專利名稱：重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組疫苗，具體地說，涉及一種重組禽流感M2e的雞傳染性法氏 囊VP2亞單位疫苗，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
H5和H9亞型禽流感(Al)和雞傳染性法氏囊病(IBD)是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重 要疫病。目前，我國對這3種疾病的防控主要依賴于疫苗免疫?，F(xiàn)有禽流感疫苗存在的問題據(jù)OIE統(tǒng)計(jì)，從2005年底起，我國實(shí)施全面強(qiáng)制免疫 以來，我國仍發(fā)生42起高致病性H5亞型禽流感。我國學(xué)者利用反向遺傳技術(shù)已經(jīng)開發(fā)出 5代H5亞型禽流感疫苗，即Re-I至Re_5，仍趕不上病毒的變易。特別注意的是，2008年江 蘇東臺(tái)爆發(fā)的禽流感與現(xiàn)用疫苗株Re-4在基因水平上屬于同一分支?，F(xiàn)有疫苗不能對不 斷出現(xiàn)的新變易株提供有效保護(hù)。因此，亟需一種具有廣譜免疫效力的新疫苗。H9亞型禽流感感染雞群后癥狀輕微，其本身并不一定造成禽群的大規(guī)模死亡，但 易發(fā)生并發(fā)或繼發(fā)感染，引起蛋雞產(chǎn)蛋量顯著下降，飼料報(bào)酬降低等，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。 隨著疫苗的使用，病毒在免疫選擇壓作用下，發(fā)生變異以逃逸免疫。類似于H5亞型禽流感， 市場現(xiàn)有多種不同H9疫苗株，如F株、Sy株、SS/94株、HL株和SD696株等，仍不能對新出 現(xiàn)的變易株提供有效保護(hù)。因此，開發(fā)具有廣譜免疫效力的新疫苗勢在必行。雞傳染性法氏囊病的危害雞傳染性法氏囊對我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的危害，尤 其是自1991年強(qiáng)毒和超強(qiáng)毒以及變易株引起的發(fā)病，常使局部地區(qū)IBD的防控相當(dāng)困難。 防治該病現(xiàn)用疫苗有常規(guī)的滅活疫苗和活疫苗，以及初步應(yīng)用的亞單位疫苗?，F(xiàn)有傳染性法氏囊疫苗存在的問題現(xiàn)用活疫苗包括中等弱毒活疫苗和中等偏 強(qiáng)毒疫苗。中等弱毒活疫苗用于無母源抗體的雛雞早期免疫，對有母源抗體的雞免疫效果 較差，免疫時(shí)如果母源抗體的水平仍很高，則該類雞只不僅免疫效果差、而且會(huì)降低其體內(nèi) 循環(huán)抗體，導(dǎo)致免疫后數(shù)周發(fā)病。中等偏強(qiáng)毒疫苗時(shí)，能使低母源抗體水平雞只有較強(qiáng)的免 疫反應(yīng)，但其安全性較差，會(huì)致使免疫時(shí)低抗體水平雞只應(yīng)激水平大甚至發(fā)病。另外由于現(xiàn) 有生產(chǎn)疫苗的無特定病原(SPF)雞胚均存在一定程度的REV等外源性病毒污染。這對活疫 苗應(yīng)用帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)用滅活疫苗的生產(chǎn)受雞胚供應(yīng)的限制，且該制備過程需要人力 較多，很多工藝煩瑣，且部分工藝節(jié)點(diǎn)難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化控制?，F(xiàn)有研究表明，流感病毒的Mk能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生良好的廣譜性免疫保護(hù)。M.D. Filette等用Mk與HBcAg融合表達(dá)，并與CTAl-DD佐劑聯(lián)合使用免疫小鼠，能保護(hù)H3W或 HlNl的攻毒。A. Jegerlehner等研究表明，將M2e蛋白與HBcAg偶聯(lián)的免疫效果優(yōu)于Mh 與HBdg嵌合表達(dá)形成病毒樣顆粒的免疫效果。G. ^iao等用含多拷貝Mk抗原免疫小鼠 后，能對不同H5W分支病毒的攻擊提供有效保護(hù)。禽流感Mk與血藍(lán)蛋白(KLH)的偶聯(lián)物 制備疫苗，不僅能對同一亞型內(nèi)不同變易株的攻擊提供保護(hù)，還能對不同亞型禽流感病毒 的攻擊提供保護(hù)，提高其存活率達(dá)80%。但KLH是一種異源蛋白，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量與禽流感免疫無關(guān)的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種抵抗禽流感和雞傳染性法氏
