專利名稱：酵母在制備抗球蟲病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了酵母菌在制備抗球蟲病藥物中的應(yīng)用，可以作為球蟲病疫苗的佐劑，用于預(yù)防和治療球蟲病，屬于醫(yī)學(xué)制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
球蟲是一種單細(xì)胞的寄生性原蟲，它廣泛寄生在禽類的腸上皮細(xì)胞內(nèi)，可引起宿主嚴(yán)重腹瀉、腸道出血、甚至導(dǎo)致死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。柔嫩艾美耳球蟲是球蟲中危害較為嚴(yán)重的一種疾病，在養(yǎng)雞生產(chǎn)中一直受到人們的重視。但是由于抗藥性的出現(xiàn)，使得一些抗球蟲藥物不能產(chǎn)生很好的防治球蟲病作用，藥物殘留等問題也影響了抗球蟲藥物研究的進(jìn)展。免疫保護(hù)性疫苗的研究是預(yù)防球蟲病的一個較為理想的手段，但是目前應(yīng)用的柔嫩艾美耳球蟲基因工程疫苗并不能產(chǎn)理想的免疫保護(hù)效果。酵母菌是一種單細(xì)胞生物， 屬真菌類，是生產(chǎn)面包必不可少的生物松軟劑，同時也可用于釀酒。酵母菌中蛋白質(zhì)含量特別豐富，有較高的營養(yǎng)價值。但是，酵母菌作為疫苗的佐劑并未見報道，也未見其在寄生蟲病的預(yù)防和治療中有所應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了酵母菌在制備抗球蟲病疫苗中的應(yīng)用，為一種新的醫(yī)用用途，用于球蟲疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的酵母菌可接種于300ml YPD培養(yǎng)基中，待菌液飽和后，室溫離心收集酵母菌細(xì)胞，加入200 μ L細(xì)胞裂解液重新懸浮酵母菌細(xì)胞，用酸洗過的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超聲波超聲破碎20min，測定蛋白濃度，配制成1 μ g/μ L的蛋白溶液，-20°C保存?zhèn)溆?，作為佐劑與疫苗等量混合即可。將釀酒酵母菌擴(kuò)增，然后使用玻璃珠和超聲波將酵母菌的細(xì)胞破碎，與柔嫩艾美耳球蟲亞單位疫苗混合后免疫雛雞，進(jìn)而檢測細(xì)胞免疫水平，體液免疫水平以及抗球蟲指數(shù)，驗證以酵母菌作為佐劑的亞單位疫苗對柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)作用，為雞球蟲病的防治研究提供理論依據(jù)。以下藥理實驗證明本發(fā)明的治療效果
1、柔嫩艾美耳球蟲ROM蛋白與MIC4蛋白的表達(dá)
根據(jù)GenBank中柔嫩艾美耳球蟲ROM (DQ323509)、MIC4 (AJ306453) DNA序列設(shè)計并合成兩對引物，
ROM-F :5’ -CGGGATCCAACATTTCACTGGACAAGTCG-3’， ROM-R 5' -CCGGAATTCACACGTTACTGCGAACCCGCA-3'； MIC4-F :5’ -CGCGGATCCGAA GGCGAGACAGGGAAACCTGG-3’， MIC4-R 5' -CGGAATTCCTACTGGATGTCACCA CTGTCTGCC-3，。提取柔嫩艾美耳球蟲總RNA，RT-PCR擴(kuò)增ROM基因與MIC4基因，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-R0M和pET28a-MIC4，及 I和I酶切鑒定正確后，將兩個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Wfestern-blot鑒定正確后回收ROM蛋白與 MIC4蛋白，將表達(dá)的重組蛋白制備成三種亞單位疫苗
(1)ROM蛋白與MIC4蛋白混合后制備的亞單位疫苗(1 μ g/ μ L)；
(2)ROM蛋白制備的亞單位疫苗(1 μ g/μ L)；
(3)MIC4蛋白制備的亞單位疫苗(1μ g/μ L)。
2、酵母菌在柔嫩艾美耳球蟲亞單位疫苗中的應(yīng)用
2. 1試驗分組及免疫程序設(shè)計
將酵母菌ΑΗ109接種于300ml YPD培養(yǎng)基中，待菌液飽和后，室溫1000 X g離心收集酵母菌細(xì)胞，加入200 μ L細(xì)胞裂解液重新懸浮酵母菌細(xì)胞，用酸洗過的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超聲波超聲破碎20min，測定蛋白濃度，配制成1 μ g/μ L的蛋白溶液，_20°C保存 1日齡雛雞飼養(yǎng)于無球蟲污染的鐵籠中，自由采食，自由飲水。6日齡時，將雛雞隨機(jī)分為9組，每組20只。試驗設(shè)計與免疫程序見表1。試驗分組情況如下 (Al)將Iml第一種亞單位疫苗與酵母菌破碎蛋白等量混合； (A2)第一種亞單位疫苗；
(Bi)將Iml第二種亞單位疫苗與酵母菌破碎蛋白等量混合； (B2)第二種亞單位疫苗；
(Cl)將Iml第三種亞單位疫苗與酵母菌破碎蛋白等量混合； (C2)第三種亞單位疫苗；
(D)酵母菌破碎蛋白；
(E)紅對照組；
(F)白對照組；
將各組蛋白溶液對雛雞進(jìn)行肌肉注射IOOPg/只。三免后一周口服接種萬.tenella新疆株孢子化卵囊1 X IO4個/只，紅白對照組肌肉注射PBS，紅對照組最后攻蟲，白對照組不攻蟲。
表1實驗設(shè)計與免疫程序
權(quán)利要求
1.酵母菌在制備抗球蟲病疫苗中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述疫苗的制備方法，包括以下步驟酵母菌可接種于300mlYPD培養(yǎng)基中，待菌液飽和后，室溫離心收集酵母菌細(xì)胞，加入200 μ L細(xì)胞裂解液重新懸浮酵母菌細(xì)胞，用酸洗過的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超聲波超聲破碎20min，測定蛋白濃度，配制成 1 μ g/μ L的蛋白溶液，-20°C保存?zhèn)溆?，作為佐劑與疫苗等量混合即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了酵母菌在制備抗球蟲病藥物中的應(yīng)用，利用酵母菌能夠提高機(jī)體非特異性免疫力的作用，將酵母菌應(yīng)用到寄生蟲病領(lǐng)域，將酵母菌細(xì)胞破碎后的蛋白作為球蟲病疫苗的佐劑，可以明顯增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)效果，用于球蟲疾病的預(yù)防和治療。
文檔編號A61P33/02GK102188703SQ20111010236
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月24日
發(fā)明者任文陟, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李淑紅, 李 赫, 楊舉, 鄭君, 陳玉江 申請人:吉林大學(xué)