(dá)盒重組替換(圖6)。具體地，用于靶向缺失IVa2基因的線性DNA片段的制備由于IVa2的5'端I至521位與E2B基因的3'端重疊，因此我們?cè)O(shè)計(jì)缺失的IVa2基因序列為524至1627位序列。引物序列為Del_IVa2_F和 Del_IVa2_R。Del_IVa2_F 5' -CTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGTGTCTTGCTGTCTATTTAAATACAATAAAACTG-3'Del_IVa2_R 5' -GCGAAACGAGGAGATATGCTGGATCGAGATGCCGTAGAGTATTTAAATCTTAGAAAA~3/每條引物由39bp的IVa2基因同源臂(下劃線標(biāo)示)和18或20bp與pAK質(zhì)粒DNA模板上的卡那霉素抗性基因表達(dá)盒兩側(cè)序列的互補(bǔ)序列組成。以Xmn I線性化pAK質(zhì)粒DNA為模板用PCR方法獲得靶向缺失IVa2基因的線性DNA片段。PCR條件為94°C預(yù)變性 5min;94°C 30s, 45°C 30s, 72°C lmin，10 個(gè)循環(huán)；94で 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，20 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物膠回收純化。實(shí)施例3入-Red重組酶介導(dǎo)的同源重組本實(shí)施例介紹了用PCR-Targeting方法敲除腺病毒基因組質(zhì)粒中IVa2基因的過程。挑取新鮮活化的BW25113/pIJ790單克隆，30°C培養(yǎng)，按文獻(xiàn)M制備電感受態(tài)，將pFG140電轉(zhuǎn)化到 BW25113/pIJ790 中(BioRad 0.2cm 電轉(zhuǎn)杯，2. 5kV，200 Q，25 y F)，涂布 LB 平板(含有25 u g/mL氯霉素，100 u g/mL氨芐青霉素)，30°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，加入終濃度為10mmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)入-Red重組酶表達(dá)，30°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4，按文獻(xiàn)[8]制備電感受態(tài)，取IOOng純化后的PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)至BW25113/pi J790+pFG140細(xì)胞中(BioRad
0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2. 5kV，200 Q , 25 u F),涂布LB平板(含有50 u g/mL卡那霉素，100 u g/mL氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)過夜。挑取直徑較大的克隆，堿裂解法提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒大小符合預(yù)期的克隆，Swa I和HindIII分別酶切鑒定。酶切鑒定正確的克隆，進(jìn)ー步進(jìn)行測(cè)序鑒定。流程見圖4。實(shí)施例4IVa2表達(dá)載體pAAV2neo_IVa2的構(gòu)建和表達(dá)為了反式提供pFG140-A IVa2(1104)缺失的IVa2功能，拯救IVa2缺失的重組腺病毒，以IVa2_F和IVa2_R為引物擴(kuò)增IVa2 ORF全長(zhǎng)并插入到pAAV2neo載體中，獲得了IVa2的表達(dá)質(zhì)粒pAAV2neo-IVa2 (圖5)。將該質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48h后，用Westernblot方法檢測(cè)到了 IVa2蛋白的表達(dá)(圖27)。圖5為pAAV2neo-IVa2結(jié)構(gòu)示意圖。pAAV2neo_IVa2 (帶 kozak 序列的)載體的構(gòu)建PCR 擴(kuò)增 pBHGlox (delta)El, 3Cre :5519_7146bp片段摘入到pAAV2neo中，引物中增加kozak序列。圖5可見pAAV2-neo-IVa2 (帶 kozak 序列)。PCR擴(kuò)增的引物序列、
