專利名稱：一種柴胡皂苷的提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種中藥有效成分的提取純化方法，具體地說涉及一種柴胡皂苷的提取純化方法，屬于藥物有效成分的提取分離技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
柴胡為大宗常用藥材，2010版《中國藥典》規(guī)定柴胡為傘形科植物 chinense DC.或狹葉柴胡召.Mor^werifWi腫Wilid.的干燥根。柴胡具有疏肝解郁，解表和里的功效。柴胡的有效成分主要為揮發(fā)性成分和皂苷類成分，皂苷類成分種類復(fù)雜，主要有柴胡皂苷a、c、d、bl、b2、h等，其中柴胡皂苷a、d具有抑制血栓形成、增高糖皮質(zhì)激素等作用，是柴胡中的主要有效成分，通常以其為主要指標(biāo)成分，2010版《中國藥典》規(guī)定柴胡藥材的質(zhì)量控制以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總量計(jì)，不得少于0.3% (《中國藥典》2010 版，一部，263-264)。中國專利200610099498. 7公開了一種柴胡提取物的制備方法，該方法采用乙醇回流提取后減壓濃縮，得到的濃縮液經(jīng)大孔樹脂提純，收集洗脫液干燥后得到柴胡提取物。 該方法采用乙醇回流提取，乙醇用量大、耗能高，并且提取物中多糖含量高，為分離純化帶來了一定的困難。并且柴胡皂苷不穩(wěn)定，在加熱條件下，柴胡皂苷容易發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，生成活性較弱的次生皂苷。中國專利200710139343. 6公開了一種柴胡總皂苷的制備方法，該方法雖然在純化工藝過程中通過控制乙醇的含量、應(yīng)用大孔樹脂純化提取物，檢測方法采用紫外-可見分光光度法，以總皂苷得率為衡量工藝標(biāo)準(zhǔn)。但該方法仍然采用乙醇加熱回流提取柴胡藥材，仍然存在使用乙醇回流提取所存在的不足。此外，采用紫外分光光度法測定總皂苷純度的檢測手段在現(xiàn)代質(zhì)量檢測體系中
已經(jīng)使用的越來越少，檢測方法的準(zhǔn)確度和專屬性尚有待商榷。中國專利200710039351. 3公開了一種從柴胡中獲取提取物的方法，該方法中采用醋制柴胡進(jìn)行滲漉，滲漉液濃縮后取乙酸乙酯提取物制備利膽藥。該方法以醋制柴胡為原料，在酸性條件下，柴胡皂苷容易轉(zhuǎn)化成次生皂苷而降低生物活性，采用高濃度乙醇進(jìn)行滲漉，成本較高，另外，生產(chǎn)中使用大量氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)試劑，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。中國專利200710111230. 5公開了一種從柴胡中提取總皂苷的方法，該方法雖然提及提取方法可以是煎煮、加熱回流、超聲提取、冷浸、滲漉、微波提取、高壓提取等方法，但該發(fā)明旨在獲得包括廣泛的次生皂苷在內(nèi)的柴胡總皂苷。關(guān)于柴胡皂苷的分離純化，雖然現(xiàn)有技術(shù)中已廣泛使用大孔樹脂來分離純化柴胡皂苷，但是大多采用提取物稀釋后直接上樣，分離所得物質(zhì)中柴胡皂苷含量特別是柴胡皂苷d的含量較低。因此，有必要進(jìn)一步研發(fā)柴胡總皂苷含量穩(wěn)定的提取純化工藝，提高提取物純度， 降低成本，為工業(yè)生產(chǎn)、新藥研發(fā)和臨床的應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種安全、穩(wěn)定、能耗小、排污量小、高效的適合工業(yè)化生產(chǎn)的柴胡總皂苷的提取純化方法，按照本方法提取得到的提取物中，柴胡皂苷的質(zhì)量百分含量較高，且柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的質(zhì)量百分含量較高，柴胡總皂苷質(zhì)量百分含量達(dá)到50% 80%，其中柴胡皂苷a+d的總量達(dá)到35% 60% (除非特別指明，本申請(qǐng)中柴胡總皂苷、柴胡皂苷a+d的含量比例指的是占總的提取物的質(zhì)量比例)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案
