專利名稱：肝祖細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝祖細(xì)胞的技術(shù)，尤指一種肝祖細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢性肝病是一種世界性的嚴(yán)重健康問題。B型肝炎、C型肝炎、酒精及某些化學(xué)藥物能夠?qū)е赂闻K纖維化及肝硬化，并最終導(dǎo)致肝衰竭，目前肝臟移植仍然是肝衰竭患者的惟一選擇，然而肝臟移植常受阻于缺乏捐贈(zèng)者，同時(shí)，肝臟移植并不適合某些疾病，例如某些感染及某些類型的癌癥，所以需要一些替代性的方法來(lái)治療肝病及其相關(guān)的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于一個(gè)意料之外的發(fā)現(xiàn)，即多功能肝祖細(xì)胞能夠用以治療肝病及其相關(guān)問題。本發(fā)明包含一種取得肝祖細(xì)胞的方法。其方法包括取得培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞， 將此多功能動(dòng)物細(xì)胞與肝臟組織在培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間，并收集此共培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞及其后代以取得肝祖細(xì)胞。其中，此多功能動(dòng)物細(xì)胞對(duì)由⑶29、⑶44、⑶49b、⑶49d、 ⑶73、⑶90、⑶105、⑶13和HLA-DR所組成的群組中的一種或多種標(biāo)記呈陽(yáng)性反應(yīng)，并對(duì)由 ⑶14、⑶34和⑶45所組成的群組中的一種或多種標(biāo)記呈陰性反應(yīng)。此多功能動(dòng)物細(xì)胞可以是取自第一種實(shí)驗(yàn)對(duì)象的臍帶的華頓氏膠(Wharton’ s jelly)，此第一種實(shí)驗(yàn)對(duì)象可以是人類或是一種非人類的哺乳類動(dòng)物，比如貓、狗、豬或馬等，此共培養(yǎng)的肝臟組織可以是一種受損傷的肝臟組織，此受損傷的肝臟組織是取自第二種實(shí)驗(yàn)對(duì)象，第二種實(shí)驗(yàn)對(duì)象可以是一種人類或非人類的哺乳類動(dòng)物，將取自第二種實(shí)驗(yàn)對(duì)象的肝臟組織置于一種具有肝毒性的反應(yīng)物中，造成此肝臟組織的損傷，第一種實(shí)驗(yàn)對(duì)象及第二種實(shí)驗(yàn)對(duì)象可以是相同或不同的動(dòng)物，具肝臟毒性的反應(yīng)物可以是一種機(jī)械的外力或一種生理的事件，比如局部缺血、發(fā)炎反應(yīng)或是一種化學(xué)藥劑，比如硫乙酰胺、四氯甲烷或是酒精，肝臟組織亦可以取自暴露于肝毒性因素的活體組織切片，肝祖細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種選自CK18、白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶(ΤΟ)、α-胎兒蛋白(AFP)、CYP7A1、 nan0g、0ct4、ckit、肝臟生長(zhǎng)因子(HGF)和金屬蛋白酶(MMP)群組中的基因表達(dá)，在一實(shí)施例中，多功能動(dòng)物細(xì)胞對(duì)肝臟生長(zhǎng)因子或金屬蛋白酶呈陽(yáng)性反應(yīng)。本發(fā)明的另一目的在于制備肝祖細(xì)胞，制備的方法如上所述。本發(fā)明的另一目的包含制備被培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞及肝臟細(xì)胞的組合物，該多功能動(dòng)物細(xì)胞是對(duì)選自由 CD29、CD44、CD49b、CD49b、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 的群組中的一種或多種標(biāo)記呈陽(yáng)性反應(yīng)，并對(duì)選自由⑶14、⑶34和⑶45群組中的一種或多種標(biāo)記呈陰性反應(yīng)，肝臟組織可以是在體外培養(yǎng)的組織，在一實(shí)施例中肝臟組織是一種受肝毒性試劑損傷的肝臟組織，在一實(shí)施例中，多功能動(dòng)物細(xì)胞是取自于第一種實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比如人類臍帶的華頓氏膠。本發(fā)明包含一種治療肝臟疾病，例如纖維化或肝硬化的方法，此治療方法包含鑒定出具有肝臟疾病或有肝臟疾病風(fēng)險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并對(duì)此實(shí)驗(yàn)對(duì)象使用第一制備物或第二制備物，該第一制備物含有上述的被培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞，該第二制備物含有上述的肝祖細(xì)胞，該多功能動(dòng)物細(xì)胞或該肝祖細(xì)胞能夠分化成表達(dá)白蛋白的細(xì)胞，肝祖細(xì)胞的制備方法如上所述。本發(fā)明并包含一種提高在實(shí)驗(yàn)對(duì)象肝臟中白蛋白、金屬蛋白酶或肝臟生長(zhǎng)因子濃度的方法，本方法包含在實(shí)驗(yàn)對(duì)象中使用有效劑量的(一)第一制備物或(二)第二制備物，該第一制備物含有上述被培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞，該第二制備物含有上述的肝祖細(xì)胞， 肝祖細(xì)胞的制備方法已如上述。