IVa2 FATAGAATTCGCGCCACCATGGAAACCAGAGGTAAG (EcoR I)IVa2 R GATGTCGACTTATTTAGGGGTTTTGCG(Sal I)另外，以pFG140為模板，以IVa2_F-wo kozak和IVa2_R :和IVa2_R為引物擴(kuò)增IVa2完整ORF (不攜帶kozak序列)。IVa2_F-wo kozak :5' -ATAGAATTCGGCTCATGGAAACCAGAG-3' (EcoRI)IVa2_R:5' -GATGTCGACTTATTTAGGGGTTTTGCG-3' (Sail)IVa2_F_wo kozak是用于擴(kuò)增不攜帶kozak序列的IVa2的上游PCR引物,wo kozak是不攜帶kozak序列的意思。 經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切插入到表達(dá)載體pAAV2neo載體中。Sma I酶切鑒定正確的克隆，再進(jìn)行測(cè)序鑒定?？寺∶麨閜AAV2neo-IVa2_wo kozak。構(gòu)建的pAAV2neo_IVa2或者pAAV2neo-IVa2_wo kozak這2種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK293 和 HeLa 細(xì)胞中，獲得 HEK293_IVa2 和 HeLa_IVa2 細(xì)胞及 HEK293-IVa2_wo kozak 和HeLa-IVa2-wo kozak細(xì)胞。用于反式互補(bǔ)缺失的IVa2基因功能。其中HEK293_IVa2細(xì)胞和HEK293-IVa2-wo kozak細(xì)胞既有El基因功能又有IVa2基因功能；HeLa_IVa2細(xì)胞和HeLa-IVa2-wo kozak細(xì)胞沒有El基因功能只有有IVa2基因功能。實(shí)施例5重組病毒的拯救和鑒定將腺病毒感染性克隆pFG140以及缺失IVa2基因的重組質(zhì)粒pFG140-AIVa2(1104)分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，前者獲得了重組病毒AdpFG140，但后者沒有觀察到重組病毒的產(chǎn)生(圖25A，B)。說明IVa2基因?qū)τ诋a(chǎn)生重組病毒是必需的。將pAAV2neo_IVa2 與 pFG140_AIVa2(1104)共轉(zhuǎn)染 HEK 293 細(xì)胞后，觀察到細(xì)胞病變(圖250，獲得了重組病毒ム(15八1ぬ2(1104)。病變的HEK293細(xì)胞凍融裂解，離心后取上清分別感染HEK293和轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo-IVa2質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，結(jié)果只在轉(zhuǎn)染pAAV2neo-IVa2質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞能觀察到細(xì)胞病變，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上未出現(xiàn)病變(圖25D, E)。說明 pAAV2neo-IVa2 成功地反式提供了 pFG140_ A IVa2 (1104)缺失的 IVa2 的功能，并且重組病毒Ad5AIVa2(1104)在轉(zhuǎn)染了 pAAV2neo_IVa2質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞上能有效復(fù)制。具體地，將pFG140-A IVa2(1104)與 pAAV2neo_IVa2 用 Lipofactamine2000共轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞，每2 3d換液I次，直至觀察到病毒噬斑及細(xì)胞病變。用pFG140- A IVa2 (1104)與pAAV2neo共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞作為陰性對(duì)照，pFG140轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞作為陽性對(duì)照。陽性對(duì)照拯救的病毒命名為AdpFG140。圖5為重組病毒Ad5 A IVa2(1104)的拯救(100X)。重組病毒的拯救的PCR鑒定以缺失的IVa2兩端骨架序列設(shè)計(jì)引物delIVa2_F和delIVa2_R進(jìn)行PCR鑒定，AdpFG140 (IVa2基因完整的腺病毒)能擴(kuò)增出1314bp的DNA片段，而IVa2缺失的重組腺病毒Ad5 A IVa2(1104)只能擴(kuò)增出1089bp的片段(圖26)，符合預(yù)期。將Ad5AIVa2(1104)和AdpFG 140分別感染HEK293細(xì)胞，前者檢測(cè)不到IVa2的表達(dá)，而后者則能檢測(cè)到(圖27)。圖6重組腺病毒Ad5AIVa2(1104)的PCR鑒定。圖K是Western blot 檢測(cè) IVa2 的表達(dá)。delIVa2_F :5' -ATGTCGTTTCTCAGCAGCTG-3'delIVa2_R :5' -CTACTGCCGTACAGCGAAA-3'