囊病毒的重組疫苗。本發(fā)明的重組禽流感Mk的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗中，包含帶有雞傳染 性法氏囊病毒VP2基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，所說的VP2基因中融合有H5或H9亞型禽流感病 毒的Mk基因，其中H5亞型禽流感病毒的Mk氨基酸序列為SLLTEVETPTRN，H9亞型禽流感 病毒的]\Ce氨基酸序列為SLLTEVETHTRN, VP2基因序列參考GenBank登錄號(hào)DQ906921。所說的融合基因中，H5或H9亞型禽流感病毒的Mk基因融合到VP2基因的BC區(qū) 或羧基端。 所說的VP2基因的BC區(qū)融合1拷貝的Mk基因。所說的VP2基因的羧基端融合4拷貝的Mk基因。重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗的構(gòu)建方法，先將H5或H9亞 型禽流感病毒的Mk基因融合到雞傳染性法氏囊病毒VP2基因形成重組基因，再將重組基 因克隆到大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)或pFast-Bac-Ι桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得重組 表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)制備重組疫苗。重組禽流感Mk的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗在制備防治禽流感病毒和雞傳 染性法氏囊病毒藥物中的應(yīng)用。含有重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗的組合物。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果
1)本發(fā)明選用雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)作載體，可有效地避免誘導(dǎo)產(chǎn)生大量與禽流 感免疫無關(guān)的抗體。2)VP2形成的病毒樣顆粒(VLP)含20個(gè)VP2三聚體，理論上，存在60個(gè)Mk展示 在VP2的形成的VLP上，可大幅提高M(jìn)k的量和免疫原性。根據(jù)對IBDV VP2形成的晶體 結(jié)構(gòu)表明，VP2含有4個(gè)刺突區(qū)域(IV、PDE> Pfg和PHI)，其中在其PBe區(qū)可以插入外源性短序 列氨基酸而不影響VP2表達(dá)和結(jié)構(gòu)的完整性。本發(fā)明利用VP2的IV區(qū)作為表達(dá)外源基因 M2e的插入?yún)^(qū)?；蛟诓挥绊慥P2的空間結(jié)構(gòu)條件下，將多拷貝的M2e經(jīng)連接子連接融合至 VP2的羧基端，再用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。3)本發(fā)明采用原核細(xì)胞(大腸桿菌)或Bac-to-Bac真核表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)行表達(dá)，獲 得的產(chǎn)物不含核酸成分，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，具有生產(chǎn)量大、產(chǎn)品安全，質(zhì)量和工藝易 于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為重組疫苗的構(gòu)建中在VP2的PBe區(qū)插入1拷貝的Mk的示意圖； 圖2為重組疫苗的構(gòu)建中在VP2的羧基端融合4拷貝的M2e的示意圖3為SDS-PAGE鑒定pET3h表達(dá)各重組菌的融合蛋白的結(jié)果圖； 圖4為Western-blotting鑒定pET3h系統(tǒng)表達(dá)各重組菌的融合蛋白的結(jié)果圖； 圖5為SDS-PAGE鑒定桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的各重組蛋白的結(jié)果圖；CN 102145166 A
說明書
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圖6為Western-Blotting鑒定桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的各重組蛋白的結(jié)果圖； 圖7為各疫苗免疫后針對M2e的抗體效價(jià)； 圖8為各疫苗免疫后針對M2e的抗體效價(jià)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明使用的雞傳染性法氏囊病毒B87株從南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn)的 活疫苗中分離、擴(kuò)繁、保存。原核表達(dá)載體pET3h和BL21(DE!3)表達(dá)菌株購自Novagen公 司，限制性內(nèi)切酶5 / !,BamW l.Hind III、T4 DNA連接酶、rTag DNA聚合酶、pUC19T載體 均購自寶生物科技有限公司。含2個(gè)賴氨酸(K)連接子的4拷貝H5-M&基因(KK-(M2e)4H5) 和4拷貝H9-M&基因(KK-(Mk)4119)經(jīng)人工設(shè)計(jì)后，交由南京金思瑞生物科技有限公司合 成。實(shí)施例1 重組疫苗的構(gòu)建和鑒定 重組疫苗的構(gòu)建，包括下列步驟
(1)本發(fā)明根據(jù)GenBank中注冊的雞傳染性法氏囊病毒的VP2基因的序列設(shè)計(jì)引物，從 疫苗株B87中經(jīng)RT-PCR的方法擴(kuò)增出VP2基因，進(jìn)行序列測定；
