專利名稱：蒜氨酸酶的應(yīng)用及一種藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蒜氨酸酶在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用及一種藥物組合物。
背景技術(shù)：
同型半胱氨酸(Hcy)為一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物。研究表明，同型半胱氨酸通過(guò)產(chǎn)生超氧化物及過(guò)氧化物，會(huì)損傷血管壁，改變凝血因子，造成血小板聚集，增加血栓和動(dòng)脈粥樣硬化的形成傾向。目前，已公認(rèn)高同型半胱氨酸血癥(Hhcy)是除高血脂、吸煙等因素外，引發(fā)心腦血管疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、老年性癡呆等)的又一獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，近年也有研究報(bào)道，同型半胱氨酸除還與神經(jīng)管畸形、先兆子癇、帕金森病、胎兒生長(zhǎng)緩慢、慢性腎功能衰竭等多種疾病有關(guān)。目前，治療高同型半胱氨酸血癥主要方法為補(bǔ)充葉酸和維生素，以及限制甲硫氨酸的攝入，以降低同型半胱氨酸水平。
蒜氨酸酶(alliinase，EC4. 4. I. 4)又名蒜氨酸裂解酶或S-烷基-L-半胱氨酸亞砜酶，存在于大蒜、洋蔥、韭菜等植物中，是含有兩個(gè)相同亞基的二聚體糖蛋白。蒜氨酸酶可從植物中通過(guò)磷酸鹽緩沖液提取和硫酸銨沉淀而得，也可通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道的生物工程方法制備，如文獻(xiàn)(來(lái)慶勤，殷承慧，胡又佳等，大蒜蒜氨酸酶的基因克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)與純化[J]，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41 (7) :32-35.)的方法。在完整無(wú)損的大蒜中，蒜氨酸酶存在于液泡內(nèi)，其天然底物蒜氨酸(alliin)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)新鮮大蒜被切割或壓碎，蒜氨酸酶即被釋放出來(lái)，與蒜氨酸接觸并催化產(chǎn)生具有重要藥理學(xué)用途(如抗菌、抗腫瘤等)的大蒜辣素(allicin)和順/反式阿霍烯(ajoene)，并生成丙酮酸和氨等副產(chǎn)物。但目前，尚未見(jiàn)有關(guān)蒜氨酸酶應(yīng)用于防治高同型半胱氨酸血癥的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供蒜氨酸酶在醫(yī)藥領(lǐng)域中的新應(yīng)用，從而擴(kuò)展其應(yīng)用范圍。本發(fā)明涉及蒜氨酸酶在制備降低同型半胱氨酸量的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及蒜氨酸酶在制備預(yù)防或治療高同型半胱氨酸血癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及蒜氨酸酶在制備預(yù)防高同型半胱氨酸血癥相關(guān)性疾病的藥物中的應(yīng)用；所述的高同型半胱氨酸血癥相關(guān)性疾病為由高同型半胱氨酸血癥所能引發(fā)的疾病，更具體的如心腦血管性疾病(如冠心病等動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、或老年性癡呆)、神經(jīng)管畸形、先兆子癇、帕金森病、胎兒生長(zhǎng)緩慢或慢性腎功能衰竭。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及一種藥物組合物，其包括蒜氨酸酶和輔料。本發(fā)明中，所述的蒜氨酸酶可為按現(xiàn)有方法從植物(如大蒜、洋蔥或韭菜等)中提取的野生型蒜氨酸酶，或者通過(guò)生物工程方法制得的重組蒜氨酸酶。由生物工程方法制備重組蒜氨酸酶，成本更低，步驟更簡(jiǎn)便，產(chǎn)品純度更高，更易工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明中，所述的藥物或藥物組合物中，蒜氨酸酶的含量為治療有效量以上，具體可根據(jù)情況選擇。所述的藥物可以僅含蒜氨酸酶作為唯一活性成分，也可以還含有除蒜氨酸酶以外的其它活性成分。所述的其它活性成分為對(duì)蒜氨酸酶降低同型半胱氨酸水平的活性作用沒(méi)有不良影響可聯(lián)合使用的其他活性成分，如其他預(yù)防或治療高同型半胱氨酸血癥的活性成分。所述的藥物可為適用于蒜氨酸酶的各種藥學(xué)領(lǐng)域常用的各種劑型。根據(jù)所選擇的劑型，可按本領(lǐng)域常規(guī)知識(shí)，選擇合適的輔料，按常規(guī)方法制得所需劑型的藥物。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)蒜氨酸酶具有降低同型半胱氨酸量的作用，從而拓展了其應(yīng)用范圍，也為防治高同型半胱氨酸血癥及其相關(guān)性疾病提供了新途徑。