重組病毒的鑒定PCR鑒定發(fā)生病變的細(xì)胞凍融3次，2000rpm離心2min，上清0. 22 y m濾膜過濾。取500 ii L病毒液，加入100U的DNase I 37°C處理30分鐘，然后加入蛋白酶K (終濃度100ug/mL)50°C消化lh，酚氯仿抽提，こ醇沉淀，最后50iiL TE (pH 7.9)溶解。取2 y L提取的病毒基因組為模板，以IVa2缺失片段兩端delIVa2_F和delIVa2_R作為引物，進(jìn)行PCR鑒定，PCR 條件為94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 75s, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0
delIVa2_F :5' -ATGTCGTTTCTCAGCAGCTG-3'delIVa2_R :5' -CTACTGCCGTACAGCGAAA-3'Western blot鑒定將感染重組腺病毒或轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用PR0-PREP 蛋白提取液抽提蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后，IOOmA恒定電流下轉(zhuǎn)膜lh，5%脫脂奶室溫封閉I小時(shí)；將IVa2小鼠多抗I : 1000稀釋，4°C度孵育過夜；PBST洗滌3次，加入I 5000稀釋的IRDye 800標(biāo)記的羊抗鼠ニ抗，室溫避光反應(yīng)Ih ;PBST避光洗滌3次，吸水紙吸干膜上液體，用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行紅外掃描。實(shí)施例6pBHG A IVa2的構(gòu)建用PCR-Targeting方法敲除腺病毒基因組質(zhì)粒pBHGlox (delta)El,3Cre中的IVa2基因。具體過程與實(shí)施例3 —致。在pBHG Ioxp (delta)E3, ICre上缺失掉IVa2基因(1140bp)，獲得 pBHG A IVa2-Kan ；pBHGlox (delta) El，3Cre 缺失 IVa2 基因，同時(shí)去掉 Kan 表達(dá)盒的，見pBHGAIVa2。HindIII 酶切鑒定 pBHG delta IVa2 見圖 10，圖中，I :pBGH HindIII 酶切，2:pBGHdeltaIVa2-kan HindIII 酶切，3 :pBGHdeltaIVa2 HindIII 酶切，M :DL15000。A 的含義與delta —致。實(shí)施例7腺病毒El基因表達(dá)單元的構(gòu)建首先是在pT-simple載體上構(gòu)建四個(gè)酶切位點(diǎn)Pac I-BamHI-XhoI-NheI，它的PCR引物是PBXN F TTAATTAAgcaGGATCCagtCTCGAGtgaGCTAGCa(Pac I-BamH I-Xho I-Nhe I)PBXN_R GCTAGCTCACTCGAGACTGGATCCTGCTTAATTAAA然后擴(kuò)增PGK promoter、SV40LpolyA和El基因等3個(gè)片段。SV40LpolyA 的模板為 pGL4. 14[luc2/Hygro]，擴(kuò)增的目的片段是 1787_2008bp 之間長(zhǎng)度為222bps的片段；El基因的模板為pXCl，擴(kuò)增的目的片段是458-3509bp之間長(zhǎng)度為30522bps的片段；它們所使用的PCR引物序列分別如下PGK promoter 的引物pGK FCTCTTAATTAACCATCGAATTCTACCGGG (Pac I)pGK_R TATGGATCCTCGACGAATTCGGTACC (BamHI)SV40LpolyA 的引物SV40Late_pA_F GACCTCGAGCAGACATGATAAGATAC(XhoI)SV40Late_pA_R CTTGCTAGCTACCACATTTGTAGAGG(NheI)
El基因的引物E1_F AGTGGATCCCGTGTAGTGTATTTATACC(BamHI)E1_RAGTCTCGAGCTCAATCTGTATCTTCAT (XhoI)然后將PGK promoter、El 基因、SV40LpolyA 插入其中，構(gòu)建 PGK-El_SV40LpolyA表達(dá)盒作為El基因表達(dá)單元，圖13A見18TS-pGK-El-SV40LpA。實(shí)施例8將人工設(shè)計(jì)的El基因表達(dá)單元插入腺病毒基因組中將人工設(shè)計(jì)的El基因表達(dá)單元插入腺病毒基因組中，有2種策略I)在穿梭質(zhì)粒PDC316上加入人工構(gòu)建的El基因表達(dá)單元(PGK啟動(dòng)子-ElAElB-SV40polyA)。該質(zhì)粒原來的外源基因表達(dá)單元(mCMV promoter-MCS-SV40polyA)仍然保留,可用于插入外源基因如紅色突光蛋白R(shí)FP。2)在ロ8邢1( ((161セ&化3，106的￡3缺失位置上插入￡1基因表達(dá)單元(PGK啟動(dòng)子-E1AE1B-SV40 poIyA)。