在本發(fā)明中，肝祖細(xì)胞具有下列第一特征及第二特征，第一特征是能夠表達(dá)一種或多種肝臟特異性(專一性)的基因，該基因由CK18、白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶、α-胎兒蛋白和CYP7A1所組成，第二種特征是具有發(fā)展成為干細(xì)胞的潛力，相較于取自于臍帶的華頓氏膠的多功能動(dòng)物細(xì)胞以及華頓氏膠干細(xì)胞，肝祖細(xì)胞具有較低的nanog、oct4、和 ckit的干細(xì)胞基因表達(dá)量。以下，本發(fā)明的實(shí)施例將結(jié)合附圖詳細(xì)描述，從本發(fā)明的描述、附圖及權(quán)利要求書，本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特征及優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。


圖 1-1 至圖 1-13 是針對(duì) CD13 (IA)、CD14(1B)、CD29(1C)、CD 34 (ID)、CD44(1E)、 CD45(1F)、CD49b(lG)、CD49d(lH)、CD73(1I)、CD90(1J)、CD105(1K)、HLA-DR(IL)禾口 IgGh-FITC (1M，作為陽(yáng)性對(duì)照)以抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果；圖1-14是華頓氏膠干細(xì)胞的代表性形態(tài)照片，左為低密度培養(yǎng)，右為高密度培養(yǎng)，比例線(Bar) = 500 μ m。圖2-1及圖2-2分別為照片顯示以RT-PCR及凝膠電泳測(cè)量肝臟特異性(特異性) 基因表達(dá)(圖2-1)及表格顯示半定量RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果(圖2- ，其以肝臟特異性基因表達(dá)作為華頓氏膠干細(xì)胞在與硫乙酰胺損傷的肝臟組織共同培養(yǎng)0、2、4天后的肝細(xì)胞分化程度的測(cè)量尺度。圖3-1至圖3-4為以蘇木色素及曙紅染料染色的肝臟切片的照片；圖3-1是正常老鼠肝臟切片；圖3-2是纖維化肝臟切片取自于注射硫乙酰胺200mg/kg的老鼠，每3天注射一次，共60天；圖3-3是華頓氏膠干細(xì)胞群組肝臟切片，在華頓氏膠干細(xì)胞移殖后21天取得；圖3-3是偽治療群組肝臟切片，在注射食鹽水后21天取得；比例線(Bar)= 50 μ m0圖4-1至圖4-8為以麻省三色(Masson，s trichrome)染色的肝臟切片的照片；圖4-1是正常老鼠肝臟切片；圖4-2是肝臟纖維化老鼠肝臟切片；圖4-3是華頓氏膠干細(xì)胞群組肝臟切片，在華頓氏膠干細(xì)胞移殖后7天取得；圖4-4是偽治療群組肝臟切片，在7天后取得；圖4-5是華頓氏膠干細(xì)胞群組肝臟切片，在華頓氏膠干細(xì)胞移殖后7天取得；
圖4-6是偽治療群組肝臟切片，在14天后取得；圖4-7是華頓氏膠干細(xì)胞群組肝臟切片，在華頓氏膠干細(xì)胞移殖后21天取得；圖4-8是偽治療群組肝臟切片，在21天后取得；比例線(Bar) = 200 μ m。圖5-1至圖5-4為以免疫染色法染色的肝臟切片的照片；圖5-1及圖5_2是華頓氏膠干細(xì)胞群組肝臟切片；圖5-1及圖5-2是偽治療群組肝臟切片；均在21天后取得；比例線(Bar)= 50 μ m(圖 5-1 禾口圖 5-3)，比例線(Bar) = 20 μ m(圖 5-2 和圖 5-4)。 圖6-1至圖6-4為以免疫染色法針對(duì)人類金屬蛋白酶及人類線粒體染色在移殖21 天后取得的華頓氏膠干細(xì)胞群組及偽治療群組的肝臟切片的照片；圖6-1免疫染色法針對(duì)金屬蛋白酶染色的華頓氏膠干細(xì)胞群組老鼠肝臟切片；圖6-2免疫染色法針對(duì)金屬蛋白酶染色的偽治療群組老鼠肝臟切片；圖6-3免疫染色法針對(duì)人類線粒體染色的華頓氏膠干細(xì)胞群組老鼠肝臟切片；圖6-4免疫染色法針對(duì)人類線粒體染色的偽治療群組老鼠肝臟切片；黑箭號(hào)及白箭號(hào)為金屬蛋白酶及人類線粒體陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，箭頭為金屬蛋白酶陽(yáng)性反應(yīng)的膽管細(xì)胞； 比例線(Bar) = 10 μ m。圖7-1及圖7-2為以免疫染色法針對(duì)HGF染色在移殖21天后取得的華頓氏膠干細(xì)胞群組(圖7-1)及偽治療群組(圖7-2)的肝臟切片的照片；比例線(Bar) = 20 μ m。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是關(guān)于多功能細(xì)胞及使用多功能細(xì)胞以治療肝臟疾病的方法。由于具有修復(fù)的特質(zhì)及分化的潛能，干細(xì)胞被用來(lái)治療肝臟疾病已見諸于醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)之中，然而由于倫理面與邏輯面的考慮，阻礙了胚胎干細(xì)胞的使用，自骨髓及臍帶取得的干細(xì)胞具有成為各種細(xì)胞及肝祖細(xì)胞的潛能，同時(shí)，活體研究亦證實(shí)移植的干細(xì)胞能分化成肝祖細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶和細(xì)胞角質(zhì)蛋白18(CK18)特定的標(biāo)記， 而研究亦證實(shí)移植的老鼠干細(xì)胞能夠使動(dòng)物加速肝臟受到損傷后的復(fù)原。本發(fā)明使用華頓氏膠干細(xì)胞(Wharton's jelly stem cells)取得肝祖細(xì)胞，并用肝祖細(xì)胞治療肝臟疾病。