專利名稱：純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物活性人工牙種植體，具體為一種在多孔純鈦牙種植體表面制備基因薄膜的方法。
背景技術：
近年來，隨著我國逐漸進入老齡化社會，牙種植義齒修復的需求在不斷上升，但鈦基種植體與周圍骨組織之間的快速牢固結合是這類手術面臨的一個關鍵性難題。含基因或基因復合物的表面薄膜制備，即表面介導的基因傳遞，已經引起了廣泛的關注，如何將治療基因固定到生物材料表面成為研究的熱點。層層靜電自組裝工藝簡單，厚度可控，可適用于具有復雜形貌結構的基底材料，并且通過對組裝層數的控制能實現對帶有正負電荷的聚合物(天然的和合成的材料，包括DNA)的超級薄膜提供精確的、納米級的控制。人骨形成蛋白(BMP)是一類酸性多肽，能誘導未分化的骨髓間充質干細胞不可逆的分化為軟骨細胞和成骨細胞，從而誘導新骨形成；人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)可促進細胞遷移，使骨髓間充質干細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等向創(chuàng)傷部位聚集，從而啟動創(chuàng)傷愈合過程。因此應用層層靜電自組裝的方法將人骨形成蛋白2 (BMP2) ,bFGF的cDNA基因固定到多孔純鈦種植體表面，可以誘導骨組織的早期形成，同時也為臨床上即刻種植-即刻負載種植技術提供生物學材料基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種多孔純鈦牙種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，從而使該種植體可以促進新骨形成、縮短愈合時間，進而達到即刻種植、即刻負載的理想效果。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案如下本發(fā)明的其中一種純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，包括如下步驟步驟一將多孔純鈦種植體浸入聚乙烯亞胺溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；步驟二 將清洗后的帶正電荷多孔純鈦種植體浸入透明質酸溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；然后將多孔純鈦種植體浸入到陽離子脂質體和治療促進成骨的基因質粒的復合物中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體，用雙蒸水清洗。進一步地，本發(fā)明所述治療促進成骨的基因質粒為人骨形成蛋白2或人堿性成纖維細胞生長因子。進一步地，本發(fā)明重復所述步驟二 5 8次。進一步地，本發(fā)明所述多孔純鈦種植體的表面為具有生物活性的噴砂酸蝕多孔螺紋型結構。
本發(fā)明的另一種純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，其特征是，包括如下步驟步驟一將多孔純鈦種植體浸入聚乙烯亞胺溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；步驟二 將清洗后的帶正電荷多孔純鈦種植體浸入透明質酸溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；后將多孔純鈦種植體浸入到陽離子脂質體和人骨形成蛋白2的cDNA復合物中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；步驟三重復所述步驟二 3 4次；步驟四再將清洗后的帶正電荷多孔純鈦種植體浸入透明質酸溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；再將多孔純鈦種植體浸入到陽離子脂質體和人堿性成纖維細胞生長因子的cDNA復合物中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；步驟五重復所述步驟四3 4次。進一步地，本發(fā)明所述多孔純鈦種植體的表面為具有生物活性的噴砂酸蝕多孔螺紋型結構。與現有技術性相比，本發(fā)明方法具有的有益效果是可在多孔純鈦牙種植體表面制備具有誘導成骨作用的基因涂層，體外能成功轉染前體成骨細胞系MC3T3-E1，并提高前體成骨細胞系堿性磷酸酶和骨鈣素的表達，促進前體成骨細胞的成骨；利用本發(fā)明方法制備得到的種植體可以促進新骨形成、縮短愈合時間，進而達到即刻種植、即刻負載的理想效^ ο


圖1是本發(fā)明方法的原理圖。
