專(zhuān)利名稱(chēng)：增殖干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增殖干細(xì)胞的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及糖胺聚糖類(lèi)或蛋白聚糖類(lèi)在先體外后體內(nèi)培養(yǎng)中促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)保護(hù)其多能性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在身體的所有組織中，存在成體干細(xì)胞亞群。募集并且活化這些多能細(xì)胞以便使其參與組織再生。成體干細(xì)胞為療法富有希望的來(lái)源，但其數(shù)量極低并且它們需要在體外增殖以便具有治療應(yīng)用。當(dāng)先體外后體內(nèi)培養(yǎng)這些細(xì)胞時(shí)，已經(jīng)證實(shí)難以再造其天然微環(huán)境，認(rèn)為所述微環(huán)境是來(lái)自與胞外基質(zhì)和相鄰細(xì)胞的相互作用的信號(hào)與微環(huán)境的激素狀態(tài)的總和。因此，使用成體干細(xì)胞的再生療法仍然受到可利用的細(xì)胞數(shù)量有限和以下事實(shí)的阻礙，所述事實(shí)即必須獲得治療數(shù)量的體外增殖干擾了其分化和增殖潛能。人充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)因其形成軟骨、骨、脂肪和其他結(jié)締組織的能力而構(gòu)成了基于細(xì)胞的療法在再生患病或受損組織中的令人興奮的前景。將這些成體干細(xì)胞從小體積的骨髓抽吸物中容易地純化并且在它們達(dá)到復(fù)制衰老前在體外擴(kuò)增，以進(jìn)行有限數(shù)量的群體倍增(PD)( 30)?？赡苓@種生長(zhǎng)停滯與端?？s短有關(guān)，因?yàn)槎肆Ｄ┒宿D(zhuǎn)移酶(hTERT)催化亞基的過(guò)量表達(dá)足以將壽命增加至幾百的群體倍增。這些"端粒化"細(xì)胞保持其呈現(xiàn)間充組織表型的能力，由此提供用于hMSC研究的有用工具。然而，它無(wú)法解決在培養(yǎng)中獲得治療數(shù)量的多能干細(xì)胞而不會(huì)嚴(yán)重影響其再生潛能的問(wèn)題。在培養(yǎng)中干細(xì)胞自發(fā)分化是在幼稚干細(xì)胞生態(tài)位中正常發(fā)現(xiàn)的微環(huán)境改變的結(jié)果。如上所述，干細(xì)胞生態(tài)位為與來(lái)自胞外基質(zhì)(ECM)和相鄰細(xì)胞的特異性成分相互作用的信號(hào)與微環(huán)境中的激素狀態(tài)的總和。因此，對(duì)有助于克服先體外后體內(nèi)干細(xì)胞培養(yǎng)物增殖中遇到的問(wèn)題的方法和培養(yǎng)基組合物存在需求。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的在于克服與干細(xì)胞先體外后體內(nèi)培養(yǎng)和增殖相關(guān)的問(wèn)題。本發(fā)明目前發(fā)現(xiàn)通過(guò)向來(lái)自骨髓的人成體充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物中添加糖胺聚糖或蛋白聚糖，可以?xún)?yōu)化這些細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的培養(yǎng)條件。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及增殖干細(xì)胞的方法，包含將糖胺聚糖或蛋白聚糖添加到干細(xì)胞的先體外后體內(nèi)培養(yǎng)物中。在這方面，注意到蛋白聚糖類(lèi)一般代表了一類(lèi)專(zhuān)用的明顯糖基化的糖蛋白。它們由帶有一個(gè)或多個(gè)共價(jià)結(jié)合的糖胺聚糖(GAG)鏈的核心蛋白質(zhì)組成。這些糖胺聚糖鏈為在生理?xiàng)l件下因存在硫酸酯和糖醛酸基團(tuán)而帶負(fù)電荷的長(zhǎng)的線性糖類(lèi)聚合物。蛋白聚糖類(lèi)為動(dòng)物胞外基質(zhì)的主要成分。其中，蛋白聚糖類(lèi)既與其他蛋白聚糖類(lèi)，而且還與纖維基質(zhì)蛋白(諸如膠原蛋白)形成較大的復(fù)合物。它們還參與結(jié)合陽(yáng)離子(諸如鈉、鉀和鈣)和水并且還調(diào)節(jié)分子通過(guò)基質(zhì)的運(yùn)動(dòng)。證據(jù)還表明它們可以影響基質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)和信號(hào)分子的活性和穩(wěn)定性。蛋白聚糖類(lèi)的各個(gè)功能可以歸因于蛋白質(zhì)核心或結(jié)合的GAG鏈已經(jīng)證實(shí)與胞外基質(zhì)的蛋白聚糖類(lèi)結(jié)合的生長(zhǎng)因子體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)人干細(xì)胞的分化和增殖。這些生長(zhǎng)因子通過(guò)與特異性質(zhì)膜受體激酶相互作用(即涉及蛋白聚糖結(jié)合的相互作用)而進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。然而，現(xiàn)存的使用生長(zhǎng)因子，諸如FGF的方法存在缺陷，即在刺激干細(xì)胞增殖的同時(shí)，生長(zhǎng)因子的添加還導(dǎo)致干細(xì)胞多能性的顯著喪失。與此相反并令人意外的是，觀察到按照本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)的增殖增加伴有對(duì)干細(xì)胞多能性的保護(hù)。