胚胎干細(xì)胞或華頓氏膠干細(xì)胞s具有發(fā)展成各種細(xì)胞的潛能，包括肝祖細(xì)胞，因此它們能夠使用于再生肝細(xì)胞以治療肝臟疾病，如下面例子所顯示，華頓氏膠干細(xì)胞能夠用一般的技術(shù)手段在試管內(nèi)隔離、維持及發(fā)展，將華頓氏膠干細(xì)胞s植入老鼠之后并沒有發(fā)現(xiàn)有絲分裂活化細(xì)胞、畸胎瘤、惡性增生的發(fā)生，因此這些細(xì)胞可以植入體內(nèi)治療肝臟疾病而沒有上述的顧慮，由于這些優(yōu)點(diǎn)，華頓氏膠干細(xì)胞代表另一種取得多功能細(xì)胞的方法，在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，本發(fā)明使用華頓氏膠干細(xì)胞。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，本發(fā)明使用人類的華頓氏膠干細(xì)胞。華頓氏膠是一種取自于臍帶的凝膠狀結(jié)締組織，華頓氏膠是由肌纖維母細(xì)胞狀的基質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)纖維及蛋白多醣(Kobayashi et al.，1998，Early Hum Dev 51,223-33)所組成，華頓氏膠干細(xì)胞容易在體外被隔離(提取)及培養(yǎng)，華頓氏膠干細(xì)胞具有發(fā)展的潛能，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下，能夠分化成類神經(jīng)元細(xì)胞、類軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心臟細(xì)胞或是骨細(xì)胞。取自于豬臍帶的華頓氏膠的細(xì)胞，能夠培養(yǎng)至一百倍的數(shù)量，而仍然能夠旺盛活潑的成長(zhǎng)(Weiss, et al. 2003, Exp Neurol 182，288-99)，免疫組織化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)取自于華頓氏膠的細(xì)胞具有基質(zhì)細(xì)胞的特質(zhì)，并且表現(xiàn)出對(duì)各種細(xì)胞之下及細(xì)胞間基質(zhì)蛋白的不同的分布形態(tài)(Nanaev et al. 1997，Placenta 18,53-64) 下列實(shí)施例1所描述的方法可用于制備華頓氏膠干細(xì)胞(Wharton's jelly Stem Cells)，為了確認(rèn)所制備的細(xì)胞的確是華頓氏膠干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析或標(biāo)準(zhǔn)的免疫化學(xué)分析用于檢查培養(yǎng)至第四代至第八代的如前所述的細(xì)胞，上面所描述的抗體或描述于圖 1-1至1-14的抗體可用來(lái)檢查抗原，這些抗體可以跟適當(dāng)?shù)臉?biāo)記結(jié)合，比如熒光異硫氰酸鹽(FITC)、藻紅素(PE)或量子點(diǎn)。使用流式細(xì)胞儀，將對(duì)⑶14、⑶34和⑶45呈陰性并且對(duì) CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 呈陽(yáng)性的華頓氏膠干細(xì)胞加以濃縮及純化。這些被濃縮的華頓氏干細(xì)胞可以用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來(lái)檢驗(yàn)其分化潛力。第五代至第十代的細(xì)胞可以被用來(lái)誘發(fā)生成肝祖細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞是本領(lǐng)域常用的技術(shù)。下面實(shí)施例所描述的方法可以用來(lái)培養(yǎng)華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞，以取得肝祖細(xì)胞，在另一實(shí)施例中，為確認(rèn)華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞分化成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的潛力，華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞被培養(yǎng)之后再轉(zhuǎn)移至骨質(zhì)培養(yǎng)液或脂肪質(zhì)培養(yǎng)液，并培養(yǎng)一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，例如三周。 分化成骨質(zhì)細(xì)胞的潛力，可用鈣質(zhì)累積的程度來(lái)加以檢測(cè)，鈣質(zhì)累積的程度可用von Kossa 染色法以進(jìn)行目視觀察。為檢測(cè)分化成脂肪細(xì)胞的潛力，細(xì)胞內(nèi)的脂肪微?？捎肙il Red 0加以染色，并且在顯微鏡之下觀察。華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在神經(jīng)培養(yǎng)液一段適當(dāng)時(shí)間， 例如七天，進(jìn)行血清消耗處理及β-巰基乙醇培養(yǎng)，在分化后，華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)折射細(xì)胞體(refractile cell body)形態(tài)，具有延伸的軸凸?fàn)顦?gòu)造并組成網(wǎng)絡(luò)。族系特異性 (特異性)標(biāo)記的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可以進(jìn)一步用來(lái)確認(rèn)神經(jīng)的分化潛力。這些標(biāo)記包括 III β-微管蛋白(tubulin) (Tuj-I)、神經(jīng)中間絲蛋白(neurofilament)和GFAP神經(jīng)元特異性標(biāo)記。