圖I為實(shí)施例I中在蔗糖活性測(cè)定緩沖液中Hcy的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖。圖2為實(shí)施例I中在蔗糖活性測(cè)定緩沖液中不同濃度的Hcy在蒜氨酸酶的作用下的反應(yīng)百分率的柱狀圖。圖3為實(shí)施例I中大鼠標(biāo)準(zhǔn)血漿的色譜圖。圖4為實(shí)施例I中大鼠標(biāo)準(zhǔn)血漿加+Hcy(100 U mol/L)的色譜圖。圖5為實(shí)施例I中大鼠血漿中Hcy的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖。圖6為實(shí)施例I中蒜氨酸酶在體外血漿中不同濃度的Hcy在蒜氨酸酶的作用下的反應(yīng)百分率的柱狀圖。圖7為實(shí)施例2中不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠血漿Hcy濃度曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下述實(shí)施例中所用蒜氨酸酶按文獻(xiàn)(來(lái)慶勤，殷承慧，胡又佳等，大蒜蒜氨酸酶的基因克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)與純化[J]，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010,41 (7) :32-35.)的方法制得。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。實(shí)施例I蒜氨酸酶對(duì)Hcy的分解作用一、蒜氨酸酶在蔗糖活性測(cè)定緩沖液中對(duì)Hcy的分解作用I、試驗(yàn)方法以蔗糖活性測(cè)定緩沖液配制Hcy成50、100、200、300和400 U mol/L的溶液，每個(gè)濃度取240iU，加入240 以蔗糖活性測(cè)定緩沖液配制的蒜氨酸酶溶液中，使蒜氨酸酶的活力單位為lOOu/ml，立即放于35°C恒溫水浴中進(jìn)行反應(yīng)，Ih后取240 Ul上述反應(yīng)樣品按樣品處理方法(參考文獻(xiàn)范新萍，劉德效，石建黨等，rHPLC定量分析血漿Hcy方法的比較研究[J]，天津醫(yī)藥，2003，31 (9) 589-592)，進(jìn)行HPLC操作(色譜柱Kromasil C18色譜柱(3. 9mmX 150mm, 5 u m);柱溫20°C ;流動(dòng)相0. ImoVlNaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液(pH4. 0，含3%甲醇);流速1. Oml/min ;洗脫時(shí)間6. 2min ;突光檢測(cè)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)390nm,發(fā)射波長(zhǎng)470nm;進(jìn)樣量20 yl)，測(cè)得各濃度下的峰面積。將各反應(yīng)樣品的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線換算成Hcy檢出濃度，計(jì)算反應(yīng)百分率。反應(yīng)百分率<%=(反應(yīng)前樣品濃度-反應(yīng)后樣品檢出濃度)/反應(yīng)前樣品濃度X 100%。2、試驗(yàn)結(jié)果(I)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)定結(jié)果如表I和圖I所示。表I蔗糖活性測(cè)定緩沖液中Hcy標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測(cè)定結(jié)果濃度(U mol/L) ~50~100~200~300~400
峰面積(mAU. s)0. 348259 0.670724 1.514840 2. 376700 3.204250根據(jù)表I和圖I，蔗糖活性測(cè)定緩沖液中，Hcy濃度⑴在50 400 U mol/L范圍內(nèi)與峰面積(Y)成線性，回歸方程為Y = O. 0083X-0. 1137，相關(guān)系數(shù)為0. 9991。(2)蒜氨酸酶在蔗糖活性測(cè)定緩沖液中對(duì)Hcy的分解作用測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。表2蒜氨酸酶在測(cè)活緩沖液中對(duì)Hcy的分解作用
