專利名稱：糖酵解抑制劑的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖酵解抑制劑的新用途。具體的，本發(fā)明涉及糖酵解抑制劑在治療哺乳動物雷帕霉素靶蛋白及其上游通路異?；罨瘜?dǎo)致的哺乳動物腫瘤或其它疾病中的新用途。
背景技術(shù)：
糖代謝異常是腫瘤細胞的一個重要特征，大多數(shù)正常細胞在氧氣存在時是通過糖的有氧氧化來獲得能量，只有在缺氧時才通過糖酵解進行代謝。而腫瘤細胞則無論氧氣存在與否都主要依賴糖酵解來進行葡萄糖的代謝，并伴有大量乳酸的產(chǎn)生，稱為有氧糖酵解。這一現(xiàn)象最早由OttoWarburg發(fā)現(xiàn)，也稱為Warburg效應(yīng)(參見，Warburg, 0.，On the origin ofcancer cells. Science, 1956. 123 (3191) :p. 309-14)。糖酵解的許多中間產(chǎn)物被腫瘤細胞利用合成蛋白質(zhì)、核酸及脂類，從而為其本身的生長和增殖提供了必需的物質(zhì)基礎(chǔ)，然而這種代謝特征究竟是癌癥產(chǎn)生的原因還是癌細胞代謝改變的結(jié)果，則是長期困擾醫(yī)學(xué)界的難題。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常是腫瘤的重要特征。其中，膜受體酪氨酸激酶(RTKs)_PI3K/ PTEN-AKT-TSCl/2-mTOR信號通路在控制細胞的生長、增殖等生命過程中起著重要作用，該通路包含有很多原癌基因如RTKs、PI3K、AKT和mTOR，抑癌基因如PTEN和TSC1/TSC2，這些上游因子的異常激活或失活都將導(dǎo)致mTOR信號通路的過度活化而引起各種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生，在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)有mTOR信號通路的異常激活(參見，Chen, Y. L.， P. Y. Law,and H. H. Loh,Inhibition of PI3K/Akt signaling :an emerging paradigm for targeted cancer therapy. Curr Med Chem AnticancerAgents,2005. 5(6) :p·575-89)，但其失調(diào)導(dǎo)致疾病發(fā)生的具體機制還不是很清楚，因此近年來對該通路的研究已成為疾病靶向治療及藥物研發(fā)的焦點(參見，Manning, B. D. and L. C. Cant ley, AKT/PKB signaling navigatingdownstream. Cell, 2007. 129 (7) :p. 1261-74 ；Sabatini, D. Μ. , mTOR and cancer insights into a complex relationship. Nat Rev Cancer,2006. 6(9) :p.729-34 ; Hennessy,B.Τ.,et al. ,Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drugdiscovery. Nat Rev Drug Discov,2005. 4(12) :p.988-1004)。mTOR (Gene ID :2475)是一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在感受營養(yǎng)和能量信號，調(diào)節(jié)蛋白合成和自噬水平，進而調(diào)控細胞生長和代謝方面起著關(guān)鍵性的作用，與很多癌癥的發(fā)病與治療有著密切的關(guān)系。mTOR通路抑制劑是雷帕霉素(Rapamycin，R)，又名西羅莫司(Sirolimus)，分子式為 C51H79N013。其衍生有 RAD001 (Everolimus)，CCI779 (Temsirolimus)，ridaforolimus 等。雷帕霉素是大環(huán)內(nèi)酯抗生素，具有免疫抑制劑和抗癌作用。當(dāng)它與FKBP12構(gòu)成復(fù)合體后可與mTOR結(jié)合并抑制mTOR活性，同時雷帕霉素有將細胞周期阻斷在Gl期的作用。在實際應(yīng)用過程中，雷帕霉素作為一種免疫抑制劑，在用于治療mTOR活化導(dǎo)致的腫瘤如TSC突變引起的肺淋巴管肌瘤病、結(jié)節(jié)硬化癥等的過程中，雷帕霉素的不良反應(yīng)比較多，停藥后也會有不同程度的復(fù)發(fā)現(xiàn)象，因此成為限制其使用的一個重要原因。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糖酵解抑制劑的新用途，糖酵解抑制劑由于能特異性抑制糖酵解途徑，有針對性的治療mTOR活化所導(dǎo)致的腫瘤，毒副反應(yīng)較小，能夠取得更好的療效。