專利名稱：丹參酮ⅱa或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丹參酮IIA的新應(yīng)用，尤其是涉及丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺高血壓病具有病因復(fù)雜、發(fā)病率高、誤診率高、危害性強(qiáng)、死亡率高的特點(diǎn)，其主要臨床表現(xiàn)為平均肺動(dòng)脈大于或等于25mmHg。肺高血壓早期常無明顯自覺癥狀，有時(shí)雖然肺動(dòng)脈高壓已引起右心室肥厚及慢性高壓性肺源性心臟病，但癥狀并不一定顯著，而多在 20 40歲間才逐漸出現(xiàn)氣急、乏力、呼吸困難或有咯血、心悸、聲音嘶啞等癥狀。由于心排血量降低，可有四肢寒冷、脈搏細(xì)小、周圍性紫紺、心絞痛、暈厥等，紫紺在早期常不嚴(yán)重，但在有右至左分流的情況下卻可出現(xiàn)顯著的紫紺。傳統(tǒng)治療的方法包括抗凝、地高辛和吸氧， 但是效果都不理想。丹參為唇形科植物丹參feidix Salvia Miltiorrhiza bge.的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦，性微寒，具有破癥除瘕，止煩滿，益氣等功效，列為上品，歸心、肝二經(jīng)，歷代本草均有收載。丹參酮IIA，是從中藥丹參中提取出的有效單體，其分子式是 C19H18O3,目前臨床主要應(yīng)用于治療心血管疾病方面，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制左心室肥厚、抗心肌缺氧、改善血管平滑肌狀態(tài)、抗心律失常等作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽的新用途，即丹參酮 IIA及其衍生物在制藥中的新應(yīng)用。具體地，本發(fā)明目的在于提供丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病的藥物中的應(yīng)用。而肺高血壓疾病根據(jù)不同的病因分為以下幾種不同的類型1 肺動(dòng)脈高壓??；2 左心疾病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓??；3 與呼吸系統(tǒng)疾病和/或缺氧相關(guān)的肺高血壓??；4 慢性血栓栓塞性肺高血壓??；5 未明確的多種因素所致肺高血壓病。盡管上述幾種類型的肺高血壓疾病的發(fā)病機(jī)理不同，但是經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，它們都會(huì)導(dǎo)致肺高血壓病患者的上氣道阻塞，從而造成肺組織的慢性缺氧，此機(jī)制被認(rèn)為是肺部血管收縮增強(qiáng)和血管重塑的主要誘因。研究發(fā)現(xiàn)，肺小動(dòng)脈的異常增生和持續(xù)性血管收縮是造成肺高血壓的重要因素，而肺血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度失衡是肺高血壓發(fā)病的關(guān)鍵因素，正是由于細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的增加引起細(xì)胞收縮及平滑肌細(xì)胞增殖，從而引起肺血管的壓力持續(xù)性升高，造成血管重塑，最終導(dǎo)致肺高血壓。而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加主要是通過以下幾種途徑(1)細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)釋放Ca2+ ；⑵Ca2+從細(xì)胞外液通過L型電壓依賴Ca2+通道(VDCC)，受體操縱性Ca2+ 通道(ROCC)以及鈣池操縱性Ca2+通道(SOCC)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)低氧時(shí)SOCC 上調(diào)才是引起平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子失衡的主要原因。
本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠抑制低氧引起的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高、作用于SOCC通道降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、能通過影響TRPC6mRNA的表達(dá)而影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、能降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPCl蛋白的表達(dá)、有效降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPC6蛋白的表達(dá)、有效降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠右心室壓以及有效抑制肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的右心代償性增生以及能夠降低低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的肺小血管平滑肌層的病理改變，說明丹參酮IIA 或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠用于治療上述各類型的肺高血壓疾病。