一種柴胡皂苷的分離純化方法，包括(1)提取、(2)提取液回收濃縮得浸膏、(3)大孔樹脂處理、(4)洗脫液濃縮干燥等步驟，其中 步驟(1)中所述提取的方法如下
將柴胡藥材用PH值為7-12的堿性溶劑浸泡12-4 后，進(jìn)行滲漉/加壓滲漉提取，得提取液，所述滲漉/加壓滲漉的流速為5 500mL/min，所述滲漉/加壓滲漉的流速優(yōu)選為 5 200mL/min，特別優(yōu)選為5_15 mL/min,所用堿性溶劑的體積為藥材體積的5 20倍，優(yōu)選為藥材體積的8-15倍；
步驟(2)中所說提取液回收濃縮得浸膏的方法可以選用任何常規(guī)的濃縮方法，優(yōu)選將收集的滲漉液于30-80°C減壓濃縮至無醇味，優(yōu)選的濃縮條件為40°C -70°C減壓濃縮；
步驟(3)中所述大孔樹脂可以是D4020、SP825、HPD100, D101、HP20或AB-8，大孔樹脂處理的方法如下將步驟(2)所得濃縮浸膏用水稀釋至柴胡總皂苷含量為0. 01 0. 05g/ mL (相當(dāng)于生藥lg-5g/mL)，調(diào)節(jié)pH值至7_12后上徑高比為1:1-1:5的大孔樹脂柱，靜置吸附1 6小時(shí)，攪拌吸附4 10小時(shí)，再動(dòng)態(tài)吸附，吸附流速IBV (柱體積)/h-;3BV/h ；待藥液吸附完全后，進(jìn)行洗脫，洗脫流速為lBV-2BV/h，所用洗脫劑為水、堿水、乙醇、甲醇或者其中幾種溶劑的組合，收集洗脫液。上述柴胡皂苷的分離純化方法中所述藥材可以是新鮮柴胡藥材，也可以是使用超臨界提取過揮發(fā)油的柴胡藥材，使用新鮮柴胡藥材時(shí)的藥材產(chǎn)地加工方法，可以采用傳統(tǒng)的采收、晾曬、清洗、浸潤、切片、晾曬/干燥的工藝；
進(jìn)一步的，為了盡可能減少有效成分的損失，所述藥材產(chǎn)地加工方法可以采用如下方
法
采收新鮮柴胡藥材，立即清洗、切片、晾曬/干燥，最后粉碎。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，藥材產(chǎn)地加工方法中所述清洗的具體方法為 用流動(dòng)的水沖洗，藥材切片后干燥粉碎；
干燥的條件為在40 50°C烘2 4h ； 粉碎方法為將干燥的北柴胡藥材粉碎至10-20目。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(1)中所述堿性溶劑優(yōu)選PH值為9-11的堿性乙醇溶液，最優(yōu)選體積百分濃度為30%-70%的pH值為9-11的堿性乙醇溶液；調(diào)節(jié)pH 值的試劑可以為酒石酸鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉或氨水，優(yōu)選無水碳酸鈉、碳酸氫鈉或氨水。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(3)大孔樹脂處理中大孔樹脂柱的徑高比優(yōu)選為1:2 1:4。
上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(3)中大孔樹脂處理過程中所述吸附攪拌吸附的方法為在大孔樹脂中使用攪拌器攪拌吸附(攪拌器轉(zhuǎn)速優(yōu)選為60-180轉(zhuǎn)/min)，或用氣泵通入空氣(空氣流速優(yōu)選為18L/min-50L/min)使藥液流動(dòng)，達(dá)到攪拌樹脂的目的， 使樹脂與藥液充分吸附6-10小時(shí)。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(3)大孔樹脂處理中所述洗脫的方法優(yōu)選以下方法用水沖洗除雜，再用乙醇梯度洗脫，先用體積百分濃度為10% 50%的乙醇洗脫除雜，優(yōu)選體積百分濃度為30% 35%的乙醇；再用體積百分濃度為70% 80%的乙醇洗脫；收集體積百分濃度為60% 95%的乙醇洗脫液，優(yōu)選70% 80%的乙醇洗脫液，得到柴胡皂苷洗脫液；