蛋白聚糖類(lèi)也可以用在本發(fā)明中，但是它們?cè)谀承?shí)施方案中不如相應(yīng)的糖胺聚糖類(lèi)使用便利，這是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)糖鏈更容易操作，即更小和更穩(wěn)定，更可溶，并且較不易于干擾(例如與胞外基質(zhì))相互作用。因此，與蛋白聚糖類(lèi)相比，糖胺聚糖類(lèi)每微克具有增加的生物學(xué)活性。因此，在本發(fā)明的另一方面中，糖胺聚糖或蛋白聚糖優(yōu)選為糖胺聚糖，且更優(yōu)選硫酸乙酰肝素。在這方面，注意到硫酸乙酰肝素蛋白聚糖類(lèi)(HSPG)代表了高度不同的蛋白聚糖類(lèi)亞組，并且由與蛋白質(zhì)骨架共價(jià)結(jié)合的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖側(cè)鏈組成。核心蛋白質(zhì)可以以三種形式存在稱(chēng)作基底膜蛋白聚糖的分泌形式；稱(chēng)作磷脂酰肌醇蛋白聚糖的錨定在質(zhì)膜中的形式；和稱(chēng)作多配體蛋白聚糖的跨膜形式。它們?yōu)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞表面和大部分胞外基質(zhì)中的遍在成分。硫酸乙酰肝素側(cè)鏈由交替排列的通過(guò)(1 — 4)糖苷鍵連接的D-葡糖醛酸或 L-艾杜糖醛酸與D-葡糖胺組成。葡糖胺通常被N-乙?；騈-硫酸化并且糖醛酸和葡糖胺都可以另外被0-硫酸化。用于特定的結(jié)合配偶體的特定HSPG的特異性通過(guò)與葡糖胺和糖醛酸連接的羧基、乙?；土蛩狨セ木唧w模式產(chǎn)生。與肝素相反，硫酸乙酰肝素包含較少的N-和0-硫酸酯基和較多的N-乙酰基。硫酸乙酰肝素側(cè)鏈通過(guò)四糖鍵 (_葡糖醛酸基-β-(1 — 3)-半乳糖基-β-(1 — 3)-半乳糖基-β-(1 — 4)-木糖苷基 (xylosyl) - β -1-0-(絲氨酸))區(qū)與核心蛋白質(zhì)的絲氨酸殘基連接。硫酸乙酰肝素鏈和核心蛋白質(zhì)均可以進(jìn)行一系列最終可能影響其生物活性的修飾。認(rèn)為HS的復(fù)雜性超過(guò)了核酸的復(fù)雜性(Lindahl等，1998，J. Biol. Chem. 273,24979 ； Sugahara 和 Kitagawa，2000，Curr. Opin. Struct. Biol. 10，518)。HS 種類(lèi)的變化形式來(lái)源于糖殘基的非隨機(jī)高度硫酸化序列的合成，這些糖殘基通過(guò)包含N-乙?；咸前返亩穷?lèi)未硫酸化區(qū)分隔開(kāi)。N-乙酰葡糖胺向N-磺基葡糖胺的最初轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了用于其他修飾的中心，所述修飾包括包括葡糖醛酸差向異構(gòu)化成艾杜糖醛酸和葡糖胺或艾杜糖醛酸上0-硫酸化的復(fù)雜模式。此外，在未修飾的低硫酸化的N-乙?；蛄袃?nèi)，己糖醛酸酯 (hexuronate)殘基保持為葡糖醛酸酯，而在高度硫酸化N-硫酸化區(qū)內(nèi)，C_5差向異構(gòu)物艾杜糖醛酸酯占優(yōu)勢(shì)。這就限制了可能在任意指定鏈上潛在的二糖變體的數(shù)量，但沒(méi)有限制每種的多度。大部分修飾出現(xiàn)在N-硫酸化結(jié)構(gòu)域中或直接與其相鄰，使得在成熟鏈中存在通過(guò)低硫酸化結(jié)構(gòu)域分隔開(kāi)的高度硫酸化區(qū)(Brickman等(1998)，J. Biol. Chem. 273(8)， 4350-4359，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。據(jù)推定高度可變的硫酸乙酰肝素鏈在調(diào)節(jié)大量胞外配體的作用中起關(guān)鍵作用，包括通過(guò)自分泌、近分泌和旁分泌反 饋環(huán)的復(fù)雜組合調(diào)節(jié)和將生長(zhǎng)和黏著因子呈遞給細(xì)胞， 從而控制胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和由此的干細(xì)胞分化。例如，盡管大體上描述了硫酸乙酰肝素糖胺聚糖類(lèi)(Alberts 等(1989)Garland Publishing, Inc, New York & London，第 804 和 805 頁(yè))，但是分離自單一來(lái)源的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖種類(lèi)可能在生物活性方面存在差異。正如Brickman等1998，Glycobiology 8，463表明的，獲自神經(jīng)上皮細(xì)胞的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖類(lèi)的兩種單獨(dú)的收集物可以特異性地活化FGF-I或FGF-2，這取決于促細(xì)胞分裂的狀態(tài)。類(lèi)似地，硫酸乙酰肝素(HS)與FGF-I或FGF-2的能力描述在WO 96/23003中。按照該專(zhuān)利申請(qǐng)中，能夠與FGF-I相互作用的相應(yīng)HS可獲自約11到約13天胎齡的鼠細(xì)胞，而能夠與FGF-2相互作用的HS可在約8到約10天胎齡時(shí)獲得。在本發(fā)明的另一方面中，硫酸乙酰肝素優(yōu)選為硫酸乙酰肝素2(HS2)。HS2表示 HSPG的糖鏈，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它對(duì)FGF-2具有親和力。HS2具有約25kDa的分子量且由此推斷每個(gè)二糖中的平均分子量為400Da，由約60個(gè)二糖組成。HS2的二糖組成如Brickman等所述 (文獻(xiàn)同上)，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。