因此實(shí)際上，本發(fā)明涉及丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為制備治療或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓病的藥物中的應(yīng)用。涉及丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為制備治療或預(yù)防左心疾病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓病的藥物中的應(yīng)用。涉及丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為制備治療或預(yù)防與呼吸系統(tǒng)疾病和/或缺氧相關(guān)的肺高血壓病的藥物中的應(yīng)用。涉及丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為制備治療或預(yù)防慢性血栓栓塞性肺高血壓病的藥物中的應(yīng)用。涉及丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為制備治療或預(yù)防未明確的多種因素所致肺高血壓病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽可單獨(dú)使用或以藥物組合物的形式使用，所述的藥物組合物包括丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽類以及藥物載體。所述的藥物組合物中還可以包括丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽類以及藥物載體與前列環(huán)素及其類似物(如依前列醇)、內(nèi)皮素-1受體拈抗劑(如波生坦)及5型磷酸二酯酶抑制劑(如西地那非)中的一種或多種組成的治療肺高血壓疾病的藥物組合。所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽的治療有效量是為個(gè)體給藥后產(chǎn)生降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和降低肺動(dòng)脈壓等活性作用的劑量。而給予個(gè)體單劑或多劑量時(shí)， 給藥劑量根據(jù)多種因素而不同，包括丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、給藥途徑、患者情況何特性(性別、年齡、體重、健康情況、體型)、癥狀程度、并存的治療、治療頻率和期望的效果。通常情況下，所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽單獨(dú)用藥即可達(dá)到治療的效果。所述丹參酮IIA或其衍生物作為活性成分作用于個(gè)體的每次劑量為40 SOmg/ 次，一天兩次，就可達(dá)到顯著降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、降低肺動(dòng)脈壓、抑制肺動(dòng)脈高壓導(dǎo)致的右心代償性增生和降低肺小血管平滑肌層的病理改變的期望的有效治療效果。所述的丹參酮IIA及其藥物學(xué)上可接受的鹽可由多種途徑進(jìn)行個(gè)體給藥，給藥途徑包括口服、靜脈注射等。相應(yīng)地，所述的丹參酮IIA或其衍生物可以與可藥用載體制備成口服制劑和注射劑。其中，口服制劑包括片劑、膠囊劑、微膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、滴丸、 口服液和散劑。注射劑包括靜脈注射劑和粉針劑。還可以根據(jù)劑型需要可配以不同的可藥用載體，同時(shí)可加入抗氧化劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防霉劑。本發(fā)明的有益效果如下1.本發(fā)明對已知化合物丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
2.丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽對肺高血壓有良好的治療作用，安全性良好，具有很好的應(yīng)用前景。而丹參酮IIA及其藥物學(xué)上可接受的鹽類與目前臨床上用的治療肺高血壓的藥物相比，價(jià)格便宜，極具市場前景。


圖1是用鈣離子實(shí)時(shí)顯像技術(shù)方法檢測丹參酮IIA對原代培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣的影響，P < 0. 05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2是用鈣離子實(shí)時(shí)顯像技術(shù)方法檢測丹參酮IIA對原代培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)SOCE峰值的影響，P < 0. 01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3是用RT-PCR方法檢測丹參酮IIA對原代培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi) TRPClmRNA表達(dá)量的影響，P < 0. 05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4是用RT-PCR方法檢測丹參酮IIA對原代培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi) TRPC6mRNA表達(dá)量的影響，P < 0. 