本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明提供了糖酵解抑制劑在制備用于治療哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (Mammalian target of rapamycin, mTOR)及其上游通路異?；罨瘜?dǎo)致的哺乳動物腫瘤或其它疾病的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述糖酵解抑制劑選自3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate，3-BrPA)、 二氯乙酸(Dichloroacetate，DCA)、氯尼達明(Ionidamine)、2_ 脫氧-D-葡萄糖 (2-deoxyglucose)、siRNA、microRNA，多月太禾口抗體。優(yōu)選地，所述糖酵解抑制劑與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑聯(lián)合用藥。優(yōu)選地，所述哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑為雷帕霉素或其衍生物。優(yōu)選地，所述哺乳動物包括人。優(yōu)選地，所述雷帕霉素靶蛋白及其上游通路活化導(dǎo)致的哺乳動物腫瘤或疾病選自成神經(jīng)管細胞瘤；肺癌；白血病；多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合癥或Barmayan-Z0nana綜合癥、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和晚期膠質(zhì)瘤；肺淋巴管肌瘤病、結(jié)節(jié)硬化癥、或結(jié)節(jié)硬化癥相關(guān)的皮膚病變；纖維神經(jīng)瘤病、腎錯構(gòu)瘤、糖尿病黃斑水腫、老年性黃斑變性；多囊性腎病、前列腺癌；黑斑息肉綜合癥、家族心臟肥大和肺癌；肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤寸。優(yōu)選地，所述結(jié)節(jié)硬化癥相關(guān)的皮膚病變包括面部血管纖維瘤(皮脂腺瘤)和色素脫失斑。由此可見，本發(fā)明在探討糖酵解抑制劑在mTOR通路活化導(dǎo)致的腫瘤的作用方式的基礎(chǔ)上，提出了利用該作用方式在mTOR通路活化導(dǎo)致的腫瘤中的用途。本發(fā)明提供了應(yīng)用糖酵解抑制劑如3-BrPA和DCA等治療由于mTOR活化導(dǎo)致的腫瘤或其他疾病，或聯(lián)合應(yīng)用糖酵解抑制劑和mTOR信號通路抑制劑進行治療，可能成為達到更好療效的一種新的用途。TSC1/TSC2蛋白復(fù)合體是mTOR信號通路的主要負調(diào)節(jié)因子(參見，Kwiatkowski， D. J.，et al.，A mouse model of TSCl reveals sex-dependent lethality from liver hemangiomas, and up—regulation of p70S6kinase activityin Tsclnull cells. Hum Mol Genet, 2002. 11 (5) :p. 525-34 ；Potter, C. J. , L. G. Pedraza, and T. Xu, Akt regulates growth by directly phosphorylating Tsc2. Nat Cell Biol,2002. 4(9) :p. 658-65)。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，由TSCl或TSC2敲除導(dǎo)致的mTOR功能亢進會促進細胞糖酵解水平的增加， mTOR活化的小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse Embryonic Fibroblast, MEF)細胞中，其葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生顯著高于野生型細胞，因此推斷mTOR活化致瘤的機制之一可能是通過增強細胞糖酵解來實現(xiàn)的。因此，mTOR與腫瘤糖酵解之間潛在的功能性聯(lián)系可能對腫瘤生長起重要作用，特異性干預(yù)腫瘤細胞有氧糖代謝，如阻抑糖酵解通路中若干關(guān)鍵酶，以及糖酵解抑制劑與mTOR通路抑制劑的聯(lián)合用藥等，可能為mTOR過度活化所致腫瘤或其它疾病的治療提供新的策略。本發(fā)明明確了 mTOR和糖酵解之間的關(guān)系，首先通過檢測多種具有特定遺傳背景的野生型和TSC1、TSC2以及PTEN突變導(dǎo)致mTOR高度活化的小鼠成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)，發(fā)現(xiàn)mTOR高度活化后細胞的葡萄糖消耗水平和乳酸產(chǎn)生水明顯高于野生型細胞，即mTOR活化可以導(dǎo)致糖酵解上調(diào)。