在本發(fā)明的另一方面中，干細(xì)胞優(yōu)選為成體干細(xì)胞，其中成體干細(xì)胞可以應(yīng)用于治療用途。在本發(fā)明的另一方面中，成體干細(xì)胞優(yōu)選為充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面中，干細(xì)胞優(yōu)選為人干細(xì)胞，更優(yōu)選為人成體干細(xì)胞，且最優(yōu)選為人成體充質(zhì)干細(xì)胞?，F(xiàn)在參照附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方案。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示不同硫酸乙酰肝素2濃度對(duì)人充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用。將人充質(zhì)干細(xì)胞以3300個(gè)細(xì)胞/cm2在96孔平板(NUNC)上鋪板并且在有不同濃度硫酸乙酰肝素2存在下培養(yǎng)9天。在培養(yǎng)1、3、6和9天后通過(guò)WST-I測(cè)定法(Roche)測(cè)定代謝活性。圖2圖示硫酸乙酰肝素2對(duì)短期培養(yǎng)中的人充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用。將 hMSC (Cambrex)接種在對(duì)照培養(yǎng)基(DMEM，1000mg/l葡萄糖，10 %胎牛血清(Hyclone)，青霉素/鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺)，在包含0. 2% FCS的培養(yǎng)基中血清饑餓48小時(shí)，并且在 (第0天)后的當(dāng)天改變?yōu)閷?duì)照培養(yǎng)基(虛線和空心條)或包含160ng/ml HS2(實(shí)線和灰色條)或肝素(條紋線和黑色條)的培養(yǎng)基。A.硫酸乙酰肝素2增加人充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。使用 ViaCount 軟件并且使用 FLEX 試劑(GUAVA technologies)染色，在 GUAVA PCA-96 流式細(xì)胞儀上按照制造商的說(shuō)明每隔1天測(cè)定一次細(xì)胞數(shù)量。B.硫酸乙酰肝素2增加人充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期數(shù)。將hMSC以5000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板并且在1、2、3、4和7天后分析 DNA含量。使用胰蛋白酶提取出細(xì)胞并且如上所述計(jì)數(shù)，用PBS，ImM EDTA洗滌并且固定在 100%冰冷甲醇中。用PBA洗滌細(xì)胞并且用PI，RnaseA, Triton-X的溶液染色，且用GUAVA PCA-96分析。C.硫酸乙酰肝素減少了進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞的百分比。將hMSC以 3300個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板并且在9天后測(cè)定生存力和程序性細(xì)胞死亡。將細(xì)胞使用膜聯(lián)蛋白試劑盒(GUAVA technologies)染色并且用GUAVA PCA-96流式細(xì)胞儀分析。D.在有或沒(méi)有硫酸乙酰肝素2(HS2)存在下不同F(xiàn)CS濃度對(duì)人充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用。將hMSC以3300 個(gè)細(xì)胞/cm2在96孔平板上鋪板，在包含0、1、2. 5,7. 5或10% FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且在 9天后使用WST-I試劑盒(Roche)測(cè)定培養(yǎng)物中的代謝活性。附圖中的每個(gè)點(diǎn)或條代表各自按照一式三次測(cè)定的至少三份獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。 圖3圖示HS2增加人充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物的壽命并且維持其干細(xì)胞性。將低傳代的 hMSC以5000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板，在(第0天)后的當(dāng)天改變?yōu)閷?duì)照培養(yǎng)基(條紋線和空心條)或包含160ng/ml HS2(實(shí)線和灰色條)或肝素(虛線和黑色條)的培養(yǎng)基中，并且維持在其中。將細(xì)胞培養(yǎng)至分匯合并且在每次傳代時(shí)用胰蛋白酶提取出細(xì)胞，計(jì)數(shù)并且以5000 個(gè)細(xì)胞/cm2重新接種。A.來(lái)自每次傳代的聚積細(xì)胞計(jì)數(shù)。將hMSC以5000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板并且在不含(ctrl)或添加有160ng/ml HS2或肝素的DMEM+10% FCS中培養(yǎng)。在每次傳代時(shí)通過(guò)GUAVA viacount對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(一式三次的兩份樣品)并且以5000個(gè)細(xì)胞/ cm2的密度重新接種。B.將來(lái)自群體倍增25到27的三種培養(yǎng)物的細(xì)胞以30個(gè)細(xì)胞/cm2 的密度接種在24孔平板中并且在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天。