上述的華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞或肝祖細(xì)胞可以在非分化性的培養(yǎng)液中培養(yǎng)很多倍，而不產(chǎn)生自發(fā)的分化、老化、形態(tài)的改變、繁殖力的增加或分化成肝細(xì)胞的能力上的改變。如下面內(nèi)容所述，這些被確認(rèn)后的華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞或肝祖細(xì)胞可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法加以儲(chǔ)存或使用于需要的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本發(fā)明可以使用各種可以分化成肝祖細(xì)胞的多功能干細(xì)胞或多功能干細(xì)胞實(shí)施，換言之，除了華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞之外，本發(fā)明的干細(xì)胞或前驅(qū)細(xì)胞可以來(lái)自于各種來(lái)源，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，干細(xì)胞或前驅(qū)細(xì)胞是取自于以下群組，該群組包含造血細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、G-CSF活動(dòng)外圍血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、胰臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、寡樹突細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞，本發(fā)明自各種來(lái)源取出干細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，通常是選擇能夠表達(dá)一種或多種肝細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞，例如CD34、CD133等，或取自于缺乏某些已分化細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞，干細(xì)胞的篩選通常是用FACS或免疫磁性分離法，但是也可以使用核酸法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法，胚胎干細(xì)胞取得的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)(Smith，Annu Rev Cell Dev Biol (2001) 17 435)，成人干細(xì)胞，亦即取自于成人組織的干細(xì)胞亦是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)， 分離及濃縮成人干細(xì)胞的方法已見諸于文獻(xiàn)中(Miraglia et al. (1997)Blood 90:5013， Uchida et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :14720, Simmons, P. J. et al. (1991)Blood 78:55，Prockop Cytotherapy(2001)3 393, ；Bohmer Fetal Diagn Ther (2002) 17 83 ；and Rowley et al. BoneMarrow Transplant (1998)21 1253), Stem Cell Biology Daniel R. Marshak(Editor)Richard L. Gardner(Editor),Publisher :Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)and Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Anthony D.Ho (Editor)Richard Champlin(Editor), Publisher :Marcel Dekker(2000))。“干細(xì)胞”是指能夠分化成各種細(xì)胞的細(xì)胞，干細(xì)胞可以是全功能干細(xì)胞或多功能干細(xì)胞，全功能干細(xì)胞可以分化成任何一種細(xì)胞，全功能干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞或非胚胎干細(xì)胞，多功能干細(xì)胞通常可以分化成好幾種不同的細(xì)胞，單功能干細(xì)胞只可以產(chǎn)生一種細(xì)胞的形式，但是單功能干細(xì)胞不同于非干細(xì)胞是因?yàn)槠渚哂凶晕腋滦迯?fù)的功能，干細(xì)胞可以取自于各種組織及器官，這些組織及器官包括但不限于血液、神經(jīng)、肌肉、皮膚、腸道、乳頭、腎臟、肝臟、胰臟與胸腺等，在本發(fā)明中，這些干細(xì)胞是可以是取自于成人或新生兒的組織或器官在本發(fā)明中，這些細(xì)胞通常是指有相當(dāng)純度的細(xì)胞，在此，相當(dāng)?shù)募兌仁侵高@些細(xì)胞占有一個(gè)相當(dāng)?shù)谋壤?，或大部分的比例，例如超過(guò)20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80^^90%或95，一般來(lái)說(shuō)一個(gè)有相當(dāng)純度的細(xì)胞占有70%，通常是80%，有的時(shí)候是至少 90%，換言之，一種或多種組成的細(xì)胞族群都可以在本發(fā)明中使用?！