所述洗脫方法中除雜所用水的用量為2 6BV (柱體積)，洗脫除雜乙醇的用量為 2-6BV，洗脫乙醇的用量為5 8BV。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(3)中所述大孔樹脂處理所用大孔樹脂優(yōu)選AB-8、DlOl、D4020，特別優(yōu)D4020、DlOl弱極性大孔吸附樹脂。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(3)大孔樹脂處理中所述pH值優(yōu)選為 7. 5-9，調(diào)節(jié)pH值的試劑可以是酒石酸鈉，無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水中的一種。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(3)中所述大孔樹脂處理方法中，樹脂使用 2 4次后進(jìn)行再生。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(3)中所述大孔樹脂處理方法中，上樣之前采用離心、抽濾、超濾等方法進(jìn)行處理。上述柴胡皂苷的分離純化方法中，步驟(4)中所述洗脫液濃縮方式優(yōu)選為 40-70°C減壓濃縮。柴胡皂苷為一類在其結(jié)構(gòu)中的C-1348位之間含有環(huán)氧醚鍵的皂苷，如柴胡皂苷 a、c、d等。該類皂苷不穩(wěn)定，在加熱(如煎煮等)及植物中酸性成分的雙重作用下，易發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，生成一系列活性較弱的次生柴胡皂苷，如柴胡皂苷bl、b2、h等。為了避免這些柴胡皂苷的次生化，需要控制嚴(yán)格的提取條件，如溶劑酸堿性、加熱溫度和時(shí)間等，且需要盡可能地避免柴胡皂苷的轉(zhuǎn)變。本發(fā)明采用滲漉/加壓滲漉的方法從柴胡藥材中提取柴胡皂苷，并且調(diào)節(jié)滲漉溶劑為堿性，并且在使用大孔樹脂對(duì)柴胡提取物進(jìn)行分離提純時(shí)，采用堿性上樣，可盡可能地避免柴胡皂苷轉(zhuǎn)變?yōu)榇紊碥?，由此可提高柴胡皂苷提取物的生物活性。尤其是，發(fā)明人在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高濃度醇反而不利于有效成分溶出，因此，本發(fā)明的柴胡皂苷提取分離方法在滲漉中優(yōu)先采用中低濃度的堿性乙醇作為溶劑。進(jìn)一步的，本發(fā)明還進(jìn)一步優(yōu)化了提取分離的工藝條件，包
括
1、在柴胡產(chǎn)地對(duì)藥材進(jìn)行初加工，由以前的采收、晾曬、清洗、浸潤、切制、干燥的工序，改為采收、清洗、切制、干燥四個(gè)步驟，大大縮短了藥材準(zhǔn)備時(shí)間，節(jié)約勞力，防止浸潤步驟中有效成分損失。2、本發(fā)明提取的原料還可以使用超臨界提取過揮發(fā)油的柴胡藥材，超臨界提取溫度低，時(shí)間短，經(jīng)測定，提取揮發(fā)油的藥材皂苷損失很小，且可以達(dá)到除雜的效果，本發(fā)明利用這一特點(diǎn)，最大限度利用藥材，保護(hù)資源。
3、本發(fā)明采用低、中濃度乙醇滲漉，與現(xiàn)有的回流提取，高速逆流液相色譜、微波提取、超聲提取等技術(shù)相比，僅需要滲漉桶，溶劑回收罐，層析柱等簡單設(shè)備即可，設(shè)備投資低，水、電、氣等能源消耗小，技術(shù)適用面廣，且有較高的得率。4、本發(fā)明選用堿性pH值在7-12范圍內(nèi)滲漉，優(yōu)選大孔樹脂純化堿性pH值在 7. 5-9的范圍內(nèi)上樣，在提高總皂苷得率的同時(shí)，在純化過程中能有效地防止柴胡皂苷a和柴胡皂苷d結(jié)構(gòu)變化，總皂苷得率及純度均較其他堿性范圍佳。5、大孔樹脂上樣時(shí)增加攪拌器攪拌或通入空氣攪動(dòng)樹脂和藥液，吸附6-10小時(shí)的步驟，使樹脂和藥液充分接觸，使皂苷完全吸附，減少損失。6、對(duì)大孔樹脂的徑高比進(jìn)行調(diào)節(jié)，經(jīng)過試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，徑高比升高更有利于皂苷吸附和洗脫，本發(fā)明采用的低徑高比以往慣用的徑高比1:10吸附效率高。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的柴胡皂苷提取分離方法，優(yōu)化了整個(gè)工藝流程中的各工藝條件，在上述工藝條件的協(xié)同作用下，提取物得率高，純度高，在最大限度提取柴胡皂苷的同時(shí)，最大可能地提高柴胡皂苷