(2)人工合成含部分VP2基因，2個(gè)賴氨酸(K)連接子和4拷貝H5亞型流感病毒的Mk 基因，即 KK-M2e4H5 ；
(3)人工合成含部分VP2基因，2個(gè)賴氨酸(K)連接子和4拷貝H9亞型流感病毒的M2e 基因，即 KK-ICe4119 ；
(4)將1拷貝H5亞型流感病毒的Mk基因，用PCR方法融合至VP2的Pbc區(qū)，即VP2的 Pbc區(qū)融合1拷貝的M2e，即獲得VP2BCM&H5基因。將該重組基因克隆至pET3h原核表達(dá)載 體，獲得高效表達(dá)載體p32aVP2BeiCeH5，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌工程菌BL21 (DE3)；
(5)將(4)中獲得的VP2BCffieH5重組基因克隆至Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，獲得高效表達(dá) 載體pBac-VP2BCffieH5，并轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞；
(6)將人工合成的KK-Mk4115基因用PCR方法融合至VP2的羧基端，即獲得 VP2-KK-(Mk)4115重組基因。將重組基因克隆至pET3h原核表達(dá)載體。獲得高效表達(dá)載體 p32aVP2-KK-(M2e)4H5,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌工程菌BL21 (DE3)；
(7)將(6)中獲得的VP2-KK-(Mk)4115重組基因克隆至Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，獲得高效 表達(dá)載體pBac- VP2-KK-(Mk)4115，并轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞；
(8)將1拷貝H9亞型流感病毒的Mk基因，用PCR方法融合至VP2的區(qū)，即VP2的 Pbc區(qū)融合1拷貝的M2e，即獲得VP2BCM&H9基因。將該重組基因克隆至pET3h原核表達(dá)載 體，獲得高效表達(dá)載體p32aVP2BeiCeH9，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌工程菌BL21 (DE3)；
(9)將(8)中獲得的VP2BCffieH9重組基因克隆至Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，獲得高效表達(dá) 載體pBac-VP2BCffieH9，并轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞；
(10)將人工合成的KK-Mk4119基因用PCR方法融合至VP2的羧基端，即獲得 VP2-KK-(Mk)4119重組基因。將重組基因克隆至pET3h原核表達(dá)載體。獲得高效表達(dá)載體 p32aVP2-KK-(M2e)4H9,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌工程菌BL21 (DE3)；
(11)將(10)中獲得的VP2-KK-(Mk)4119重組基因克隆至Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，獲得高 效表達(dá)載體pBac-VP2-KK-(Mk)4119，并轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞；
5(12)用含氨芐的LB培養(yǎng)基分別發(fā)酵培養(yǎng)含有p32aVP2BCffieH5，p32aVP2BCM2eH9, p32aVP2-KK-(M2e)4H5 和 p32aVP2_KK-(iCe) 4H9 的大腸桿菌工程菌 BL21 (DE3)，并對相應(yīng)的表 達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。(13)分別擴(kuò)增感染不同桿狀病毒的Sf9細(xì)胞，這些桿狀病毒含相應(yīng)重組基因，分 別包括 pBac-VPAeMZem，pBac-VP2BCM2eH9, pBac-VP2_KK-(M2e)4H5 和 pBac-VP2_KK-(M2e)棚 重組基因，并對相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定；
(14)將(12)和(13)獲得的表達(dá)產(chǎn)物制備成油乳劑疫苗免疫雞，檢測表達(dá)產(chǎn)物的免疫 原性。具體闡述如下 1、VP2基因的獲得
VP2引物根據(jù)國內(nèi)外已在GenBank中登陸的IBDV VP2基因序列經(jīng)多重比較后設(shè)計(jì) 合成VP2引物。上游引物(VP2ICeH5Il)
5’-ATGGATCCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC -3’ ； 下游引物(VP2M2eH512)
5’-TTGTCGACCTTATGCTCCTGCAATTTTCAGGGG AGA-3’ 。VP2基因的RT-PCR獲取與測序驗(yàn)證