05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5用western-blot方法檢測丹參酮IIA對肺動(dòng)脈高壓大鼠模型肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPCl蛋白表達(dá)量的影響，P < 0. 05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖6用western-blot方法檢測丹參酮IIA對肺動(dòng)脈高壓大鼠模型肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPC6蛋白表達(dá)量的影響，P < 0. 05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖7用western-blot方法檢測丹參酮IIA對肺動(dòng)脈高壓大鼠模型肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPC1、TRPC6的蛋白表達(dá)電泳圖。圖8是用丹參酮IIA進(jìn)行藥物干預(yù)對肺動(dòng)脈高壓大鼠模型右心室平均壓的影響， P<0. 05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖9是用丹參酮IIA進(jìn)行藥物干預(yù)對肺動(dòng)脈高壓大鼠模型右心肥厚指數(shù)的影響， P <0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖10是用丹參酮IIA進(jìn)行藥物干預(yù)對肺動(dòng)脈高壓大鼠模型肺組織HE染色結(jié)果A 常氧對照組的大鼠肺組織切片HE染色結(jié)果，箭頭示肺小動(dòng)脈，管壁未見增生， 管腔未見狹窄；B 常氧上藥組的大鼠肺組織切片HE染色結(jié)果，箭頭示肺小動(dòng)脈，與常氧對照組未見差異；C 低氧(10% O2)對照組的大鼠肺組織切片HE染色結(jié)果，箭頭示肺小動(dòng)脈，可見肺小動(dòng)脈管壁和平滑肌層明顯增厚，管腔狹窄；D 低氧(10% O2)上藥組的大鼠肺組織切片HE染色結(jié)果，肺形態(tài)學(xué)變化與低氧對照組比較明顯減輕。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)行說明丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在醫(yī)藥領(lǐng)域中的新用途，但是以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的目的，并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠抑制低氧引起的細(xì)胞內(nèi)鈣濃
度升高材料及方法
一、主要實(shí)驗(yàn)材料1、SPF級SD大鼠體重200g_250g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心2、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、I型膠原酶美國 Gibico公司3、木瓜蛋白酶、大鼠α-actin單抗Sigma公司4、戊巴比妥鈉廣州化學(xué)二廠5、Cy3標(biāo)記羊抗大鼠IgG Jackson公司6、Fura_2 熒光染料Invitrogen 公司二、主要儀器1、鈣離子熒光影像系統(tǒng)=InCyt Iml 公司2、熒光倒置顯微鏡=Nikon公司3、微量移液器Gilson公司三、實(shí)驗(yàn)方法1、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)無菌操作取SD大鼠心肺組織，置于4°C平衡鹽溶液(Hank' s Balanced Salt Solution, HBSS) 0清洗去血漬，體式顯微鏡下用顯微器械分離出肺微小動(dòng)脈。仔細(xì)剝除動(dòng)脈外膜(纖維脂肪層)，后將血管條縱向剪開，內(nèi)面朝上用彎頭小鑷子自上而下刮除內(nèi)膜。 將中膜組織置于消化液(消化液成分為1750U/ml I型膠原酶，9. 5U/ml木瓜蛋白酶，2mg/ml 牛血清白蛋白，ImM 二硫蘇糖醇，溶于無鈣離子的HBSS液)中在35 37°C消化15-20min， 至組織塊松軟、邊緣發(fā)毛，呈一定程度的破碎狀；加入10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中和消化液，離心，吸除上清液，加PBS清洗1次并離心，吸除上清液，再加入新的混合培養(yǎng)基， 使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1 2 X IO5細(xì)胞/ml并種植于培養(yǎng)板，置于37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，3-4天后換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。2、低氧細(xì)胞模型的制作將培養(yǎng)獲得的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分為四組常氧對照組細(xì)胞，常氧上藥組， 低氧對照組和低氧上藥組，其中低氧對照組和低氧上藥組置于低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(37°C、5% CO2,4% O2)培養(yǎng)60小時(shí)。常氧上藥組和低氧上藥組均用10mg/L丹參酮IIA磺酸鈉進(jìn)行藥物干預(yù)，常氧對照組和低氧對照組加生理鹽水。3、測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測鈣前將各組得到的原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞用0. 