將細(xì)胞固定在甲醇中，用姬姆薩染色并且對(duì)具有超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)數(shù)。每個(gè)條代表總集落數(shù)/cm2的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在圖中每個(gè)點(diǎn)或條代表各自按照一式三次測(cè)定的至少三份獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4圖示硫酸乙酰肝素2對(duì)脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的作用。A.將來(lái)自在含有或不含160ng/ml硫酸乙酰肝素2 (HS2)或肝素Ofep)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的hMSC在+4代以 18，000個(gè)細(xì)胞/cm2接種在12孔平板上。將細(xì)胞培養(yǎng)至匯合，改變?yōu)橹拘纬膳囵B(yǎng)基(DMEM 含有10% FCS, 10 μ g/ml胰島素，0. 5mM甲基異丁基黃嘌呤，1 μ M地塞米松)或?qū)φ张囵B(yǎng)基并且培養(yǎng)23天。使用Machery Nagel NucleospiM試劑盒分離并且純化RNA，定量并且將 250 μ 1用于使用superscript的逆轉(zhuǎn)錄。將80ng cDNA用作實(shí)時(shí)PCR的模板，其中PCR使用對(duì)成脂RNA標(biāo)記——脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(ALBP)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α (C/ EBP α)—具有特異性的Taqman引物探針。將相對(duì)表達(dá)水平(REU)校準(zhǔn)成18S的表達(dá)并且乘以106。B.將在含有或不含160ng/ml硫酸乙酰肝素2(HS2)或肝素Ofep)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的hMSC在+4代以3，000個(gè)細(xì)胞/cm2接種在12孔平板中。將細(xì)胞培養(yǎng)至匯合， 改變?yōu)槌晒桥囵B(yǎng)基(IOnM地塞米松，50 μ M磷酸甘油和100 μ ML-抗壞血酸鹽)或?qū)φ张囵B(yǎng)基并且培養(yǎng)27天。使用Machery Nagel NucleospiM試劑盒分離并且純化RNA，定量并且將250 μ 1用于使用superscript的逆轉(zhuǎn)錄。將80ng cDNA用作實(shí)時(shí)PCR的模板，其中PCR 使用對(duì)成骨RNA標(biāo)記——堿性磷酸酶和骨唾液酸蛋白II (BSPII)——具有特異性的Taqman 引物探針。將相對(duì)表達(dá)水平(REU)校準(zhǔn)成18S的表達(dá)并且乘以106。圖5圖示硫酸乙酰肝素2對(duì)人充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)的作用。將hMSC以3300 個(gè)細(xì)胞/cm2在60mm培養(yǎng)皿(NUNC )中鋪板并且在有或沒(méi)有160ng/ml HS2、160ng/ml肝素 (陰性對(duì)照)、10ng/ml FGF-2 (陽(yáng)性對(duì)照)、FGF_2/肝素和FGF-2/HS2組合存在下培養(yǎng)5天， 此后通過(guò)基于抗體染色的流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞表面標(biāo)記Stro-I (A)、⑶49a (B)、⑶71 (C)和 CD146(D)呈陽(yáng)性的細(xì)胞比例。每個(gè)點(diǎn)代表一式三份實(shí)驗(yàn)的平均值和數(shù)據(jù)。圖6圖示硫酸乙酰肝素2和FGF-2對(duì)人充質(zhì)干細(xì)胞的促細(xì)胞分裂作用。將hMSC 以3300個(gè)細(xì)胞/cm2在24孔平板(NUNC)上鋪板并且在有或沒(méi)有160ng/ml硫酸乙酰肝素 2 (HS2)、160ng/ml肝素和lOng/ml FGF-2以及FGF-2與HS2或肝素的組合存在下培養(yǎng)9天。圖7圖示硫酸乙酰肝素2和FGF-2對(duì)人充質(zhì)干細(xì)胞存活的作用。將人充質(zhì)干細(xì)胞以3300個(gè)細(xì)胞/cm2在24孔平板(NUNC)上鋪板并且在有或沒(méi)有160ng/ml硫酸乙酰肝素 2、160ng/ml肝素和lOng/ml FGF-2以及FGF-2與HS2或肝素的組合存在下培養(yǎng)9天。通過(guò)膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞以測(cè)試培養(yǎng)物 中細(xì)胞的生存力和程序性細(xì)胞死亡。圖8圖示硫酸乙酰肝素2對(duì)人充質(zhì)干細(xì)胞多能性的作用。將基因表達(dá)特征用于比較在不同條件下(使用或不使用160ng/ml HS2或肝素)培養(yǎng)的低和高群體倍增(PD)的細(xì)胞。使用奇異值分解(Singular Value Decomposition) (SVD)構(gòu)建特征。對(duì)來(lái)自干細(xì)胞 SuperArrays (使用 GEArray 提取的，SuperArray Bioscience Corp,進(jìn)行 log-轉(zhuǎn)化并且對(duì)交叉-芯片變異(cross-chip variations)修正)的基因表達(dá)測(cè)量值進(jìn)行SVD，從而將數(shù)據(jù)投射到前2個(gè)最大變異的奇異載體上。