以B87株為模版，提取RNA，采用下游引物VP2M&H512進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以獲 得的cDNA為模版，加入rTag DNA聚合酶、上下游引物、dNTP進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用上游引物 (VP2M2eH511)和下游引物(VP2M&H5U)進(jìn)行PCR，將PCR后的產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電 泳觀察，可見約1323bp的擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致。將上述目的基因克隆至PUC19T 載體，并送北京六合華大基因科技股份有限公司測序驗(yàn)證。2、構(gòu)建 VP2BCH\CeH5 和 VP2BCH\CeH9 基因 1)構(gòu)建 VP2BC-iCeH5 基因
將M2&的基因序列經(jīng)PCR引物融合克隆至VP2的Pbc區(qū)。描述如下引物包括 VP2M2eH511、223M2eH512 (其序列為 5，-GCTAGTGTTTC TGGTAGGCGTTTCGACCTCGGTTAGAAGACT GCTGGCTTGGTACTGTGATG
AGAATTGG-3' )，223M2eH521(其序列 % 5'-GCCAGCAGTCTTCTAACCGAGGTCGA AACGCCTACCAGAAACACTAGC
GGGGTAACAATCACACTGTTCT-3，)和 223M2eH522 (其序列為5，- TAGTCGACG TTA TGCTCCTGCAATTTTCAGG GGAG -3，)。其中，引物 223iCeH512 和 223iCeH521 均包含有 H5 M2e 的基因序列。用引物VP2M&H511和223M&H512擴(kuò)增出VP2的BC區(qū)的上游片段，用引物 223M2eH521和223M&H522擴(kuò)增出VP2的BC區(qū)的下游片段。獲得上下游片段后，利引物 VP2M&H511和223M&H522經(jīng)融合PCR的方法，將上下游片段融合成嵌合有M2e基因序列的 VP2 基因，即 VP2BC-M2eH5。2)構(gòu)建 VP2BC_iCeH9 基因
將M2M的基因序列經(jīng)PCR引物融合克隆至VP2的Pbc區(qū)。描述如下引物包括 VP2M2eH511 和 VP2M2eH912(其序列為5，- GCTAGTGTTTCTGGTGTGCGTTTCGACCTCGGTTAGAAG ACTGCTGGCTTGGTACTGTGATGAGAATTGG-3，)，以及223iCeH921 (其序列為5，- GCCAGCAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCACAC CAGAAACACTAGCG
GGGTAACAATCACACTGTTCT-3，)，223M2eH5220 其中，引物 223iCeH511 和 223iCeH912 均 包含有H9 M2e的基因序列。用引物VP2M2eH511和223M2eH912擴(kuò)增出VP2的BC區(qū)的上游 片段，用引物223M&H921和VP2M&H522擴(kuò)增出VP2的BC區(qū)的下游片段。獲得上下游片段 后，利引物VP2M&H511和223M&H522經(jīng)融合PCR的方法，將上下游片段融合成嵌合有Mk 基因序列的VP2基因，即VP^-iCeH9。3、構(gòu)建 VP2-KK- (M2e) 4H5 和 VP2-KK- (M2e) 4H9 基因 1)構(gòu)建 VP2-KK- (M2e) 4H5 基因
將含2個(gè)賴氨酸(K)連接子的4拷貝H5 M2e基因，即KK-(Mk)4115基因通過融合PCR的 方法克隆至VP2基因的C端。描述如下引物包括VP2iCeH511，VP2M2eH512, VP2M2eH521 ( 其序列為5' -GGAGGTGGCCGACCTCAACTCT-3，)和 VP2M2eH522 (其序列為5' -GTCGAC GTTAGTTTCTGGTAGGCGTTTC-3，)。其中，引物 VP2iCeH511 和 VP2iCeH512 用于擴(kuò)增 VP2 基 因，而VP2M2eH521和VP2iCeH522用于擴(kuò)增人工合成的KK_(M2e)4H5基因。用VP2M2eH511 和VP2M&H522將VP2基因和KK- (M2e) 4H5基因用PCR的方法融合成一條完整基因，即 VP2-KK- (M2e)4H5。2)構(gòu)建 VP2-KK-(M2e)4H9 基因
將含2個(gè)賴氨酸(K)連接子的4拷貝H9 M2e基因，即KK-(Mk)4119基因通過融合PCR的 方法克隆至VP2基因的C端。描述如下弓丨物包括VP2iCeH511，VP2M2eH512，VP2M2eH521和 VP2M2eH922 (其序列為5，-GTCGACGTTAGTTTCTGGTGTGCGTTTC -3，)。其中，引物 VP2M2eH511 和VP2iCeH512用于擴(kuò)增VP2基因，而VP2M2eH521和VP2iCeH922用于擴(kuò)增人工合成的 KK-(M2e)4H5 基因。用 VP2M2eH511 和 VP2M2eH922 將 VP2 基因和 KK_(M2e)棚基因用 PCR 的 方法融合成一條完整基因，即VP2-KK-(M&)4H5。4、原核表達(dá)質(zhì)粒(pET32aVP2BCH\CeH5，pET32aVP2BC-M2eH9, pET32aVP2-KK- (M2e) 4H5 和 pET32aVP2-KK-(iCe)4H9)的構(gòu)建和鑒定