具體實施例方式實施例1按以下步驟在純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層1)將多孔純鈦種植體浸入5mg/ml聚乙烯亞胺(PEI)溶液中20分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗1分鐘。2)再將種植體浸入含0. 5mg/ml的透明質酸納溶液中5分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘。后將種植體浸入陽離子脂質體/人骨形成蛋白2質粒的復合物(Lipofectmine LTX+Plus/pEGFP-Cl_BMP2)中5 分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘。3)重復上述步驟2)八次，由此在種植體表面組裝8層基因薄層。將前體成骨細胞系MC3T3-E1接種于以上組裝完成的種植體上，接種48小時后于熒光顯微鏡下觀察細胞轉染后蛋白表達效率，結果顯示綠色熒光蛋白表達率約25%，證明使用本發(fā)明方法在多孔純鈦表面組裝的基因薄膜能成功轉染MC3T3-E1細胞。
實施例2按以下步驟在純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層1)將表面為具有生物活性的噴砂酸蝕多孔螺紋型結構的多孔純鈦種植體浸入 5mg/ml聚乙烯亞胺(PEI)溶液中20分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗1分鐘。2)再將種植體浸入含0. 5mg/ml的透明質酸納溶液中10分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘。后將種植體浸入陽離子脂質體/人堿性成纖維細胞生長因子質粒的復合物(Lipofectmine LTX+Plus/ pEGFP-Cl-bFGF)中10分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘。3)重復上述步驟2、五次，由此在種植體表面組裝5層基因薄層。將前體成骨細胞系MC3T3-E1接種于以上組裝完成的種植體上，接種48小時后于熒光顯微鏡下觀察細胞轉染后蛋白表達效率，結果顯示綠色熒光蛋白表達率約對％，證明使用本發(fā)明方法在多孔純鈦表面組裝的基因薄膜能成功轉染前體成骨細胞系MC3T3-E1。實施例3按以下步驟在純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層1)將多孔純鈦種植體浸入5mg/ml聚乙烯亞胺(PEI)溶液中20分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗1分鐘。2)再將種植體浸入含0. 5mg/ml的透明質酸納溶液中10分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘；后將種植體浸入陽離子脂質體/質粒復合物(Lipofectmine LTX+Plus/pEGFP-C 1-BMP2)中10分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘。3)重復上述步驟2、三次，由此在種植體的表面組裝了 3層BMP2基因薄層。4)再將步驟3)得到的種植體浸入含0. 5mg/ml的透明質酸納溶液中10分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘；后將種植體浸入陽離子脂質體/質粒復合物(Lipofectmine LTX+P 1 us/pEGFP-C 1 -bFGF)中10 分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘。5)重復上述步驟4)三次，由此在具有BMP2基因薄層的多孔純鈦種植體的表面再組裝3層bFGF基因薄層。將前體成骨細胞系MC3T3-E1接種于組裝完成的種植體上，接種48小時后于熒光顯微鏡下觀察細胞轉染后蛋白表達效率，結果顯示綠色熒光蛋白表達率約22%，證明多孔純鈦表面組裝的復合基因薄膜能成功轉染前體成骨細胞系MC3T3-E1細胞。實施例4按以下步驟在純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層1)將表面為具有生物活性的噴砂酸蝕多孔螺紋型結構的多孔純鈦種植體浸入 5mg/ml聚乙烯亞胺(PEI)溶液中20分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗1分鐘。2)再將種植體浸入含0. 5mg/ml的透明質酸納溶液中10分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘；后將種植體浸入陽離子脂質體/質粒復合物(Lipofectmine LTX+Plus/pEGFP-C 1-BMP2)中10分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘。3)重復上述步驟2、四次，由此在種植體的表面組裝了 4層BMP2基因薄層。