a和柴胡皂苷d的含量，為提高中藥制劑的療效提供有力保證。并且本發(fā)明的工藝中僅需要滲漉桶，溶劑回收罐，層析柱等簡單設(shè)備即可，設(shè)備投資低，水、電、氣等能源消耗小，技術(shù)適用面廣。經(jīng)高效液相及比色法測定柴胡總皂苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，按照本發(fā)明的分離純化方法所得的柴胡皂苷提取物中，柴胡總皂苷含量達(dá)到50% 80%，其中柴胡皂苷a+d的總量達(dá)到35% 60%。應(yīng)用本發(fā)明的柴胡皂苷提取物在抗腫瘤、抗炎、免疫系統(tǒng)疾病中有很好的療效，可以根據(jù)實(shí)際需要，制成口服的固體或液體制劑。


圖1柴胡皂苷a和柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品圖譜。圖2為樣品液相圖。圖3為不同提取方法的比較。圖4為pH值的考察結(jié)果。圖5為不同樹脂型號(hào)的比較。圖6為不同pH值對(duì)吸附量的影響。圖7為樹脂使用次數(shù)的吸附量的影響。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合試驗(yàn)例及具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明列舉的柴胡皂苷的分離純化方法，包括以下工藝步驟
(1)提取；將柴胡藥材用堿性溶劑浸泡后，進(jìn)行滲漉或加壓滲漉提取，得提取液；
(2)提取液40°C-70°C減壓濃縮得浸膏；
(3)大孔樹脂處理將步驟(2)所得濃縮浸膏用水稀釋至柴胡總皂苷含量為0.01 0. 05g/mL (相當(dāng)于生藥lg-5g/mL)，調(diào)節(jié)pH值至7_12后上大孔樹脂柱，靜置吸附1 4小時(shí)，攪拌吸附6 10小時(shí)；待藥液吸附完全后，進(jìn)行洗脫，所用的洗脫劑為水、堿水、乙醇、甲醇或者其中幾種溶劑的組合；
(4)洗脫液濃縮干燥步驟40-7(TC減壓濃縮、干燥，得柴胡皂苷提取物。
步驟(1)中所述柴胡藥材可以是新鮮柴胡藥材，也可以是也可以是使用超臨界提取過揮發(fā)油的柴胡藥材，使用新鮮柴胡藥材時(shí)的藥材產(chǎn)地加工方法如下
采收新鮮北柴胡藥材，立即用流動(dòng)的水沖洗，將清洗后的柴胡藥材切制成2 IOmm的切片，將切片于40 50°C烘2 4h進(jìn)行干燥，然后粉碎至10-20目。本發(fā)明列舉的實(shí)施例中，調(diào)節(jié)pH值的試劑可以為酒石酸鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉或氨水，優(yōu)選無水碳酸鈉、碳酸氫鈉或氨水。實(shí)施例1
取新鮮北柴胡藥材1kg，清洗、切片、晾曬/干燥后，粉碎至10目，加入8倍藥材體積的 50%(v/v)、pH值為8的乙醇浸泡12小時(shí)，進(jìn)行滲漉，滲漉流速為5mL/min，收集滲漉液，60°C 減壓濃縮成稀浸膏，再加PH值為8的堿水將濃縮浸膏稀釋至柴胡總皂苷含量約為0. 01g/mL (相當(dāng)于生藥lg/mL)，將稀釋藥液上DlOl大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比為1:1，靜置吸附池， 攪拌吸附4h，再動(dòng)態(tài)吸附，吸附流速為lBV/h，然后用4BV水洗柱除雜，再用2BV10% (ν/ν) 乙醇除雜；70% (ν/ν)乙醇5BV洗脫，洗脫流速2BV/h，收集70% (ν/ν)乙醇洗脫液，60°C減壓濃縮，濃縮液凍干成淡黃色粉末。檢測可得柴胡皂苷a+d含量為34. 51%，總皂苷含量為 63. 74%ο檢測方法
1、用HPLC測定樣品中柴胡皂苷 d的含量
高效液相色譜條件如下
色譜柱Diamonsil C18(250X4. 6mm)；
流動(dòng)相乙腈-甲醇-水梯度洗脫，洗脫程序表1所示
表1、洗脫程序
權(quán)利要求
