專利名稱：3,4-二氯異香豆素在制備抗球蟲病藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開了 3，4-二氯異香豆素在制備抗球蟲病藥物中的用途，可以抑制柔嫩艾美耳球蟲對宿主細胞的侵入，用于球蟲病的預防和治療，屬于醫(yī)學制藥技術領域。
背景技術：
球蟲病一直是養(yǎng)雞生產(chǎn)中主要控制和治療的疾病之一，尤其是集約化養(yǎng)雞方式的大面積推廣及應用之后，更成為常見多發(fā)性疾病，其中以柔嫩艾美耳球蟲最為嚴重?？骨蛳x藥物可以說是飼料中必須添加的藥物之一，但是近年來由于抗藥性的問題，及藥物殘留等問題，使得抗球蟲藥物的研究進入了一個瓶頸的階段。頂器門寄生性原蟲生活史復雜，因此對其侵入機制的研究一直困擾著研究者。柔嫩艾美耳球蟲的細胞膜內含有一種絲氨酸蛋白酶，即Rhomboid蛋白，它的酶活性的發(fā)揮是蟲體侵入宿主細胞的關鍵。3，4- 二氯異香豆素是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，它是否能夠抑制柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid蛋白活性，從而阻礙蟲體侵入宿主細胞并未見有報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了 3，4- 二氯異香豆素在制備抗球蟲病藥物中的用途，為一種新的醫(yī)用用途，用于球蟲疾病的預防和治療。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的
體外分離雞腎細胞，對其進行原代細胞培養(yǎng)。同時將3，4-二氯異香豆素稀釋成不同終濃度的培養(yǎng)液。然后提取柔嫩艾美耳球蟲子孢子，將各濃度溶液平均分成兩部分，一部分在加入細胞培養(yǎng)板前與子孢子作用，然后洗去藥物后接入細胞；另一部分與子孢子一同接入細胞，培養(yǎng)一定時間后，用Hank’ s液洗去藥物，甲醇固定染色，在顯微鏡下計數(shù)。觀察不同濃度的3，4- 二氯異香豆素對子孢子的侵入、裂殖體和卵囊形成的影響。以下藥理實驗證明本發(fā)明的治療效果
體外進行雞腎細胞的原代培養(yǎng)；然后提取柔嫩艾美耳球蟲子孢子，將3，4- 二氯異香豆素通過DMSO (二甲基亞砜)溶解，配制成100 μ M的溶液，在向細胞培養(yǎng)板中加入3，4-二氯異香豆素時，分別稀釋成終濃度為1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μ M的培養(yǎng)液。將各濃度溶液平均分成兩部分，一部分在加入細胞培養(yǎng)板前與子孢子作用，然后洗去藥物后接入雞腎細胞；另一部分與子孢子一同接入雞腎細胞。培養(yǎng)一定時間后，在顯微鏡下對子孢子形成的第一代裂殖體、第二代裂殖體以及子代卵囊進行計數(shù)，具體的判定標準如下抑制劑對細胞的毒性，以細胞脫落為標準。采用兼顧第一代裂殖體數(shù)量、第二代裂殖體數(shù)量和卵囊數(shù)量的原則，即以第一代裂殖體數(shù)量為第一指標，判斷3，4- 二氯異香豆素對子孢子侵入細胞的影響；
以第二代裂殖體數(shù)量 為第二指標；判斷3，4- 二氯異香豆素對五tenella的治療效果 (第二代裂殖階段是造成雞只死亡的主要階段)；
以卵囊數(shù)量為第三指標，判斷3，4-二氯異香豆素對病原控制的效果(隨患雞糞便排出的卵囊是健康雞群的傳染源)。第一代裂殖體數(shù)子孢子接種后48 h，在100倍倒置顯微鏡下觀察并計算各組的第二代裂殖體數(shù)，每組計算20個視野；
第二代裂殖體數(shù)子孢子接種后108 h，在100倍倒置顯微鏡下觀察并計算各組的第二代裂殖體數(shù)，每組計算20個視野。卵囊形成數(shù)子孢子接種后8 d，同樣方法統(tǒng)計子代卵囊數(shù)量。1、第一代裂殖體數(shù)量
將五tenella子孢子接種于雞腎細胞48h后，通過倒置顯微鏡對第一代裂殖體數(shù)量進行統(tǒng)計，如圖1所示，隨著絲氨酸蛋白酶抑制劑3，4- 二氯異香豆素濃度的增加，共培養(yǎng)組的第一代裂殖體數(shù)量呈逐漸減少的趨勢，而提前處理的這一組則變化幅度不大，趨勢不明顯。與空白空白對照組相比，共培養(yǎng)組在3，4- 二氯異香豆素濃度20 μ M和30 μ M時差異極顯著(Ρ<0. 01)，40 μ M和50 μ M時差異顯著(Ρ<0. 05)，而前處理組則與空白空白對照組無明顯差異。當3，4- 二氯異香豆素濃度達到40 μ M和50 μ M時細胞出現(xiàn)一定的脫落現(xiàn)象，可見3，4- 二氯異香豆素在40 μ M時抑制了細胞的生長與代謝，從而導致了細胞的死亡。結果表明，20 μ M的3，4-二氯異香豆素濃度可以有效抑制體外球蟲對雞腎細胞的侵入。2、第二代裂殖體數(shù)量