4)再將步驟3)得到的種植體浸入含0. 5mg/ml的透明質酸納溶液中10分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘；后將種植體浸入陽離子脂質體/質粒復合物(Lipofectmine LTX+P 1 us/pEGFP-C 1 -bFGF)中10 分鐘以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，取出種植體，雙蒸水清洗兩次，每次1分鐘。5)重復上述步驟4)四次，由此在具有BMP2基因薄層的多孔純鈦種植體的表面再組裝4層bFGF基因薄層。將前體成骨細胞系MC3T3-E1接種于組裝完成的種植體上，接種48小時后于熒光顯微鏡下觀察細胞轉染后蛋白表達效率，結果顯示綠色熒光蛋白表達率約25%，證明多孔純鈦表面組裝的復合基因薄膜能成功轉染前體成骨細胞系MC3T3-E1細胞。實施例5本實施例中，將實施例1的步驟2)中的質粒復合物(Lipofectmine LTX+Plus/ PEGFP-C1-BMP2)替換為質粒復合物(Lipofectmine LTX+Plus/pcDNA3. 1 (+)-BMP2)，其他步驟與實施例1相同。將前體成骨細胞系MC3T3-E1分別接種于本實施例組裝完成的種植體上及不含基因薄層的具有生物活性的噴砂酸蝕多孔螺紋型結構的多孔純鈦種植體(空白對照組)上， 每三天換培養(yǎng)液一次。分別于接種后7天和14天收集細胞總蛋白及細胞培養(yǎng)上清液測細胞堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達量。堿性磷酸酶活性結果(見表1)顯示，含BMP2基因薄層的種植體的堿性磷酸酶表達量在兩個觀察時間點表達都較不含基因涂層空白對照組有明顯增加(P<0. 05)。骨鈣素結果(見表幻顯示，涂層組較不含涂層空白對照組的骨鈣素表達量顯著增加(P < 0. 05)，證明使用本發(fā)明方法在多孔純鈦表面組裝的BMP2基因薄層能明顯促進前體成骨細胞系MC3T3-E1的成骨。實施例6本實施例中，將實施例2的步驟2)中的質粒復合物(Lipofectmine LTX+Plus/ pEGFP-Cl-bFGF)替換為質粒復合物(Lipofectmine LTX+Plus/pcDNA3. 1 (+)-bFGF)，其他步驟與實施例2相同。以實施例5中的空白對照組作為本實施例的空白對照組，同時將與空白對照組等量的前體成骨細胞系MC3T3-E1接種于組裝完成的種植體上，每三天換培養(yǎng)液一次。分別于接種后7天和14天收集細胞總蛋白及細胞培養(yǎng)上清液測細胞堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達量。堿性磷酸酶活性結果(見表1)顯示，含該基因薄層的種植體的堿性磷酸酶表達量在兩個觀察時間點的表達都較不含基因涂層空白對照組有明顯增加(P < 0. 05)。骨鈣素結果 (見表幻顯示，該涂層組較空白對照組亦有顯著增加(P <0.05)，證明使用本發(fā)明方法在多孔純鈦表面組裝的bFGF基因薄層能明顯促進前體成骨細胞系MC3T3-E1的成骨。實施例7本實施例中，將實施例3的步驟2)中的質粒復合物(Lipofectmine LTX+Plus/PEGFP-C1-BMP2)及(Lipofectmine LTX+P1us/pEGFP-C1-bFGF)替換為質粒復合 ^ (Lipofectmine LTX+Plus/pcDNA3. 1 (+)-BMP2) R (Lipofectmine LTX+Plus/ pcDNA3. 1 (+) -bFGF)，其他步驟與實施例3相同。以實施例5中的空白對照組作為本實施例的空白對照組，同時將與空白對照組等量的前體成骨細胞系MC3T3-E1接種于組裝完成的種植體上，每三天換培養(yǎng)液一次。分別于接種后7天和14天收集細胞總蛋白及細胞培養(yǎng)上清液測細胞堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達量。堿性磷酸酶活性結果(見表1)顯示，含基因薄層的種植體的堿性磷酸酶表達量在兩個觀察時間點的表達都較不含基因涂層空白對照組有明顯增加(P <0.05)。骨鈣素結果 (見表幻顯示，涂層組較不含涂層空白對照組顯著增加(P <0.05)，證明使用本發(fā)明方法在多孔純鈦表面組裝的BMP2和bFGF復合基因薄層能明顯促進前體成骨細胞系MC3T3-E1 的成骨。實施例8本實施例中，將實施例4的步驟2)中的質粒復合物(Lipofectmine LTX+Plus/ PEGFP-C1-BMP2)及(Lipofectmine LTX+P1us/pEGFP-C1-bFGF)替換為質粒復合 ^ (Lipofectmine LTX+Plus/pcDNA3.l(+)-BMP2) R (Lipofectmine LTX+Plus/ pcDNA3. 1 (+) -bFGF)，其他步驟與實施例4相同。