霸鲋场奔啊皵U(kuò)展”在本發(fā)明中被交互使用，并且同樣是指相同形態(tài)的細(xì)胞經(jīng)由細(xì)胞分裂而增加數(shù)目，在此分化是指一個(gè)發(fā)展的過(guò)程，通過(guò)此過(guò)程細(xì)胞特化成具有一種特定功能的細(xì)胞，例如細(xì)胞取得一種或多種形態(tài)上的特征或是具有不同于最初細(xì)胞的功能，此名詞“分化”包含譜系提交及最終的分化過(guò)程，分化過(guò)程可以用檢測(cè)譜系標(biāo)記是否存在而加以檢測(cè)，分化過(guò)程可以用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如免疫組織化學(xué)法，來(lái)檢測(cè)譜系標(biāo)記是否存在以評(píng)估分化的程度，衍生自前驅(qū)細(xì)胞的后代細(xì)胞可以是，但未必是屬于干細(xì)胞來(lái)源組織的同一胚層或同一組織，例如神經(jīng)前驅(qū)細(xì)胞及肌肉前驅(qū)細(xì)胞可以分化成造血細(xì)胞家族。在本發(fā)明中，“譜系提交”及“特化”可以被交互使用，是指干細(xì)胞進(jìn)行的過(guò)程，在此過(guò)程中，干細(xì)胞產(chǎn)生一種前驅(qū)細(xì)胞，用以形成一種特定范圍的已分化細(xì)胞形態(tài)，被譜系提交或指定的前驅(qū)細(xì)胞通常具有自我修復(fù)及細(xì)胞分裂的功能，在此，“最終分化”是指一種最后分化的過(guò)程， 在此過(guò)程中，細(xì)胞變成一個(gè)成熟完全分化的細(xì)胞，例如造血前驅(qū)細(xì)胞及肌肉前驅(qū)細(xì)胞可以分化成神經(jīng)或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞譜系，然后，其最終的分化過(guò)程導(dǎo)致形成成熟的神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，通常最終分化過(guò)程伴隨著自細(xì)胞分裂周期的退出及細(xì)胞增殖的停止，在此， “前驅(qū)細(xì)胞”是指被指定或提交于一特定細(xì)胞譜系的細(xì)胞，這些細(xì)胞最終會(huì)經(jīng)由一系列的細(xì)胞分裂而生成此譜系細(xì)胞。本發(fā)明并提供數(shù)種藥物組合物(藥物組成)，該藥物組合物包含上述細(xì)胞、活性成分或化合物，該藥物組合物的制備是經(jīng)由混合治療上有效劑量的細(xì)胞、活性成分、化合物以及藥物學(xué)上可接受的載體，且該藥物成分可以選擇性的加入其它的活性物質(zhì)，此載體具有不同的形式，其形式依使用的途徑來(lái)確定。上述的藥物組合物可以使用習(xí)知的藥物賦形劑及藥物制備方法，該藥物賦形劑可以與各種藥劑、溶劑、造粒劑、濕潤(rùn)劑及連結(jié)劑(粘結(jié)劑)混合。在此所指的“有效劑量” 或“治療上的有效量”，是指可以造成一特定病癥的癥狀或參數(shù)有可測(cè)量的改善的藥劑量， 上述細(xì)胞的治療有效量，是可用本領(lǐng)域中習(xí)知的方法來(lái)確定，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用以經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)的方法來(lái)確定治療一種疾病的有效量。使用于患者的精確藥劑量，應(yīng)當(dāng)視疾病嚴(yán)重的程度及其患者的身體狀況來(lái)確定，一個(gè)可以造成癥狀或參數(shù)可測(cè)量的改變的量，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定或由病人向醫(yī)生的報(bào)告而確定，在此應(yīng)當(dāng)了解的是，任何臨床上或統(tǒng)計(jì)學(xué)上的有意義的改變或改善均屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，所謂臨床上有意義的改變或改善，是指病人或醫(yī)生可以察覺到的改變或改善。此詞組“藥物學(xué)上可接受的”是指，它的分子本身及它的成分是生理學(xué)上可以忍受而且不會(huì)對(duì)病人產(chǎn)生不想要的反應(yīng)，更為理想的是，“藥物學(xué)上可接受”是指中央或地方政府的藥物管理當(dāng)局所批準(zhǔn)，或在美國(guó)藥典或其它公認(rèn)的藥典被認(rèn)為是可以使用于哺乳類， 尤其是人類的藥物，藥物學(xué)上可接受的鹽類、酯類、胺類及前驅(qū)(前體)藥物，是指這些有良好醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)并且與病人的組織接觸史，不會(huì)造成毒性發(fā)炎或過(guò)敏反應(yīng)的鹽類、酯類、胺基化合物及前驅(qū)藥物，這些鹽類、酯類、胺基及前驅(qū)藥物等等，并須符合一個(gè)合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比例，并對(duì)使用的目的有效。上面所述使用于藥物組合物的載體，是指一種稀釋劑、賦形劑或載體，這些藥物載體可以是無(wú)菌的液體，如水或油。水或水溶液、食鹽溶液、葡萄糖水溶液及甘油溶液是較理想的載體，尤其是對(duì)注射用的溶液而言，適合使用的藥物載體記載于下述文獻(xiàn) (“Remington' s Pharmaceutical Sciences^by Ε.W. Martin,18th Edition)。上述的細(xì)胞可通過(guò)注射或注入的方式施加于患者，例如靜脈注射、腦脊椎膜注射、肌肉注射、管腔注入、氣管注入、腹膜注入或皮下注射，口服或貼皮吸收，或其它本領(lǐng)域中所習(xí)用的方式，藥物的施用可以是兩周一次、一周一次或更高的頻率使用，但是在疾病的穩(wěn)定期通常使用的頻率會(huì)減少。