子孢子接種雞腎細胞108h后，通過倒置顯微鏡對第二代裂殖體數(shù)量進行統(tǒng)計，如圖 2所示，共培養(yǎng)組的第二代裂殖體數(shù)量隨著絲氨酸蛋白酶抑制劑3，4- 二氯異香豆素濃度的增加而逐漸減少，而提前處理的這一組無明顯變化。與空白對照組相比，共培養(yǎng)組在 3，4-二氯異香豆素濃度20 μ M時差異顯著(Ρ<0. 05)，30μΜ、40μΜ、5μΜ時差異極顯著 (Ρ<0. 01)，而前處理組則與空白空白對照組數(shù)量相似。當細胞培養(yǎng)4天后，3，4-二氯異香豆素濃度在40 μ M和50 μ M時，細胞脫落現(xiàn)象明顯，細胞死亡的數(shù)量明顯增多。結果表明，30 μ M的3，4-二氯異香豆素濃度可以明顯控制球蟲的第二代裂殖生殖，對雞球蟲病有一定潛在的治療作用。3、卵囊數(shù)量
子孢子接種雞腎細胞8d后，通過倒置顯微鏡對子代卵囊數(shù)進行統(tǒng)計，如圖3所示，共培養(yǎng)組的子代卵囊數(shù)隨著絲氨酸蛋白酶抑制劑3，4- 二氯異香豆素濃度的增加呈現(xiàn)逐漸減少趨勢，而提前處理的這一組無明顯變化。與空白對照組相比，共培養(yǎng)組在3，4-二氯異香豆素濃度20 μ M時差異顯著(Ρ<0. 05)，30 μ M時差異不顯著(Ρ>0. 05)，40 μ Μ、50 μ M時差異極顯著(Ρ<0. 01)，而前處理組則與空白對照組數(shù)量無明顯差異。當細胞培養(yǎng)8天后，3，4-二氯異香豆素濃度在40 μ M和50 μ M時，細胞已出現(xiàn)大片脫落現(xiàn)象，可見一定濃度3，4- 二氯異香豆素對于細胞有慢性抑制生長分裂的作用。結果表明，柔嫩艾美耳球 蟲子孢子在體外培養(yǎng)的雞腎細胞中完成了整個的生活史 (如圖4)，20μΜ的3，4-二氯異香豆素濃度就可以有效控制球蟲子代卵囊產(chǎn)出量，對于病原的傳播有潛在控制作用。綜合上述實驗結果，通過3，4- 二氯異香豆素體外對球蟲子孢子侵染細胞的抑制實驗說明20 μ M的3，4- 二氯異香豆素即可有效抑制子孢子體外對雞腎細胞的侵入，同時能夠控制球蟲子代卵囊的產(chǎn)出量，對球蟲病有一定的治療作用，可以成為抗球蟲藥物的主要成分。本發(fā)明的 積極效果在于利用3，4- 二氯異香豆素對子孢子侵入細胞的抑制作用， 將3，4-二氯異香豆素應用到寄生蟲病領域，控制球蟲子代卵囊的產(chǎn)出量，制備治療抗球蟲病的藥物，用于球蟲疾病的預防和治療。


圖1、柔嫩艾美耳球蟲第一代裂殖體的數(shù)量變化； 圖2、柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖體的數(shù)量變化；
圖3、柔嫩艾美耳球蟲子代未孢子化卵囊數(shù)量變化； 圖4、柔嫩艾美耳球蟲體外培養(yǎng)的鏡檢觀察圖片；
圖中帶*號者，表示與對照相比差異顯著，帶**表示與對照相比差異極顯著。
具體實施例方式通過以下實施例進一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領域普通技術人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內。實施例1
以3，4- 二氯異香豆素作為有效成分可制成藥物學上的任何藥物劑型，包括顆粒齊U、散劑、片劑；也可以通過二甲基亞砜溶解，配制成100 μ M的溶液，使用時將溶液稀釋成 20 μ M即可。
權利要求
1.3，4-二氯異香豆素在制備抗球蟲病藥物中的用途。
2.權利要求1所述的3，4-二氯異香豆素作為有效成分可制成藥物學上的任何藥物劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了3,4-二氯異香豆素在制備抗球蟲病藥物中的用途，利用3,4-二氯異香豆素對子孢子侵入細胞的抑制作用，將3,4-二氯異香豆素應用到寄生蟲病領域，控制球蟲子代卵囊的產(chǎn)出量，制備治療抗球蟲病的藥物，用于球蟲疾病的預防和治療。
文檔編號A61P33/02GK102218057SQ20111010236
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月24日 優(yōu)先權日2011年4月24日
發(fā)明者任文陟, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李淑紅, 李 赫, 楊舉, 鄭君 申請人:吉林大學