其次，應(yīng)用糖酵解抑制劑3-BrPA 可使mTOR活化細胞的生長明顯受到抑制，同時，聯(lián)合應(yīng)用3-BrPA和mTOR通路抑制劑雷帕霉素后可顯著降低細胞的增殖，具有協(xié)同作用的效應(yīng)。本發(fā)明證實了 mTOR高度活化細胞中的糖酵解水平升高，應(yīng)用糖酵解抑制劑能夠使mTOR活化細胞的生長明顯受到抑制，從而推斷mTOR活化致瘤的機制可能是通過增強細胞糖酵解來實現(xiàn)的。因此，特異性干預(yù)腫瘤細胞有氧糖代謝，如應(yīng)用糖酵解抑制劑，阻抑糖酵解通路中若干關(guān)鍵酶，以及一些藥物與mTOR通路抑制劑的聯(lián)合用藥等，都可能為mTOR過度活化所致腫瘤的治療提供新的策略，具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明中所使用的糖酵解抑制劑，如3-BrPA、DCA等制劑，由于能特異性抑制糖酵解途徑，有針對性的治療mTOR活化所導(dǎo)致的腫瘤，毒副反應(yīng)較小，因此取得更好的療效。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1表示多種人類疾病與mTOR及其上游通路的關(guān)系示意圖，圖中框線里的字體代表疾病名稱，從框線引出的直線指向其相關(guān)的蛋白；圖2表示mTOR活化促進糖酵解上調(diào)的實驗結(jié)果示意圖。圖中A為Tscl基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞(以Tscl-/-表示)和相應(yīng)的野生型細胞(以Tscl+/+表示)，R+表示添加雷帕霉素，R-表示未添加雷帕霉素，縱坐標(biāo)為培養(yǎng)液中葡萄糖消耗和乳酸生成水平； 圖中B為Tsc2基因敲除的MEF細胞(以Tsc2-/-表示)和相應(yīng)的野生型細胞(以Tsc2+/+ 表示)，R+表示添加雷帕霉素，R-表示未添加雷帕霉素，縱坐標(biāo)為培養(yǎng)液中葡萄糖消耗和乳酸生成水平；圖中C為Pten基因敲除的MEF細胞(以Pten-/-表示)和相應(yīng)的野生型細胞 (以Pten+/+表示)，R+表示添加雷帕霉素，R-表示未添加雷帕霉素，縱坐標(biāo)為培養(yǎng)液中葡萄糖消耗和乳酸生成水平；誤差線代表三次實驗的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，P < 0. 05 ；圖3表示3-BrPA阻斷糖酵解通路可抑制mTOR活化細胞增殖的實驗結(jié)果圖；誤差線代表三次實驗的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，P < 0. 05。圖4表示相對于野生型細胞，不同濃度的3-BrPA阻斷糖酵解通路可更有效地抑制mTOR活化細胞增殖的實驗結(jié)果示意圖，Tsc2-/-表示Tsc2基因敲除的MEF細胞，即 Tsc2-/"MEF細胞，wt表示相應(yīng)的野生型細胞；縱坐標(biāo)為細胞存活率；誤差線代表三次實驗的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，P < 0. 05 ；圖5表示糖酵解通路抑制劑3-BrPA與mTOR通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可顯著降低mTOR 活化細胞增殖的實驗結(jié)果示意圖，圖中R+代表添加雷帕霉素的Tsc2-/-MEF細胞，R-代表未添加雷帕霉素的iTscZ-Zi-MEF細胞，3-BrPA+代表添加3-BrPA的Tsc2-/_MEF細胞， 3-BrPA-代表未添加3-BrPA的Tsc2-/-MEF細胞；縱坐標(biāo)為細胞存活率；誤差線代表三次實驗的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，P < 0. 05 ；
圖6表示3-BrPA與Rapamycin聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同抑制mTOR活化細胞PC3在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力的實驗結(jié)果示意圖；縱坐標(biāo)為相對腫瘤體積；圖7表示RTK-PI3K-AKT-mT0R通路通過促進糖酵解調(diào)節(jié)細胞增殖和腫瘤發(fā)生的示意圖。當(dāng)受體酪氨酸激酶被激活，PI3K活化AKT，AKT磷酸化TSC2，同時減少TSC1/TSC2復(fù)合物對Iiheb-GTP的GAP活性，提高Iiheb-GTP水平。Iiheb-GTP活化mTOR，隨之mTOR通過促進糖酵解調(diào)節(jié)細胞增殖和腫瘤發(fā)生。