使用的縮寫(xiě)!fep 肝素，Hsp 硫酸乙酰肝素2 ;Ctrl 對(duì)照；數(shù)字表示PD數(shù)量。定義除非另作陳述，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。盡管與本文所述類(lèi)似或等效的任意方法和物質(zhì)可以用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，仍描述了優(yōu)選的方法和物質(zhì)。就本發(fā)明的目的而言，將下列術(shù)語(yǔ)定義如下。本文所用的表達(dá)方式"增殖(proliferation)“或〃增殖(proliferating)“以其常規(guī)的含義使用并且涉及細(xì)胞或組織擴(kuò)增，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂。本文所用與的干細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"維持"是指保持"干細(xì)胞性"，即所述的干細(xì)胞在培養(yǎng)中的多能性和生存力。所謂"硫酸乙酰肝素"或"HS"意指最初在高爾基體中作為D-葡糖醛酸(GlcA) 和N-乙?；?D-葡糖胺(GlcNAc)的串連重復(fù)組成的多糖類(lèi)合成的鏈。新生多糖類(lèi)隨后可以在一系列步驟中被修飾=GIcNAC的N-脫乙酰化/N-硫酸化；GlcA的C5差向異構(gòu)化成艾杜糖醛酸(IdoA) ；IdoA和GlcA的C2上的0-硫酸化；N-磺基葡糖胺(GlcNS)的C6上的0-硫酸化，以及GlcNS的C3上的臨時(shí)0-硫酸化。HS的N-脫乙酰化/N-硫酸化，2_0_， 6-0-和3-0-硫酸化分別通過(guò)HS N-脫乙酰酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶(HSNDST)，HS 2-0-磺基轉(zhuǎn)移酶(HS2ST)，HS 6-0-磺基轉(zhuǎn)移酶(HS6ST)和HS 3_0_磺基轉(zhuǎn)移酶的特異性作用介導(dǎo)。在每個(gè)修飾步驟時(shí)，只有部分的潛在底物被修飾，產(chǎn)生相當(dāng)多的序列多樣性。這種HS的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得難以測(cè)定其序列和難以理解HS結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。所謂“硫酸乙酰肝素2 〃 或〃 HS2 ‘‘意指 Brickman 等(1998)，J. Biol. Chem. 273(8) ,4350-4359描述的并且能夠與FGF-2相互作用的硫酸乙酰肝素。因此，這種硫酸乙酰肝素2可以獲自如Brickman(文獻(xiàn)同上)所述的10天胎齡時(shí)的鼠細(xì)胞的乙酰肝素蛋白聚糖類(lèi)。用于本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)部分的HS2來(lái)源于胚胎小鼠，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它對(duì)小鼠、人、大鼠、小雞、非洲蟾蜍屬(Xenopus)和果蠅屬(drosophila)細(xì)胞極為有效。與這些結(jié)果符合的，本文關(guān)注任何高等生物(例如昆蟲(chóng)或脊椎動(dòng)物，諸如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行動(dòng)物或魚(yú)類(lèi))中的通用機(jī)理。因此，本發(fā)明包括能夠與FGF-2相互作用并且能夠促進(jìn)或有利于先體外后體內(nèi)干細(xì)胞增殖和/或維持的任意硫酸乙酰肝素2和任意各自的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，包括仍然分離自特定物種的這類(lèi)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和硫酸乙酰肝素2。分離的硫酸乙酰肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的分離及其功能性的測(cè)定屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍并且，例如，可以如 Brickman 等(1998)，J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359 所述進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述本說(shuō)明書(shū)中在先公開(kāi)的文件的清單或?qū)ζ涞挠懻摬槐匾暈槌姓J(rèn)該文件為本領(lǐng)域狀態(tài)的組成部分或一般性的常規(guī)知識(shí)。將所有所列的文件引入本文作為參考將充質(zhì)干細(xì)胞或人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定義為具有生成軟骨、骨、肌肉、腱、韌帶和脂肪能力的多能祖細(xì)胞。這些原始祖細(xì)胞在出生后存在并且表現(xiàn)出干細(xì)胞特征，即低發(fā)生率和廣泛更新的潛能。這些特性與其發(fā)育可塑性的組合在充質(zhì)干細(xì)胞替換受損組織的潛在應(yīng)用中已經(jīng)產(chǎn)生了巨大的意義。實(shí)際上，可以培養(yǎng)充質(zhì)干細(xì)胞以使其數(shù)量擴(kuò)大，然后將其植入受損部位或在植入支架中/植入支架上后產(chǎn)生合適的組織構(gòu)造。因此，就骨與傳導(dǎo)或誘導(dǎo)支架的組合而言，骨骼、肌肉、腱和韌帶修復(fù)的備選手段在于選擇、擴(kuò)大和調(diào)節(jié)合適的祖細(xì)胞，諸如骨祖細(xì)胞，所述的傳導(dǎo)或誘導(dǎo)支架用于與正確選擇的特異性組織生長(zhǎng)因子一起支持和引導(dǎo)再生?？