異體移植細(xì)胞與自體移植細(xì)胞都可以被使用。在前一種情形，應(yīng)該要進(jìn)行人類白血球抗原配對(duì)(HLA-matching)，以避免或減低被移植者的反應(yīng)，在后面的一種情形中，自體細(xì)胞被濃縮和純化并且儲(chǔ)存以待后續(xù)使用，這些細(xì)胞可以在體外以被移植者的T細(xì)胞共培養(yǎng)然后再被導(dǎo)入被移植者的體內(nèi)，這樣做可以讓被移植者的身體認(rèn)為這些細(xì)胞是他自己的，而進(jìn)而降低T細(xì)胞的反應(yīng)。藥物使用的劑量及使用的頻率將視臨床征兆而定，例如病人在緩解期或急性期， 在緩解期中，至少一種急性期的臨床征兆將會(huì)消失或減少，并且藥物的劑量與使用的頻率也將視這種用藥物或用藥物來(lái)治療的疾病的病人征兆及臨床或非臨床的征候是否有減少， 藥物劑量及使用的頻率也將視病人或是被治療的哺乳類實(shí)驗(yàn)對(duì)象的年紀(jì)、性別、健康狀況而定，并且也參考藥物的作用及副作用以及醫(yī)生的判斷，在所有上述的方法中，細(xì)胞可以每次以一萬(wàn)到十萬(wàn)個(gè)數(shù)量使用于試驗(yàn)對(duì)象。本發(fā)明并包含一種治療肝臟疾病或緩解肝臟疾病癥狀的方法，此方法包含診斷 “需要”治療的試驗(yàn)對(duì)象，以及使用或移植上述的細(xì)胞，需要診斷的對(duì)象例如患有肝臟疾病或具有肝臟疾病風(fēng)險(xiǎn)。施用或移植可通過(guò)直接注入目標(biāo)器官、注入血液或注入腹膜內(nèi)的方式施行，適當(dāng)?shù)氖┯没蛞浦驳姆椒▽⒂梢韵碌姆绞酱_定，例如監(jiān)測(cè)被植入的細(xì)胞到目標(biāo)器官的遷移路徑，所想要的器官特異性基因或標(biāo)記的表達(dá)，以及試驗(yàn)對(duì)象的器官的功能，例如白蛋白或肝臟生長(zhǎng)因子。在此，應(yīng)當(dāng)被認(rèn)知的是在活體外被培養(yǎng)的干細(xì)胞或前驅(qū)細(xì)胞被植入肝臟，以提供細(xì)胞一個(gè)有利生長(zhǎng)的環(huán)境，然后分化成能夠表現(xiàn)出對(duì)肝臟細(xì)胞特異性的特征，然后這些
9分化完成的細(xì)胞可以再被移出、分離、再度的植入肝臟的其它部分或其它的試驗(yàn)對(duì)象。這些試驗(yàn)對(duì)象可以是人類或是非人類的哺乳類動(dòng)物，諸如貓、狗、豬、馬，肝臟疾病包括肝硬化及肝纖維化，在第21段中提及的“需要”是指試驗(yàn)對(duì)象處于一種狀態(tài)，這種狀態(tài)為肝功能需要被加強(qiáng)，此狀態(tài)包括但不限于這些施用對(duì)象患有下列原發(fā)性肝臟疾病，例如原發(fā)性膽汁郁積性肝硬化、肝癌、原發(fā)性硬化性膽管炎、自體免疫慢性肝炎、酒精性肝炎以及感染性疾病，例如C型肝炎，此狀態(tài)亦包含一些次要的狀態(tài)，比如寄生蟲引起的感染， 例如蛔蟲，或是藥物及化學(xué)藥品中毒。在本發(fā)明的此部分，干細(xì)胞或前驅(qū)細(xì)胞的捐贈(zèng)者及接受者可以是同一個(gè)體或是不同個(gè)體，比如同種異體或異種異體，當(dāng)進(jìn)行同種異體的移植， 降低移植排斥的照護(hù)需要被進(jìn)行，此類的照護(hù)常常施行于人類的治療，相關(guān)的治療如以下文獻(xiàn)所述(Slavin et al. , e. g. , J Clin Immunol (2002) 22 :64, and J. Hematother Stem Cell Res(2002) 11 :265),Gur et al. (Blood(2002)99 :4174)，and Martelli et al,(Semin Hematol(2002) 39 :48))。標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)可用來(lái)診斷一個(gè)需要被治療的試驗(yàn)對(duì)象是否具有相關(guān)的狀況或癥狀， 例如過(guò)度的膠原沉積是由慢性病毒、肝炎、酒精濫用以及藥物中毒所引起的肝臟纖維化的主要特征。此治療方法須對(duì)需要治療的試驗(yàn)對(duì)象使用有效劑量的上述細(xì)胞，而且治療效果可用標(biāo)準(zhǔn)的方法加以評(píng)估，例如以下實(shí)施例所描述的方法。本發(fā)明并包含一種增加在受測(cè)試對(duì)象肝臟中白蛋白、肝臟生長(zhǎng)因子或金屬蛋白酶的方法，此方法包括在需要治療的試驗(yàn)對(duì)象中，使用含有培養(yǎng)多功能動(dòng)物細(xì)胞的第一制備品，或含有肝祖細(xì)胞的第二制備品，該多功能動(dòng)物細(xì)胞是對(duì)選自于以下群組中的一種或多種標(biāo)記呈陽(yáng)性反應(yīng)，該群組由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所組成，該多功能動(dòng)物細(xì)胞并對(duì)取自以下群組的一種或多種標(biāo)記產(chǎn)生陰性反應(yīng)，該群組由 CD14、CD34和CD45所組成，該金屬蛋白酶在消化肝硬化膠原中扮演重要的角色，某些研究顯示增加金屬蛋白酶的表達(dá)有助于降低肝硬化中的膠原。我們可以通過(guò)測(cè)量白蛋白、肝臟生長(zhǎng)因子或金屬蛋白酶在樣本中的表達(dá)量，以確認(rèn)治療的功效，這些樣本是在本發(fā)明的藥品使用前及使用后取自于試驗(yàn)對(duì)象，這些表達(dá)量是由mRNA水平或蛋白質(zhì)水平所確定，在測(cè)量組織樣本或體液樣本中的mRNA水平的方法，是本領(lǐng)域中的習(xí)知技術(shù)，為測(cè)量mRNA的水平，細(xì)胞被溶解，而在溶解產(chǎn)物中mRNA的水平可由如下方法所確定，例如雜交試驗(yàn)法或定量或半定量的RT-PCR，無(wú)論該溶解產(chǎn)物是否有純化，其中，該雜交試驗(yàn)法是使用具有基因特異性的DNA或RNA探針，而RT-PCR是使用適當(dāng)?shù)幕蛱禺愋砸铮硗?