具體實施例方式實施例1 :mT0R信號通路和糖酵解之間的關(guān)系為明確mTOR信號通路和糖酵解之間的關(guān)系，我們首先收集了正常培養(yǎng)和加入mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素(Rapamycin，購自sigma公司，貨號為R0395)培養(yǎng)的 PTEN, TSCl, TSC2基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞(參見，Kwiatkowski, D. J.，et al.， A mouse model of TSCl revealssex-dependent lethality from liver hemangiomas, and up-regulation of p70S6kinase activity in Tsclnull cells. Hum Mol Genet,
2002.11 (5) :p. 525-34 ；Zhang, H. , et al. , Loss of Tscl/Tsc2 activates mTOR and disrupts P13K-Aktsignaling through downregulation of PDGFR. J Clin Invest,
2003.112(8) :p. 1223-33.) (MEF，Pten-/-，Tscl-/-，Tsc2-/_)和相應(yīng)野生型細胞(wt)的上清液，之后用EKF-diagnostic公司的乳酸分析儀(BI0SEN C line, Clinic)檢測了培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸水平，如圖2所示，結(jié)果顯示mTOR高度活化的細胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量均高于野生型細胞，經(jīng)Rapamycin處理之后可降低二者的水平，說明mTOR功能亢進會促進細胞糖酵解水平的增加。實施例2 糖酵解抑制劑能夠阻礙mTOR活化細胞的增殖由于mTOR過度活化可導(dǎo)致糖酵解水平上調(diào)，因此我們推斷mTOR活化致瘤的機制可能是通過增強細胞糖酵解來實現(xiàn)的，因此應(yīng)用糖酵解抑制劑可能會阻礙mTOR活化細胞的增殖。將生長狀態(tài)良好的3-5 X IO3個Tsc2-/-MEF細胞分別接種于4個96孔板，待細胞貼壁后加入20 μ M3-BrPA(3-溴丙酮酸)處理24h、48h和72h后，MTT法檢測細胞增殖，每組3個復(fù)孔，以未加藥物組為對照，如圖3所示，添加3-BrPA的Tsc2-/-MEF細胞相比未添加3-BrPA的Tsc2-/"MEF細胞的增長明顯受到抑制。此外，我們將3X IO3 5X IO3個wt 和Tsc2-/-MEF細胞(Tsc2基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞)分別接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后用不同濃度的糖酵解抑制劑3-BrPA (濃度范圍從0 μ M到40 μ Μ)分別處理細胞后培養(yǎng)48小時，MTT比色法檢測細胞的增殖情況。如圖4所示，結(jié)果顯示Tsc2-/-細胞對 3-BrPA的敏感性顯著高于野生型細胞，即糖酵解抑制劑可使mTOR活化細胞的生長明顯受到抑制。同時，用3-BrPA和mTOR抑制劑Rapamycin聯(lián)合處理Tsc2-/_細胞，如圖5所示， 表明3-BrPA和mTOR抑制劑Rapamycin可對細胞的增殖產(chǎn)生協(xié)同抑制效應(yīng)。^MM 3 酵解抑泡丨齊!I可用于mTOR過It丨舌化所致腫瘤 妨臺療為進一步研究糖酵解抑制劑可用于mTOR過度活化所致腫瘤的治療，我們采用了裸鼠成瘤模型進行藥物治療的體內(nèi)實驗。首先將PTEN缺失的人前列腺癌細胞系PC3細胞 (購自ATCC)以1 X IO6皮下接種于4-6周齡裸鼠，當(dāng)腫瘤體積為60-100mm3時將裸鼠分為四組，分別應(yīng)用3-BrPA (6mg/kg)和Rapamycin (0. 02mg/kg)進行單藥治療和聯(lián)合治療，每周兩次。結(jié)果如圖6所示，兩種藥物的小劑量聯(lián)合應(yīng)用能明顯抑制腫瘤的生長，在體內(nèi)同樣產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)。為糖酵解抑制劑與雷帕霉素聯(lián)合治療mTOR過度活化所致疾病提供了理論 ■石出。以上結(jié)果表明，糖酵解抑制劑如3-BrPA以及與雷帕霉素的聯(lián)合用藥可以成為 RTK-PI3K-AKT-mT0R通路過度活化所導(dǎo)致疾病的新的治療方法。本發(fā)明通過實驗證實， 可以使用糖酵解抑制劑，如3-BrPA、DCA等制劑，以及對糖酵解通路有抑制作用的siRNA、 microRNA，多肽和抗體等治療可以使用mTOR抑制劑雷帕霉素治療的腫瘤和其它疾病，同時，糖酵解抑制劑與雷帕霉素的聯(lián)合用藥也可能對疾病的治療達到更好的效果。