3%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時(shí)后， 加入5μΜ Fura-2,37°C,5% CO2孵育1小時(shí)，用鈣離子熒光影像系統(tǒng)對細(xì)胞內(nèi)鈣濃度進(jìn)行測量。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，常氧對照組細(xì)胞基礎(chǔ)鈣為130. 63士 16. 06nM，常氧上藥組細(xì)胞基礎(chǔ)鈣為98. 05士 10. 91nM;低氧對照組細(xì)胞基礎(chǔ)鈣(4% 02,60h)為237. 12士40. 13nM， 低氧上藥組細(xì)胞基礎(chǔ)鈣(4% 02，60h，10mg/L丹參酮IIA磺酸鈉)為103. 05士20. 20nM。結(jié)論丹參酮IIA能夠抑制低氧引起的細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣濃度的升高。實(shí)施例二丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠作用于SOCC通道降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度
材料及方法一、主要實(shí)驗(yàn)材料1、SPF級SD大鼠體重200g_250g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心2、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、I型膠原酶美國 Gibico公司3、戊巴比妥鈉廣州化學(xué)二廠4、木瓜蛋白酶、CPA、硝苯地平Sigma公司5、Fura_2 熒光染料Invitrogen 公司二、主要儀器1、鈣離子熒光影像系統(tǒng)InCyt Iml 公司2、熒光倒置顯微鏡=Nikon公司3、微量移液器Gilson公司三、實(shí)驗(yàn)方法1、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)同實(shí)施例一。2、低氧細(xì)胞模型的制作同實(shí)施例一。3、測細(xì)胞內(nèi)SOCE的變化測鈣前將各組得到的原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞用0. 3%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時(shí)后， 加入5 μ M Fura-2, 37°C,5% CO2孵育1小時(shí)，依次用有鈣的HPSS液灌流細(xì)胞5分鐘，無鈣的含5uM硝苯地平和IOuM CPA的HPSS液灌流細(xì)胞lOmin，有鈣的含5uM硝苯地平和IOuM CPA的HPSS液灌流細(xì)胞lOmin，有鈣的HPSS液灌流細(xì)胞10分鐘，然后用鈣離子熒光影像系統(tǒng)對細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化進(jìn)行實(shí)時(shí)測量，分析丹參酮IIA對細(xì)胞SOCE變化的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，常氧對照組細(xì)胞SOCE峰值為196. 64士Μ. 44nM，常氧上藥組細(xì)胞SOCE峰值為143. 82 士 13. 20ηΜ，低氧對照組細(xì)胞02，60h，生理鹽水)SOCE峰值為307. 12士5. 47nM，低氧上藥組細(xì)胞(4% 02，60h，10mg/L丹參酮IIA磺酸鈉)SOCE峰值為 119.01士19. 36nM。結(jié)論丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠抑制低氧時(shí)SOCE的上調(diào)，說明丹參酮能夠作用于SOCC通道降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。實(shí)施例三丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽通過影響TRPClmRNA的表達(dá)而影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度材料及方法一、主要實(shí)驗(yàn)材料1、SPF級SD大鼠體重200g_250g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心2、戊巴比妥鈉廣州化學(xué)二廠3、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、I型膠原酶美國 Gibico公司5、木瓜蛋白酶Sigma公司6、Trizol :Invitrogen 公司
7、PrimeScript RT reagent Kit／aKaRa公司
8、SsoFast gvaGreen SupermixBiorad公司
二、主要儀器
l、微量移液器Gilson公司
2、普通PCR儀、CgX96熒光定量PCR儀Biorad公司
三、實(shí)驗(yàn)方法
l、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)
同實(shí)施例一。
2、低氧細(xì)胞模型的制作
方法與實(shí)施例一相同，常氧上藥組和低氧上藥組均用5mg／L丹參酮IIA磺酸鈉進(jìn)行藥物干預(yù)，常氧對照組和低氧對照組加生理鹽水。
3、檢測細(xì)胞中／RPCImRNA表達(dá)的差異
按照／rizol操作手冊提取培養(yǎng)的各組細(xì)胞的總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄過程如下