梢允褂眠x擇標(biāo)記(諸如STR0-I，來(lái)自⑶34+級(jí)分)分離并且檢測(cè)人骨髓充質(zhì)干細(xì)胞，從而表明了其對(duì)骨髓再生的潛能。僅在充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)了這些細(xì)胞表面標(biāo)記并且它們?yōu)榧?xì)胞多能性的指征。在干細(xì)胞的先體外后體內(nèi)培養(yǎng)中，由通常在幼稚干細(xì)胞生態(tài)位中發(fā)現(xiàn)的微環(huán)境改變的事實(shí)引起的主要缺點(diǎn)導(dǎo)致干細(xì)胞在培養(yǎng)中自發(fā)分化。干細(xì)胞生態(tài)位的微環(huán)境為來(lái)自與胞外基質(zhì)(ECM)的特異性成分，相鄰細(xì)胞和激素的相互作用的信號(hào)復(fù)雜模式。指示生態(tài)位中指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)的生化信號(hào)由生長(zhǎng)因子及其輔因子組成?，F(xiàn)已證實(shí)某些種類(lèi)的糖胺聚糖類(lèi)(GAG)通過(guò)經(jīng)FGF受體I(FGFRl)的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有促細(xì)胞分裂作用(Nurcombe 等(2000) J. Biol. Chem. 275 (39)，30009-30018)。當(dāng)FGFRl也在人充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)上表達(dá)時(shí)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將糖胺聚糖類(lèi)與生長(zhǎng)因子(FCS的補(bǔ)充形式)一起添加到骨髓衍生的成體人充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物中可以?xún)?yōu)化這些細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的培養(yǎng)條件。為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用如上述所定義的特異性硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(HS)硫酸乙酰肝素2(HS2)。然而，可以從任意合適的來(lái)源，例如，從非鼠(例如僅稱(chēng)作幾個(gè)例示性實(shí)例的人、大鼠、小雞、果蠅屬、非洲蟾蜍屬、斑馬魚(yú)、狗)的前體細(xì)胞中分離用于本發(fā)明的硫酸乙酰肝素2，使用例如，如WO 96/23003或Brickman等(文獻(xiàn)同上)所述的分離方法。本發(fā)明中已經(jīng)證實(shí)將硫酸乙酰肝素2(HS2)添加到充質(zhì)干細(xì)胞中能夠增加人充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)層析和酶促操作步驟從E9-10小鼠胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞培養(yǎng)物收集的培養(yǎng)基中純化HS2 (Nurcombe等(1993) Science 260，103-106，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。為了測(cè)試特異性硫酸乙酰肝素提取物對(duì)成體干細(xì)胞增殖的作用，在有或沒(méi)有不同濃度的硫酸乙酰肝素2存在下的DMEM低葡萄糖+10%胎牛血清(FCS)(維持培養(yǎng)基)中培養(yǎng)人充質(zhì)干細(xì)胞(PoieticsCambrex)。通過(guò)WST-I測(cè)定法(Roche)分析細(xì)胞的代謝活性。結(jié)果證實(shí)在一個(gè)實(shí)施方案中，約160ng/ml的HS2濃度為最能促細(xì)胞分裂的濃度并且更高劑量為抑制性的(圖1)。盡管160ng/ml表現(xiàn)為最佳的HS2濃度，但是HS2在6. 4ng/ml-20 μ g/ ml濃度范圍內(nèi)仍然可以有效地使充質(zhì)干細(xì)胞增殖。在短期培養(yǎng)中，160ng/ml的(最佳)劑量將分匯合的細(xì)胞數(shù)量增加65% (圖2A， 第6天)并且這種增加部分是由于程序性細(xì)胞死亡減少所致(圖2C)，正如通過(guò)流式細(xì)胞測(cè)定法所測(cè)定的。然而，這種增加大部分是由于如圖2B中所示在給定時(shí)間進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量更高所致。
在最佳HS2濃度下，人充質(zhì)干細(xì)胞增殖的增加與在lOng/ml已知的促分裂原FGF-2 存在下觀察到的作用相當(dāng)(圖6)。除其促細(xì)胞分裂特性外，還已知FGF 2可防止程序性細(xì)胞死亡。因?yàn)榱蛩嵋阴８嗡? (HS2)表現(xiàn)出與FGF-2類(lèi)似的特性，所以研究了防止程序性細(xì)胞死亡是否可以促進(jìn)所觀察到的細(xì)胞數(shù)量增加?？梢宰C實(shí)這種增殖的增加與程序性細(xì)胞死亡的降低相關(guān)(圖7)。 還研究了 FCS補(bǔ)充在介導(dǎo)HS2作用中的重要性。正如圖2D中所示，HS2甚至在低至的FCS濃度下具有促細(xì)胞分裂作用。然而，HS2不能在血清饑餓條件中在短時(shí)間期限內(nèi)顯著增加細(xì)胞數(shù)量。在有HS2存在下培養(yǎng)的hMSC增殖的總體增加指示，在給定的時(shí)間內(nèi)，它們進(jìn)行更多的群體倍增(PD)。由于PD在這些細(xì)胞中有限，所以預(yù)計(jì)如果長(zhǎng)期保持在培養(yǎng)物中，那么它們將更早達(dá)到復(fù)制衰老。