綜上所述，mTOR與糖酵解通路潛在的功能性相互作用可能對腫瘤生長起重要作用，因此，在證實糖酵解通路的抑制劑可以抑制mTOR活化細胞的增殖之后，則由于mTOR活化導(dǎo)致的腫瘤或其他疾病均可以被糖酵解通路抑制劑所治療。換言之，現(xiàn)有mTOR抑制劑雷帕霉素可以治療的腫瘤或其他疾病均可以被糖酵解通路抑制劑所治療，或聯(lián)合應(yīng)用糖酵解抑制劑和mTOR信號通路抑制劑進行治療，從而為mTOR活化導(dǎo)致的腫瘤或其他疾病的治療提供一條新的途徑。本發(fā)明的應(yīng)用范圍主要是mTOR及其上游通路活化導(dǎo)致的哺乳動物包括人的腫瘤，包括PDGFR突變引起的成神經(jīng)管細胞瘤，EGFR突變引起的肺癌、AKT突變引起的肺癌， PII突變引起的白血病，PTEN突變引起的多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合癥或Barmayan-Z0nana綜合癥、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和晚期膠質(zhì)瘤，TSCl或TSC2突變引起的肺淋巴管肌瘤病、結(jié)節(jié)硬化癥、或結(jié)節(jié)硬化癥相關(guān)的皮膚病變?nèi)缑娌垦芾w維瘤(皮脂腺瘤)、色素脫失斑，NFl突變引起的纖維神經(jīng)瘤病、腎錯構(gòu)瘤、糖尿病黃斑水腫、老年性黃斑變性，PKHDl突變引起的多囊性腎病、前列腺癌，LKB 1突變引起黑斑息肉綜合癥、家族心臟肥大和肺癌，G0LPH3突變引起的肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤等。
權(quán)利要求
1.糖酵解抑制劑在制備用于治療哺乳動物雷帕霉素靶蛋白及其上游通路活化導(dǎo)致的哺乳動物腫瘤或疾病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述糖酵解抑制劑選自3-溴丙酮酸、二氯乙酸、氯尼達明、2-脫氧-D-葡萄糖、siRNA、micr0RNA、多肽和抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述糖酵解抑制劑與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑聯(lián)合用藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的用途，其特征在于，所述哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑為雷帕霉素或其衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的用途，其特征在于，所述哺乳動物包括人。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素靶蛋白及其上游通路活化導(dǎo)致的哺乳動物腫瘤或疾病選自成神經(jīng)管細胞瘤；肺癌；白血??；多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合癥或Barmayan-Z0nana綜合癥、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和晚期膠質(zhì)瘤；肺淋巴管肌瘤病、結(jié)節(jié)硬化癥、或結(jié)節(jié)硬化癥相關(guān)的皮膚病變；纖維神經(jīng)瘤病、腎錯構(gòu)瘤、糖尿病黃斑水腫、老年性黃斑變性；多囊性腎病、前列腺癌；黑斑息肉綜合癥、家族心臟肥大和肺癌；肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的用途，其特征在于，所述結(jié)節(jié)硬化癥相關(guān)的皮膚病變包括面部血管纖維瘤/皮脂腺瘤和色素脫失斑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種糖酵解抑制劑的新用途。本發(fā)明基于雷帕霉素靶蛋白高度活化細胞中的糖酵解水平升高，應(yīng)用糖酵解抑制劑能夠使mTOR活化細胞的生長明顯受到抑制，從而提供了糖酵解抑制劑在制備用于治療哺乳動物雷帕霉素靶蛋白及其上游通路活化導(dǎo)致的哺乳動物腫瘤或疾病的藥物中的用途。糖酵解抑制劑由于能特異性抑制糖酵解途徑，有針對性的治療mTOR活化所導(dǎo)致的腫瘤，毒副反應(yīng)較小，因此能取得更好的療效。
文檔編號A61P13/12GK102225201SQ20111010897
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日
發(fā)明者孫倩, 張宏冰 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所