1.一種柴胡皂苷的分離純化方法，包括(1)提取、(2)提取液回收濃縮得浸膏、(3)大孔樹脂處理、(4)洗脫液濃縮干燥步驟，其特征在于步驟(1)中所述提取的方法為將柴胡藥材用PH值為7-12的堿性溶劑浸泡12-4 后，進(jìn)行滲漉/加壓滲漉提取，得提取液，所述滲漉/加壓滲漉的流速為5 500mL/min，所用堿性溶劑的體積為藥材體積的 5 20倍；步驟(2)中所述提取液回收濃縮得浸膏的方法為將收集的滲漉液于30-80°C減壓濃縮至無醇味；步驟(3)中所述大孔樹脂為D4020、SP825、HPD100、D101、HP20或AB-8 ；所述大孔樹脂處理的方法如下將步驟(2)所得濃縮浸膏用水稀釋至柴胡總皂苷含量為0. 01 0. 05g/ mL,調(diào)節(jié)pH值至7-12后上徑高比為1:1-1:5的大孔樹脂柱，靜置吸附1 6小時(shí)，攪拌吸附4 10小時(shí)，再動(dòng)態(tài)吸附，吸附流速為lBV/hlBV/h;待藥液吸附完全后，進(jìn)行洗脫，洗脫流速為lBV-2BV/h，所用洗脫劑為水、堿水、乙醇、甲醇或者其中幾種溶劑的組合，收集洗脫液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(1)中所述堿性溶劑為PH值為9-11的堿性乙醇溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(1)中所述堿性溶劑為體積百分濃度為30%-70%的pH值為9-11的堿性乙醇溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(1)中所述滲漉 /加壓滲漉的流速為5-200mL/min，所用溶劑的體積為藥材體積的8_15倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(2)中所述濃縮方法的濃縮條件為40°C -70°C減壓濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(3)大孔樹脂處理中大孔樹脂柱的徑高比為1:2 1:4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(3)大孔樹脂處理中所述洗脫的方法為用水沖洗除雜，再用乙醇梯度洗脫，先用體積百分濃度為10% 50%的乙醇洗脫除雜；再用體積百分濃度為60% 95%的乙醇洗脫；收集體積百分濃度為 60% 95%的乙醇洗脫液，得到柴胡皂苷洗脫液；所述洗脫方法中除雜所用水的用量為2 6柱體積，洗脫除雜乙醇的用量為2-6柱體積，洗脫乙醇的用量為5 8柱體積。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(3)大孔樹脂處理中洗脫所用的乙醇的體積百分濃度為30% 35%;洗脫所用乙醇的體積百分濃度為 70% 80%ο
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(3)中所述大孔樹脂處理所用大孔樹脂為AB-8、DlOl或D4020。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柴胡皂苷的分離純化方法，其特征在于步驟(3)大孔樹脂處理中所述pH值為7. 5-9，調(diào)節(jié)pH值的試劑為酒石酸鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉或氨水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種柴胡皂苷的提取純化方法。該皂苷部位主要含柴胡皂苷a，柴胡皂苷d。該提取物可由滲漉或高壓滲漉中某一種方法制得，應(yīng)用乙醇溶液提取柴胡藥材，在純化工藝過程中，選用大孔樹脂純化，所制得的柴胡皂苷提取物中柴胡皂苷a+d的總量占提取物的30～60%，總皂苷占提取物的50～80%。本發(fā)明操作簡單，生產(chǎn)成本低，節(jié)約能源，提取效率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K36/233GK102166235SQ20111010340
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者余伯陽, 寇俊萍, 戚進(jìn), 楊興旺, 楊占國, 索志榮, 馬家驊, 馬璇 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué), 四川德培源中藥科技開發(fā)有限公司, 西南科技大學(xué)