反應(yīng)體系(20u1)
5~PrimerScript Buffer4ulPrimerScript R丁Enzyme Mix 1 lulOligo Dt PrimerlulRamdom 6 merslulRNase Free dH203ul[o1oo]RNA1000ng(10u1)
將反應(yīng)體系吹打混勻，
反應(yīng)條件
37℃反應(yīng)15min，再在85℃下反應(yīng)5sec。
以／RPCI的引物進(jìn)行R／一PCR檢測
大鼠TRPCI引物正義鏈序列5’一AGCCTCTTGACAAACGAGGA一3’[o106] 反義鏈序列5’一ACCTGACATCTGTCCGAACC一3’[o107] 反應(yīng)體系(15u1)
SsoFast EvaGreen superMix (2x)7.5ul
上游引物(IOuM)0.6ul
下游引物(IOuM)0.6ul
cDNA2ul
H2O4.3ul將反應(yīng)體系吹打均勻，95°C下變性:3min。反應(yīng)條件95°C變性 5sec ；60°C變性 15sec，共 40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，常氧上藥組相對于常氧對照組TRPClmRNA的表達(dá)量為 97. 92士9. 03，低氧對照組相對于常氧對照組的表達(dá)量為178. 86士9. 79，低氧上藥組 02，60h，5mg/L丹參酮IIA磺酸鈉)相對于常氧對照組的表達(dá)量為87. 16士6. 40。結(jié)論丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠降低肺動(dòng)脈高壓細(xì)胞模型 TRPClmRNA的表達(dá)，TRPClmRNA通過翻譯成TRPCl蛋白，而TRPCl蛋白是SOCC鈣通道的組成蛋白，則丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠通過影響TRPClmRNA的表達(dá)而影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。實(shí)施例四丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠通過影響TRPC6mRNA的表達(dá)而影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度材料及方法一、主要實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例三。二、主要儀器同實(shí)施例三。三、實(shí)驗(yàn)方法1、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)同實(shí)施例一。2、低氧細(xì)胞模型的制作同實(shí)施例三。3、檢測細(xì)胞中TRPClmRNA表達(dá)的差異反應(yīng)系統(tǒng)及條件同實(shí)施例三。大鼠TRPC6 引物正義鏈序列5' -TACTGGTGTGCTCCTTGCAG-3 ‘反義鏈序列5'-GAGCTTGGTGCCTTCAAATC-3‘。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，常氧上藥組相對于常氧對照組TRPC6mRNA的表達(dá)量為 126. 10士26. 31，低氧對照組(4% 02，60h)相對于常氧對照組的表達(dá)量為176. 78士 19. 96， 低氧上藥組02，60h，5mg/L丹參酮IIA磺酸鈉)相對于常氧對照組的表達(dá)量為 101. 37 士 7. 32。結(jié)論丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠降低肺動(dòng)脈高壓細(xì)胞模型TRPC6mRNA的表達(dá)，TRPC6mRNA通過翻譯成TRPC6蛋白，而TRPC6蛋白是SOCC鈣通道的組成蛋白，則丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠通過影響TRPC6mRNA的表達(dá)而影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。實(shí)施例五丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠有效降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPCl蛋白的表達(dá)一、主要實(shí)驗(yàn)材料1、兔抗大鼠TRPCl —抗美國Sanda公司2、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ig-G 二抗大連博瑞德公司3、預(yù)染蛋白分子量Marker 美國BIO-RAD公司4、RIPA細(xì)胞裂解液中國碧云天生物技術(shù)研究所5、DC蛋白濃度測定試劑盒美國BIO-RAD公司6、兔抗大鼠actin抗體美國Sigma公司二、主要儀器1、電泳儀美國BIO-RAD公司2、轉(zhuǎn)膜儀美國BIO-RAD公司三、實(shí)驗(yàn)方法1、低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的制作將大鼠分為常氧對照組、常氧上藥組、低氧對照組和低氧上藥組。常氧對照組和常氧上藥組在正常飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)，低氧對照組和低氧上藥組動(dòng)物置于低氧動(dòng)物飼養(yǎng)箱內(nèi)，在 10% O2濃度下飼養(yǎng)21天。常氧上藥組和低氧上藥組每天腹腔注射30mg/kg體重丹參酮IIA 磺酸鈉，常氧對照組和低氧對照組給予相同劑量的生理鹽水。2、肺血管平滑肌組織總蛋白的提取依據(jù)分組分別處死實(shí)驗(yàn)大鼠，顯微分離實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺血管平滑肌層。將平滑肌組織加入蛋白裂解液(預(yù)冷)的EP管中，超聲粉碎后12000rpm 4°C離心20min取上清。上述操作均在冰上進(jìn)行，以避免蛋白降解。蛋白濃度以DC分析法確定。3、樣品蛋白濃度的測定采用DC顯色法，按照DC蛋白濃度測定試劑盒的操作手冊進(jìn)行測定。4、Western blotting(1)制備10%的SDS-聚丙烯酰胺分離膠將下列試劑的混合液加入邊條約2mm的兩塊玻璃制膠板中間，使液面達(dá)加樣梳下緣約Icm處，緩慢加入一層無水乙醇，室溫靜置待其凝膠自然聚合凝集。