令人意外地，證實(shí)在與對(duì)照組相似時(shí)間的培養(yǎng)后細(xì)胞增殖減緩， 而在培養(yǎng)45天后產(chǎn)生了多于50%的群體倍增(圖3A)。由于表明了 FGF-2可增加神經(jīng)前體細(xì)胞中端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性(Haik等(2000) Oncogene 19，2957-2966)，所以驗(yàn)證了是否有任何殘留活性存在于hMSC中。然而，根據(jù)上述結(jié)果(Shi等(2002)Nature Biotechnol. 20, 587-591 ;Simonsen 等(2002)Nature Biotechnol. 20，592-596 ;Yudoh 等(2001)J. Bone Miner. Res. 16，1453-1464)，在這些細(xì)胞中未檢測(cè)到端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性，從而表明HS2靶向具有更大倍增潛力的細(xì)胞群，即該群體中的絕大部分幼稚細(xì)胞。異源性hMSC群體中的大部分"干細(xì)胞樣"細(xì)胞的標(biāo)志為其在以低密度接種時(shí)形成集落的能力，由此給我們提供了證實(shí)HS2作用的表型。因此，設(shè)置集落形成測(cè)定并且結(jié)果表明用HS2培養(yǎng)的hMSC能夠形成多于對(duì)照組5倍的集落(圖3B)，并且如果FCS濃度降低， 則差異更大。骨發(fā)生和脂肪形成由一定范圍的乙酰肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(如FGF中的成員)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族誘導(dǎo)和控制。分化測(cè)定(圖4)證實(shí)單獨(dú)增加hMSC或在有骨誘導(dǎo)性培養(yǎng)基(IOnM地塞米松，50 μ M磷酸甘油和100 μ ML-抗壞血酸鹽)或脂肪形成培養(yǎng)基(含有 10% FCSaOyg/ml胰島素，0. 5mM甲基異丁基黃嘌呤，1 μ M地塞米松的DMEM)存在下添加 HS2不會(huì)對(duì)人充質(zhì)干細(xì)胞分化產(chǎn)生顯著影響，從而證實(shí)盡管HS2增加hMSC增殖并且可保護(hù)其"干細(xì)胞性"，但是其分化能力未受損。使用干細(xì)胞表面標(biāo)記，特別是STR0-1獲得的結(jié)果(圖5)表明HS2通過(guò)增加大部分未分化細(xì)胞的增殖來(lái)幫助維持"干細(xì)胞樣"表型。圖5證明在有HS2存在下培養(yǎng)的人充質(zhì)干細(xì)胞增殖，同時(shí)維持了其多能性，而那些與FGF-2 —起培養(yǎng)的人充質(zhì)干細(xì)胞能夠增殖，但這些細(xì)胞失去了其某些多能性。充質(zhì)干細(xì)胞多能性的維持由高水平的STR0-1表達(dá)表示，而干細(xì)胞增強(qiáng)的增殖由更高水平的CD71表達(dá)所暗示，所述CD71為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并且對(duì)增殖是重要的。同時(shí)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加，表示為細(xì)胞粘附分子⑶49a和⑶146表達(dá)水平降低。從這些結(jié)果中看出，HS2介導(dǎo)的增殖機(jī)制可以包括FGF-非依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)途徑。由于不存在用于評(píng)價(jià)充質(zhì)干細(xì)胞在與其分化潛能之外的干細(xì)胞性的特異性試驗(yàn)， 所以將基因表達(dá)特征用來(lái)比較在不同條件下培養(yǎng)的低和高PD細(xì)胞。使用上述證實(shí)為有效工具的奇異值分解(SVD)構(gòu)建特征，所述工具可以在基于基因分布的腫瘤亞型之間進(jìn)行區(qū)分。正如圖8中所示，在有HS2(Hsp6和Hsp8)存在下培養(yǎng)的高PD hMSC與對(duì)照組的低 PD(Ctrl4*Ctrll6)強(qiáng)烈群集。然而，用HS2 (Hsp4)處理的最低PD hMSC獨(dú)立存在，我們由此可以推斷對(duì)照組的早期世代(同時(shí)由Cambrex處理)將與其群集。這些結(jié)果符合在群體倍增中HS2保護(hù)hMSC的〃干細(xì)胞性〃這一推定。就用肝素0fep4，!fep6，!fep8)處理的細(xì)胞而言，它們不會(huì)與任何其他類(lèi)群集，從而表明這種處理明顯改變了其干細(xì)胞性并且這一結(jié)果應(yīng)在分化測(cè)定中得以反映。 在本發(fā)明中，已經(jīng)首次證實(shí)，硫酸乙酰肝素2的存在將使hMSC的增殖比對(duì)照組培養(yǎng)物增加幾個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)還增加了總壽命。增殖的這種增加與干細(xì)胞的相對(duì)缺失無(wú)關(guān)，正如通過(guò)集落形成單位、干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)和多能性測(cè)定所測(cè)量的。因此，可以證實(shí)硫酸乙酰肝素2為用于先體外后體內(nèi)干細(xì)胞增殖、“干細(xì)胞性”的維持和特異性細(xì)胞分化的有價(jià)值的工具且由此有助于開(kāi)啟干細(xì)胞在療法和組織修復(fù)中的潛在應(yīng)用。因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子參與人干細(xì)胞在體外和體內(nèi)的分化和增殖，所以特異性糖胺聚糖類(lèi)在控制干細(xì)胞增殖和命運(yùn)中的應(yīng)用可以為醫(yī)學(xué)應(yīng)用(諸如未來(lái)基于細(xì)胞的療法)提供有用和可靠的方法。