利用試劑盒將PCR產(chǎn)物經(jīng)回收，連接克隆至pMD 19-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五cWi DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆，經(jīng)PCR和酶切鑒定，并測定每一構(gòu)建質(zhì)粒 的核苷酸序列。將測序驗(yàn)證正確的序列經(jīng)克隆至ΡΕΤ3Μ原核表達(dá)載體獲得相應(yīng)的連接子， 將連接子轉(zhuǎn)化BL21-DE3感受態(tài)細(xì)菌，涂板(含Amp+)，過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng) 后提取質(zhì)粒，酶切、電泳鑒定。以上操作方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法。挑取含相應(yīng)連接子的BL21的重組菌于含Amp+抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖 培養(yǎng)，至一定時(shí)間后加入IPTG至終濃度為lmM，37°C誘導(dǎo)證，收獲細(xì)菌。離心收集菌體，用 PBS緩沖液重懸，于冰浴中超聲波破碎細(xì)胞。將完整的誘導(dǎo)菌體以及超聲波破碎后的上清、 沉淀經(jīng)SDS-PAGE檢測表達(dá)的融合蛋白，其結(jié)果如圖3所示。以經(jīng)法氏疫苗免疫制備的單 因子血清，經(jīng)Western-Blotting鑒定上述表達(dá)產(chǎn)物，獲得良好反應(yīng)性，其結(jié)果如圖4所示。 以上操作方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法。5、真核表達(dá)質(zhì)粒(pBac-VP4cM2eH5，pBac-VP2BCM2eH9, pBac_VP2_KK-(M2e)4H5 和 pBac-VP2-KK-(M2e)4H9)的構(gòu)建和鑒定
利用試劑盒將PCR產(chǎn)物經(jīng)回收，連接克隆至pMD 19-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五cWi DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆，經(jīng)PCR和酶切鑒定，并測定每一構(gòu)建質(zhì)粒的核苷酸序列。將測序驗(yàn)證正確的序列經(jīng)克隆至Pi^astBacl桿狀病毒載體獲得相應(yīng)的連接 子，將連接子轉(zhuǎn)化DHlOBac E. cWi感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)抗性篩選，過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落， 擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切、電泳鑒定。挑取含相應(yīng)連接子重組菌于抗性的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C振搖培養(yǎng)后，提取重組菌的Bacmid DNA，將此Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得相應(yīng)的 重組桿狀病毒。將獲得的重組桿狀病毒擴(kuò)大培養(yǎng)，收獲相應(yīng)的重組蛋白用于后續(xù)分析。包 括用SDS-PAGE *Wfestern-Bl0tting鑒定表達(dá)的融合蛋白，分別見圖5和圖6。以上操作方 法參考 Invitrogen 公司 Bac-to-Bac Baculovirus Expression System 說明書進(jìn)對于。實(shí)施例2 表達(dá)蛋白的免疫原性試驗(yàn)
將pET3h原核表達(dá)系統(tǒng)和pFastBac-Ι真核表達(dá)系統(tǒng)獲得的各重組蛋白制備成油乳劑 疫苗(該制苗方法為本領(lǐng)域常規(guī)操作方法)，按0. 3ml/羽份經(jīng)頸部皮下途徑免疫20日齡商 品雞。共分8個(gè)重組抗原免疫組，另設(shè)相應(yīng)的商品疫苗對照組3組，H5商品疫苗、H9商品疫 苗、IBDV亞單位商品疫苗組，空載體對照組2組，pET32a空載體對照和空pFastBac-Ι載體 對照組，空白對照組，合計(jì)14個(gè)試驗(yàn)組，每組10只雞。試驗(yàn)動(dòng)物分組詳見表1。在一免后4周，進(jìn)行二免。在免疫后每隔2周采血，分離血清，用ELSA方法檢測針 對M2e的抗體效價(jià)，用病毒血清中和試驗(yàn)在CEF上檢測針對VP2的抗體效價(jià)。針對M2e的ELISA檢測方法簡述如下以5 μ g/mL的人工合成2拷貝Mk多肽作 為包被抗原，待檢血清做1 :400倍稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗雞二抗做1 :3000倍稀釋，在37°C 用TMB底物顯色15min，以100 L 2mol/LH2S04溶液終止反應(yīng)，檢測OD45tl吸光值，繪制抗體 水平消長曲線。