丙烯酰胺貯液2.5 ml分離膠緩沖液2.5 ml去離子水4.85 ml10%SDSIOOul10%過硫酸胺50 ulTEMED5ul
分離膠聚合后小心傾棄上層的無水乙醇，去離子水沖洗數(shù)次后用濾紙小心吸干， 再注入濃縮膠。(2)制備4%濃縮膠
丙烯酰胺貯液500ul濃縮膠緩沖液1.26 ml去離子水3.16 ml10%SDS50ul10%過硫酸胺25ulTEMED5ul上述混合液體注入兩層玻璃板之間后，小心插入加樣梳，室溫靜置，待其聚合后小心拔去加樣梳，用電泳緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次以免孔中殘留有凝膠。(3)樣品處理取含等量蛋白的各組樣本，分別加入含β-巰基乙醇的2X蛋白上樣緩沖液混勻， 于沸水中煮5分鐘后迅速放入冰中使蛋白變性。(4)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamidedel gelelectrophoresis, SDS-PAGE)樣品蛋白用SDS-PAGE分離。電泳先用恒壓80V，當(dāng)溴酚藍(lán)行至濃縮膠與分離膠交界處時(shí)，將電壓調(diào)至100V繼續(xù)電泳，在溴酚蘭接近分離膠底部時(shí)結(jié)束電泳。(5)轉(zhuǎn)膜將凝膠上已被電泳分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。卸下膠板，切取含有被分離樣品蛋白的分離膠部分，將濾紙6張和硝酸纖維素膜剪成與膠大小一致，浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中，約lOmin，依次從上到下放置濾紙3張、SDS-PAGE凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙3張，用玻璃棒趕走各層之間的氣泡，放好電極板，進(jìn)行濕式電轉(zhuǎn)移。(6)封閉轉(zhuǎn)移完畢后的膜用5%牛血清封閉過夜。(7)雜交與洗膜封閉后的膜與單克隆兔抗小鼠TRPC6(I抗)4°C雜交孵育lh，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)室溫孵育雜交lh?？贵w均用抗體緩沖液適當(dāng)稀釋，雜交時(shí)輕搖抗體使之與膜均勻、充分接觸，每次雜交完畢均用TTBS洗去殘余未結(jié)合抗體。(8)化學(xué)發(fā)光與曝光將硝酸纖維素膜浸于DAB顯色液中，于暗處觀察，觀察有清晰的特異條帶出現(xiàn)時(shí)， 用大量的水沖洗硝酸纖維素膜以終止顯色反應(yīng)。5、結(jié)果條帶分析用凝膠成像系統(tǒng)將瓊脂糖電泳圖和Western blotting曝光膠片進(jìn)行圖像掃描及條帶光密度半定量分析。為消除掃描和分析中的誤差，重復(fù)三次該過程，采用SPASS13.0軟件分析結(jié)果，組間比較采用單因素方差分析，P < 0. 05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)結(jié)果如圖5、圖7所示，常氧上藥組相對于常氧對照組TRPCl蛋白的表達(dá)量為1.02士0. 11，低氧對照組(10% 02，21天)相對于常氧對照組的表達(dá)量為1.91 士0. 11， 低氧上藥組(10% O2, 21天，30mg/kg丹參酮IIA磺酸鈉)相對于常氧對照組的表達(dá)量為 1. 43 士 0. 12。結(jié)論丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPCl蛋白的表達(dá)，TRPCl蛋白是SOCC鈣通道的重要組成蛋白，則丹參酮IIA 或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠通過影響TRPCl蛋白的表達(dá)而影響肺動(dòng)脈血管的收縮和重塑。實(shí)施例六丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠有效降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPC6蛋白的表達(dá)—、主要實(shí)驗(yàn)材料1、兔抗大鼠TRPC6 —抗美國Sanda公司2、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ig-G 二抗大連博瑞德公司3、預(yù)染蛋白分子量Marker 美國BIO-RAD公司4、RIPA細(xì)胞裂解液中國碧云天生物技術(shù)研究所5、DC蛋白濃度測定試劑盒美國BIO-RAD公司6、兔抗大鼠actin抗體美國Sigma公司二、主要儀器1、電泳儀美國BIO-RAD公司2、轉(zhuǎn)膜儀美國BIO-RAD公司三、實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例五。試驗(yàn)結(jié)果如圖6、圖7所示，常氧上藥組相對于常氧對照組TRPC6蛋白的表達(dá)量為0. 97士0. 