實(shí)施例9可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體系統(tǒng)組建最終的可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體系統(tǒng)組成有2套系統(tǒng)，它們均可以分別進(jìn)行所述的病毒包裝制備第一套系統(tǒng)，包括以下3個(gè)要素組成I)病毒包裝細(xì)胞(其中包括但不限于HeLa_IVa2細(xì)胞)；2) pBHG A IVa2 ；3)pDC316-MCS-(PGK-El_polyA) (El 表達(dá)單元插在原 El 區(qū))。在這套系統(tǒng)里，El表達(dá)盒通過pDC316插入到原El區(qū)，這系統(tǒng)的3個(gè)要素共同作用后拯救的復(fù)制型腺病毒在HeLa細(xì)胞上傳毒。第二套系統(tǒng)，包括以下3個(gè)要素組成I)病毒包裝細(xì)胞(其中包括但不限于HeLa_IVa2細(xì)胞)；2)pBHG AIVa2(PGK-El-polyA)；3) pDC316 (El表達(dá)單元插在原E3區(qū))。在這套系統(tǒng)里，El表達(dá)盒通過pDC316插入到原E3區(qū)，這系統(tǒng)的3個(gè)要素共同作用后拯救的復(fù)制型腺病毒在HeLa細(xì)胞上傳毒。帶El 的穿梭質(zhì)粒，圖 7 見 pDC316-RFP-El。先將 18TS-pGK-El_SV40LpA(見圖 13B)中的PacI改造為NheI，然后插入到TOC316-RFP的XbaI酶切位點(diǎn)。圖11為pDC316-RPF-El與pBHG共轉(zhuǎn)染的，出現(xiàn)的毒斑。參考文獻(xiàn)[I]Tatsis N,Ertl H C. Adenoviruses as vaccine vectors[J]. Mol Ther,2004,10(4) :616-29.[2] Prem S. Adenoviruses Basic biology to gene therapy [M]. U S A:R. G. Iandes company, 1999 :91-101.[3]Robert-Guroff M. Replicating and non-replicating viral vectors forvaccine development[J]. Curr Opin Biotechnol,2007,18 (6) :546-56[4]Flint S J. Regulation of adenovirus mRNA formation[J]. Adv Virus Res,1986,31 :169-228
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權(quán)利要求
1.本發(fā)明描述了一種可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，該可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體系統(tǒng)中，腺病毒缺失了IVa2基因的大部分(1140bp)，使病毒不能產(chǎn)生子代病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求I，在原來El和E3基因缺失的基礎(chǔ)上，插入人工構(gòu)建的El基因(E1A，ElB)表達(dá)單元，使病毒獲得基因組復(fù)制能力。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體包裝系統(tǒng)，其中一種形式是構(gòu)成該系統(tǒng)的 3 個(gè)要素為HeLa-IVa2 細(xì)胞；pBHG A IVa2 ；pDC316-MCS- (PGK-EI-poIyA) (El 表達(dá)單元插在原El區(qū))。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，可復(fù)制不產(chǎn)毒的腺病毒載體包裝系統(tǒng)，其中一種形式是構(gòu)成該系統(tǒng)的 3 個(gè)要素為HeLa-IVa2 細(xì)胞，pBHG A IVa2 (PGK-E I-po IyA)，pDC316(El 表達(dá)單元插在原E3區(qū))。
6.用途是疫苗載體和腫瘤基因治療，特點(diǎn)是可以用較少劑量達(dá)到更高劑量的效果，減少針對(duì)載體的免疫反應(yīng)。
全文摘要
一種IVa2基因功能缺失的重組腺病毒載體及制備方法。本案建立了一種保留腺病毒基因組復(fù)制能力而阻斷其產(chǎn)生子代病毒能力的新型腺病毒載體系統(tǒng)，采用了保留E1基因功能而缺失IVa2基因的策略，通過基因操作手段獲得一種能表達(dá)E1基因而不能表達(dá)IVa2基因的新型腺病毒載體。本發(fā)明還描述了獲得這種新型腺病毒載體的方法及其用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102732561SQ20111008876
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者吳小兵, 柳云帆, 董小巖, 阮力 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司