，定量或半定量的原位雜交試驗(yàn)，可用來(lái)檢查組織切片或未溶解的細(xì)胞懸浮液，該定量或半定量的原位雜交試驗(yàn)是使用以熒光劑或酶所標(biāo)記的DNA或RNA探針， 此外，mRNA定量法包含有RNA保護(hù)試驗(yàn)法(RPA)、基因表達(dá)序列分析法(SAGE)及數(shù)組技術(shù)。在組織樣本或體液中，測(cè)量蛋白質(zhì)水平的方法在本領(lǐng)域中是習(xí)知的方法，某些測(cè)量蛋白質(zhì)水平的方法，使用可以特異性的結(jié)合于目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體，例如單株抗體或多株抗體，在這些方法中，抗體本身或結(jié)合于該抗體的次級(jí)抗體可以被檢測(cè)到?；蛘呖贵w結(jié)合生物素。而抗生物素又用來(lái)標(biāo)記生物素(抗生物素是一種可與生物素結(jié)合的多勝肽)，抗生物素是可以被檢測(cè)，檢測(cè)抗生物素的含量就可以確定生物素的含量，上述多種手段的結(jié)合，包括“多層三明治檢測(cè)法(multi-layer sandwich assay) ”可以用來(lái)加強(qiáng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的敏感度，某些蛋白質(zhì)測(cè)量法，例如酵素連結(jié)免疫吸附法(ELISA)或免疫印跡法(Western blot) 可以使用于體液或細(xì)胞的溶解物的蛋白質(zhì)檢測(cè)，而一些其它的蛋白質(zhì)檢測(cè)法，比如免疫組織學(xué)法或熒光流式細(xì)胞儀，則可使用于組織切片或未溶解細(xì)胞懸浮液的蛋白質(zhì)檢測(cè)，可以使用的標(biāo)記包括放射性核種(同位素)，例如125I、mI、35S、3H或32P酶堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、熒光酵素(熒光酶)或半乳糖苷酶、熒光發(fā)光劑例如熒光、藻紅蛋白、GFP、BFP和由 Quantum Dot Corporation供應(yīng)的Qdot ，其它可使用的方法包括定量免疫沉淀反應(yīng)法及互補(bǔ)結(jié)合反應(yīng)法。上述試驗(yàn)方法的結(jié)果可用以確定藥物使用的劑量范圍及藥物施用的途徑，藥物的劑量確定于藥物施用的途徑、藥物的配方、患者的疾病，以及患者本身的體重、表面積、年紀(jì)或性別，以及是否有其它的藥物也在同時(shí)施用以及醫(yī)生的判斷，由于不同的藥物適用途徑有不同的藥物效率，因此藥物劑量的變化是必須的，習(xí)知的根據(jù)經(jīng)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法可用于調(diào)整藥物劑量以達(dá)到最佳的效果。一般而言，細(xì)胞的施用量是在IxlO4到IxlO7之間，比如 IxlO5到切106而較理想的是切105到hio5，依據(jù)治療的特質(zhì)，藥物可以同時(shí)施用于多個(gè)不同部位，如上所述，自體移植或異體移植的華頓氏膠干細(xì)胞或肝祖細(xì)胞都可以被使用，在異體移植的情形，人類白血球抗原配對(duì)要被進(jìn)行以避免或減低被移植者的反應(yīng)，在自體移植的情形，自體細(xì)胞將被濃縮及純化并且被儲(chǔ)存?zhèn)溆??！爸委煛笔侵笇?duì)試驗(yàn)對(duì)象施用藥物組合物，例如細(xì)胞組成，而該試驗(yàn)對(duì)象是患有肝臟疾病或有肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)，治療的目的是改善肝臟的疾病并且減輕肝臟疾病的癥狀或是減少發(fā)生肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)，肝臟疾病包括原發(fā)性的肝臟疾病，例如原發(fā)性膽汁肝硬化、肝癌、原發(fā)性硬化性膽管炎、自體免疫性肝炎、酒精性肝炎以及感染性肝炎，例如A型、B型或C 型肝炎、肝臟疾病包括一些次級(jí)(繼發(fā))的狀況，例如寄生蟲或蛔蟲感染、藥物及化學(xué)藥品中毒等，由于肝臟在新陳代謝及體內(nèi)平衡中扮演關(guān)鍵性角色，例如白蛋白的合成及血管的形成，因此受損的肝功能會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)的嚴(yán)重結(jié)果。在此，所謂的有效劑量是指藥物組合物的量足以在受治療的對(duì)象中產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上所想要的效果，治療可以單獨(dú)使用或與其它的藥物或治療并用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述的細(xì)胞及方法可用于有效率的促進(jìn)干細(xì)胞或前驅(qū)細(xì)胞(前體細(xì)胞)的體外培養(yǎng)，這些干細(xì)胞或前驅(qū)細(xì)胞是取自于攜帶型骨髓、外圍血液及內(nèi)皮層器官并且適合于移植進(jìn)入肝臟，同時(shí)這些體外培養(yǎng)的細(xì)胞能夠用于治療肝臟疾病即恢復(fù)肝臟功能，本發(fā)明的這些方法并能用于移植器官的細(xì)胞基因治療。本發(fā)明的上述方法并可包括在這些植入細(xì)胞之前、同時(shí)或之后，對(duì)受試驗(yàn)者進(jìn)行抑制免疫反應(yīng)的照護(hù)(護(hù)理)，這些免疫照護(hù)的方法包括使用免疫抑制的藥物，提高對(duì)植入細(xì)胞的容忍度(耐受性)以及使用的免疫抑制的放射線照射，這些免疫治療照護(hù)的方法是本領(lǐng)域中習(xí)知的技術(shù)并見諸于下列文獻(xiàn)。