14，低氧對照組(10% 02，21天)相對于常氧對照組的表達(dá)量為2. 48士0. 14， 低氧上藥組(10% O2, 21天，30mg/kg丹參酮IIA磺酸鈉)相對于常氧對照組的表達(dá)量為 1. 72 士 0. 04。結(jié)論丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌組織上TRPC6蛋白的表達(dá)，TRPC6蛋白是SOCC鈣通道的重要組成蛋白，則丹參酮IIA 或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠通過影響TRPC6蛋白的表達(dá)而影響肺動(dòng)脈血管的收縮和重塑。實(shí)施例七丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠有效降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠右心室壓材料及方法一、主要實(shí)驗(yàn)材料1、SPF級SD大鼠體重200g_250g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心2、戊巴比妥鈉廣州化學(xué)二廠3、肝素鈉二、主要儀器1、16通道小動(dòng)物生理儀BI0PAC公司2、小動(dòng)物手術(shù)器械上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠
三、實(shí)驗(yàn)方法1、低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的制作同實(shí)施例五。2、大鼠右心室壓力的測量將實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行麻醉，固定在小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，剪開其頸部皮膚，鈍性分離大鼠頸靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，剪開血管，用2mm 口徑的硅膠管插入血管，進(jìn)入右心室，連通壓力換能器，用小動(dòng)物生理儀對右心室壓、心率進(jìn)行測量。試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，常氧對照組大鼠右心室平均血壓為12. 04士0. 579mmHg, 常氧上藥組大鼠右心室平均血壓為12. 25 士0. 364mmHg，低氧對照組大鼠右心室平均血壓為 26. 58 士0. 812mmHg，低氧上藥組右心室平均血壓為18. 43 士0. 369mmHg。結(jié)論丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠有效降低肺動(dòng)脈高壓模型大鼠右心室壓，可以降低肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈壓。實(shí)施例八丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠有效抑制肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的右心代償性增生材料及方法一、主要實(shí)驗(yàn)材料1、SPF級SD大鼠體重200g_250g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心2、戊巴比妥鈉廣州化學(xué)二廠二、主要儀器1、分析天平梅特勒-托利多公司2、小動(dòng)物手術(shù)器械上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠三、實(shí)驗(yàn)方法1、低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的制作同實(shí)施例五。2、大鼠右心肥厚指數(shù)的測定取各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物心臟，分離其右心室壁及左心室壁，洗去血污，吸干水分，進(jìn)行精
確稱量，右心室壁重量/左心室壁重量即為右心肥厚指數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，常氧對照組大鼠右心肥厚指數(shù)為0. 士0.013，常氧上藥組大鼠右心肥厚指數(shù)為0.沈士0. 012，低氧對照組大鼠右心肥厚指數(shù)為0. 55 士0. 016，低氧上藥組右心肥厚指數(shù)為0. 39 士 0. 021。結(jié)論丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠有效抑制肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的右心代償性增生，防止右心的失代償。實(shí)施例九丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠降低低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的肺小血管平滑肌層的病理改變材料及方法一、主要實(shí)驗(yàn)材料1、SPF級SD大鼠體重200g_250g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心2、戊巴比妥鈉廣州化學(xué)二廠3、中性甲醛Sigma公司