本文例示描述的本發(fā)明可以在沒(méi)有本文所未具體公開(kāi)的任何成分或多種成分、限制或多種限制的情況下實(shí)施。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”、“含有"等應(yīng)當(dāng)寬泛解讀并且沒(méi)有限制。另外，本文使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)方式作為描述性術(shù)語(yǔ)使用并且對(duì)此沒(méi)有限制， 并且在這類(lèi)術(shù)語(yǔ)和表達(dá)方式的使用中不意圖排除所示和所述特征的任何等同特征或其部分，而且認(rèn)為各種變型能夠?qū)儆谡?qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。因此，應(yīng)理解盡管已經(jīng)通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案具體公開(kāi)了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取本文公開(kāi)的本發(fā)明的變型和變化形式，并且認(rèn)為這類(lèi)變型和變化形式均屬于本發(fā)明的范圍。在本文中已經(jīng)廣泛并簡(jiǎn)要地描述了本發(fā)明。屬于上位概念的公開(kāi)范圍的較窄的下位概念和亞上位概念的分組也各自構(gòu)成本發(fā)明的組成部分。其他實(shí)施方案屬于下列權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.與硫酸乙酰肝素2(HS2)接觸的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物，其中所述干細(xì)胞是成體干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物，其中所述干細(xì)胞是人干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物，其中所述干細(xì)胞是充質(zhì)干細(xì)胞。
5.從含有硫酸乙酰肝素2(HS2)的多能干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物獲得的多能干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的從含有HS2的多能干細(xì)胞體外培養(yǎng)物獲得的多能干細(xì)胞，用于30 次的群體倍增或更多次的群體倍增。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的多能干細(xì)胞，其中所述的干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，人干細(xì)胞或者充質(zhì)干細(xì)胞。
8.治療量的根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的干細(xì)胞，其獲得自含有HS2的多能干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物，并用于治療。
9.干細(xì)胞在制備用于治療疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述干細(xì)胞獲得自含有硫酸乙酰肝素2(HS2)的多能干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物。
10.硫酸乙酰肝素2(HS2)在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的HS2的應(yīng)用，其用于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的HS2的應(yīng)用，其用于促進(jìn)干細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的HS2的應(yīng)用，其用于在體外維持干細(xì)胞的多能性或者用于在體外促進(jìn)干細(xì)胞的增殖。
14.體外培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，該方法包括培養(yǎng)與硫酸乙酰肝素2(HS2)接觸的干細(xì)胞。
15.預(yù)防或者降低在體外培養(yǎng)物中干細(xì)胞增殖期間多能干細(xì)胞丟失多能狀態(tài)的體外方法，該方法包括培養(yǎng)與硫酸乙酰肝素2 (HS2)接觸的干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及增殖干細(xì)胞的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及糖胺聚糖類(lèi)或蛋白聚糖類(lèi)在先體外后體內(nèi)培養(yǎng)中促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)保護(hù)其多能性中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K35/12GK102220280SQ20111011205
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2006年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月11日
發(fā)明者S·科爾, V·努科比 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局