反應(yīng)前 Hcy 濃度(y mol/L)~50 ~100 ~150 ~200
反應(yīng)后 Hcy 檢出濃度(y mol/L)35.02 82. 71 131.65 181. 16
反應(yīng)百分率(％ )3174 IlI YL2 9 4由表2和圖2可見(jiàn)，與蒜氨酸酶反應(yīng)后，不同濃度Hcy樣品的檢出濃度均有所減少，且濃度越低，反應(yīng)百分率越高。二、蒜氨酸酶在體外血漿中對(duì)Hcy的分解作用I、檢測(cè)方法的方法學(xué)考察色譜柱Kromasil C18 色譜柱(3. 9mmX 150mm, 5 u m);柱溫20 °C ；流動(dòng)相0. lmol/1 NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液(pH4. 0，含 3 % 甲醇)；流速I. Oml/min ;洗脫時(shí)間6. 2min ;熒光檢測(cè)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)470nm ;進(jìn)樣量20 yl。(I)專屬性大鼠標(biāo)準(zhǔn)血漿、及大鼠標(biāo)準(zhǔn)血漿加+Hcy(100 U mol/L)的色譜圖如圖3和4所示。由圖3和圖4可見(jiàn)，在該檢測(cè)條件下，Hcy與測(cè)定樣品中的其它成分得到良好分離，不受內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾。標(biāo)準(zhǔn)血衆(zhòng)樣品中Hcy的保留時(shí)間與外加Hcy的一致,保留時(shí)間均在5. Imin左右，表明所測(cè)定的峰即為Hcy的色譜峰。(2)重復(fù)性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。表3同一份血衆(zhòng)測(cè)定5次的峰面積及均值(X 士8 )
權(quán)利要求
1.蒜氨酸酶在制備降低同型半胱氨酸量的制劑中的應(yīng)用。
2.蒜氨酸酶在制備預(yù)防或治療高同型半胱氨酸血癥的藥物中的應(yīng)用。
3.蒜氨酸酶在制備預(yù)防高同型半胱氨酸血癥相關(guān)性疾病的藥物中的應(yīng)用；所述的高同型半胱氨酸血癥相關(guān)性疾病為由高同型半胱氨酸血癥所能引發(fā)的疾病。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的高同型半胱氨酸血癥相關(guān)性疾病為心腦血管性疾病、神經(jīng)管畸形、先兆子癇、帕金森病、胎兒生長(zhǎng)緩慢或慢性腎功能衰竭。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的心腦血管性疾病為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病或老年性癡呆。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的動(dòng)脈粥樣硬化性疾病為冠心病。
7.如權(quán)利要求I 6任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述的蒜氨酸酶為野生型蒜氨酸酶或重組蒜氨酸酶。
8.—種藥物組合物，其特征在于其包括蒜氨酸酶和輔料。
9.如權(quán)利要求I所述的藥物組合物，其特征在于所述的蒜氨酸酶為野生型蒜氨酸酶或重組蒜氨酸酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了蒜氨酸酶在制備降低同型半胱氨酸量的制劑，在制備預(yù)防或治療高同型半胱氨酸血癥，或者預(yù)防高同型半胱氨酸血癥相關(guān)性疾病的藥物中的新應(yīng)用，從而拓展了其應(yīng)用范圍，也為防治高同型半胱氨酸血癥及其相關(guān)性疾病提供了新途徑。本發(fā)明還公開了一種藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102743744SQ20111009994
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者劉全海, 劉珉宇, 劉 英, 吳學(xué)軍, 孫海燕, 張瑱, 徐智儒, 來(lái)慶勤, 秦燕, 肖璘, 蔡立, 黃曉玲 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院