4、蘇木素廣州化學(xué)試劑二廠5、伊紅廣州化學(xué)試劑二廠二、主要儀器1、Citadel 1000組織脫水機(jī)英國Shandon公司2、BM-II水浴式生物組織包埋機(jī)深圳新安毅達(dá)電子廠3、光學(xué)顯微鏡日本Olympus公司4、數(shù)碼攝影一體化系統(tǒng)日本Nikon公司5、熒光倒置顯微鏡德國Leica公司三、實(shí)驗(yàn)方法1、低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的制作同實(shí)施例五。2、大鼠肺組織病理學(xué)研究麻醉處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠，分離氣管，用4%多聚甲醛灌注全肺進(jìn)行固定，取肺組織進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)切片處理，HE染色，顯微鏡下觀察。病理標(biāo)本的制備如下取大鼠肺組織置于4%的多聚甲醛固定1)脫水70%乙醇2h — 80%乙醇Ih — 95%乙醇Ih — 95%乙醇Ih —無水乙醇 2h —無水乙醇1. 5h —無水乙醇1. 5h ；2)透明二甲苯0. 5h — 二甲苯Ih — 二甲苯0. 5h3)浸蠟低溫(50°C )浸蠟Ih —浸蠟Ih4)包埋浸蠟后的組織放入60°C石蠟中包埋5)切片4um連續(xù)切片6)攤片49°C溫水中攤片7)烘片55°C 烘 20min8)透明和水化二甲苯IOmin — 二甲苯IOmin —無水乙醇5min —無水乙醇5min — 95%乙醇 5min — 80% 乙醇 5min — 70% 乙醇 5min —流水沖洗 IOmin9) HE 染色蘇木素染色I(xiàn)min —流水沖洗Imin — 1 %鹽酸酒精脫色I(xiàn)Osec —流水沖洗IOmin — 伊紅染色I(xiàn)Osec —流水沖洗IOmin — 55°C烘20min —中性樹膠封片。試驗(yàn)結(jié)果如圖10的A和B所示，常氧對照組和常氧上藥組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)未有明顯異常，肺小動(dòng)脈內(nèi)膜完整平滑，肌層無增厚；如圖10的C和D所示低氧對照組可見肺小動(dòng)脈管壁和平滑肌層明顯增厚，管腔狹窄；低氧上藥組的肺形態(tài)學(xué)變化與低氧對照組比較明顯減輕。結(jié)論丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽能夠降低低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的肺小血管平滑肌層的病理改變，減輕肺動(dòng)脈高壓時(shí)肺血管的重塑。
權(quán)利要求
1.丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物為治療或預(yù)防肺動(dòng)脈高壓病藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物為治療或預(yù)防左心疾病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓病藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物為治療或預(yù)防與呼吸系統(tǒng)疾病和/或缺氧相關(guān)的肺高血壓病藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物為治療或預(yù)防慢性血栓栓塞性肺高血壓病藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物為治療或預(yù)防未明確的多種因素所致肺高血壓病藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一權(quán)利要求所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽單獨(dú)使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一權(quán)利要求所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽以藥物組合物的形式使用，所述的藥物組合物包括丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽以及藥物載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的藥物組合物中還包括前列環(huán)素、內(nèi)皮素-1受體拈抗劑及5型磷酸二酯酶抑制劑中的一種或兩種以上的組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一權(quán)利要求所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是，所述的丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽與可藥用載體制備成口服制劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽作為制備治療或預(yù)防肺高血壓疾病藥物中的應(yīng)用。丹參酮IIA或其藥物學(xué)上可接受的鹽對肺高血壓有良好的治療作用，安全性良好，具有很好的應(yīng)用前景。而丹參酮IIA及其藥物學(xué)上可接受的鹽類與目前臨床上用的治療肺高血壓的藥物相比，價(jià)格便宜，極具市場前景。
文檔編號A61P11/00GK102160866SQ201110092218
公開日2011年8月24日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者萬利梅, 區(qū)煥桃, 盧文菊, 張丹丹, 王健, 陳豫欽 申請人:呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院