以實施例5中的空白對照組作為本實施例的空白對照組，同時將與空白對照組等量的前體成骨細胞系MC3T3-E1接種于組裝完成的種植體上，每三天換培養(yǎng)液一次。分別于接種后7天和14天收集細胞總蛋白及細胞培養(yǎng)上清液測細胞堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達量。堿性磷酸酶活性結果(見表1)顯示，含該基因薄層的種植體的堿性磷酸酶表達量在兩個觀察時間點的表達都較不含基因涂層空白對照組有明顯增加(P < 0. 05)。骨鈣素結果 (見表幻顯示，涂層組較不含涂層空白對照組的骨鈣素表達量顯著增加(P <0.05)，證明使用本發(fā)明方法在多孔純鈦表面組裝的BMP2和bFGF復合基因薄層能明顯促進前體成骨細胞系MC3T3-E1的成骨。表1.前體成骨細胞系MC3T3-E1堿性磷酸酶表達活性(mmol/g/h)
權利要求
1.一種純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，其特征是，包括如下步驟步驟一將多孔純鈦種植體浸入聚乙烯亞胺溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；步驟二 將清洗后的帶正電荷的多孔純鈦種植體浸入透明質酸溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；然后將多孔純鈦種植體浸入到陽離子脂質體和促進成骨的基因質粒的復合物中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體，用雙蒸水清洗。
2.根據權利要求1所述的純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，其特征是所述促進成骨的基因質粒為人骨形成蛋白2或人堿性成纖維細胞生長因子。
3.根據權利要求1所述的純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，其特征是重復所述步驟二 5 8次。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，其特征是所述多孔純鈦種植體的表面為具有生物活性的噴砂酸蝕多孔螺紋型結構。
5.一種純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，其特征是，包括如下步驟步驟一將多孔純鈦種植體浸入聚乙烯亞胺溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；步驟二，將清洗后的帶正電荷的多孔純鈦種植體浸入透明質酸溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；然后將多孔純鈦種植體浸入到陽離子脂質體和人骨形成蛋白2的cDNA復合物中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；步驟三重復步驟二 3 4次；步驟四再將清洗后的帶正電荷的多孔純鈦種植體浸入透明質酸溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；再將多孔純鈦種植體浸入到陽離子脂質體和人堿性成纖維細胞生長因子的cDNA復合物中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；步驟五重復所述步驟四3 4次。
6.根據權利要求5所述的純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，其特征是所述多孔純鈦種植體的表面為具有生物活性的噴砂酸蝕多孔螺紋型結構。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純鈦種植體表面組裝非病毒載體介導的基因薄層的方法，其步驟為(1)將多孔純鈦種植體浸入聚乙烯亞胺溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；(2)將清洗后的帶正電荷多孔純鈦種植體浸入透明質酸溶液中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上負電荷，后取出多孔純鈦種植體用雙蒸水清洗；然后將多孔純鈦種植體浸入到陽離子脂質體和促進成骨的基因質粒的復合物中以使多孔純鈦種植體的表面均勻帶上正電荷，后取出多孔純鈦種植體，用雙蒸水清洗。本發(fā)明保證在種植體表面形成具有良好生物活性的多層基因薄膜，提高種植體-骨結合率，為即刻種植-即刻負載種植提供了生物材料基礎。
文檔編號A61K6/04GK102302414SQ20111010100
公開日2012年1月4日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權日2011年4月22日
發(fā)明者何福明, 劉麗, 楊國利, 江巧紅, 趙士芳 申請人:浙江大學