以上操作為本領(lǐng)域常規(guī)操作。針對VP2的抗體檢測簡述如下雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)按IX IO6個(gè)/孔接入96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至長成單層。待檢血清用洲D(zhuǎn)MEM分別作1:100、1:200、1:400、1:800、 1 1600、1 3200梯度倍比稀釋，IBDV細(xì)胞適應(yīng)毒同樣用2% DMEM稀釋至200TCID50/100 μ L， 稀釋后的病毒和血清等體積混合，置37°C含5%ω2的細(xì)胞培養(yǎng)箱作用lh，將作用后的病毒 血清混合物按100 μ L/孔加至事先培養(yǎng)長成單層的CEF細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)血清稀釋度設(shè)4 個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對照與病毒對照。置(X)2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，120h至17 觀察 細(xì)胞病變出現(xiàn)情況，按完全出現(xiàn)保護(hù)的稀釋度記為該待檢血清的有效保護(hù)效價(jià)。以上操作 為本領(lǐng)域常規(guī)操作。表1.試驗(yàn)動(dòng)物分組
權(quán)利要求
1.重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗，其特征在于，所說的疫苗中包 含帶有雞傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，所說的VP2基因中融合有H5或H9 亞型禽流感病毒的Mk基因，其中H5亞型禽流感病毒的Mk氨基酸序列為SLLTEVETPTRN， H9亞型禽流感病毒的Mk氨基酸序列為SLLTEVETHTRN，VP2基因序列參考GenBank登錄號(hào) DQ906921。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗，其特征 在于，所說的融合基因中，H5或H9亞型禽流感病毒的Mk基因融合到VP2基因的BC區(qū)或羧基端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗，其特征 在于，所說的VP2基因的BC區(qū)融合1拷貝的M2e基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗，其特征 在于，所說的VP2基因的羧基端融合4拷貝的M2e基因。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗的構(gòu) 建方法，其特征在于，先將H5或H9亞型禽流感病毒的Mk基因融合到雞傳染性法氏囊病毒 VP2基因形成重組基因，再將重組基因克隆到大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)或pFast-Bac-Ι桿狀 病毒真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)制備重組疫苗。
6.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)重組禽流感Mk的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗在制備 防治禽流感病毒和雞傳染性法氏囊病毒藥物中的應(yīng)用。
7.含有權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)重組禽流感Mk的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗的 組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。所說的重組禽流感M2e的雞傳染性法氏囊VP2亞單位疫苗中包含帶有雞傳染性法氏囊病毒VP2基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，所說的VP2基因中融合有H5或H9亞型禽流感病毒的M2e基因，其中H5亞型禽流感病毒的M2e氨基酸序列為SLLTEVETPTRN，H9亞型禽流感病毒的M2e氨基酸序列為SLLTEVETHTRN，VP2基因序列參考GenBank登錄號(hào)DQ906921。本發(fā)明的重組疫苗安全性好，不僅能用于預(yù)防IBDV，還能對H5或H9亞型的禽流感提供保護(hù)，是一種理想的雙價(jià)疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102145166SQ20111010131
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者何家惠, 侯鳳香, 侯繼波, 吳培培, 唐應(yīng)華, 宮玉珍, 王永偉, 陸吉虎 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院