(例如Kirkpatrick et al. , 1992. JAMA. 268, 2952 ；Higgins et al.，1996. Lancet 348,1208 ；Suthanthiran et al.,1996. New Engl. J.Med. 331,365；Midthun et al. ,1997. Mayo Clin Proc. 72,175 ；Morrison et al., 1994. Am J. Med. 97,14 ；Hanto 1995. Annu Rev Med. 46,381 ；Senderowicz et al. , 1997. Ann Intern Med. 126,882 ；Vincenti et al.,1998. New Engl. J. Med. 338,161；Dantal et al.1998.Lancet 351,623)。
適用的免疫抑制藥物包括CTLA4_Ig、抗-⑶40抗體、抗-⑶40配體抗體(anti-⑶40 ligand antibodies)、抗-B7抗體、抗-CD3抗體(例如，抗-人CD3抗體0KT3)、甲氨喋呤 (methotrexate, MTX)、5S的豐公(prednisone) >(methyl prednisolone) > 1 ^ (azathioprene) ^ (cyclosporin)A(CsA) >^3 ^ (tacrolimus) > 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)和氟達(dá)拉賓(f ludarabin)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、達(dá)利珠單抗(daclizumab)(人源化(IgGlFc)抗-IL2R α 鏈(CD25)抗體)、連接至毒素的抗-T-淋巴細(xì)胞抗體(例如，霍亂(Cholera)A鏈、或假單胞菌(I^eudomonas)毒素)、以及能夠抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian-target-of-rapamycimmTOR)活性的試劑。在此需要特別說(shuō)明的是以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非用于限制本發(fā)明的范圍，根據(jù)本發(fā)明所敘述的內(nèi)容任何熟悉此項(xiàng)技術(shù)人員當(dāng)然能據(jù)以充分實(shí)施本發(fā)明，而任何依據(jù)本發(fā)明所做的任何變化與修改亦將包含于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。下述為本發(fā)明的實(shí)施步驟。華頓氏膠干細(xì)胞的培養(yǎng)根據(jù)先前的報(bào)告，本試驗(yàn)使用的華頓氏膠質(zhì)干細(xì)胞是在捐贈(zèng)者同意之下取自于捐贈(zèng)的臍帶，這些華頓氏膠干細(xì)胞的取得是在佛教慈濟(jì)醫(yī)院審核委員會(huì)的同意之下進(jìn)行， 這些取得的細(xì)胞是在含有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，在攝氏37°C進(jìn)行培養(yǎng)，這些取得的細(xì)胞是在IMDM(Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium)的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)及增值， 此培養(yǎng)液含10%的胎瘤血清(HYCL0NE，Logan, UT, USA)及l(fā)Ong/mL的堿性纖維組織母細(xì)胞增長(zhǎng)因子(R&D，Minneapolis,麗，USA)、2mM的麩胺酰胺和100U/L的盤尼西林鏈霉素 (INVITR0GEN, Carlsbad, CA, USA)。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中是使用繁殖10到20倍的細(xì)胞。華頓氏膠干細(xì)胞的特征在使用各種抗體對(duì)華頓氏膠干細(xì)胞的表面標(biāo)志進(jìn)行標(biāo)記之后，華頓氏膠干細(xì)胞的表面標(biāo)志用流式細(xì)胞儀加以分析(FC500 ；BECKMANCOULTER, Brea, CA, USA)，這些抗體是針對(duì)各種人類的抗原 CD105 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, Santa Cruz, CA, USA) ；CD13、CD14、 CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-DR 和 IgG2a(DAK0, Carpinteria, CA, USA)以及 CD49b、CD49d、 CD73 和 CD90 (BECT0N DICKINSON, Franklin Lakes, NJ, USA)，次級(jí)抗體(二抗)則與異硫氰酸酯熒光素(CHEMIC0N，Temecula，CA，USA)結(jié)合以便進(jìn)行檢測(cè)。試管內(nèi)肝細(xì)胞分化在本發(fā)明中，試管內(nèi)肝細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)是依據(jù)一個(gè)改良的細(xì)胞培養(yǎng)方案進(jìn)行，該方案記載于下列文獻(xiàn)(2004, Nat. Cell Biol. 6(6) :532-539, by Jang et al.), Wyss (3 X IO4) 與50毫克的肝臟組織共同培養(yǎng)于一個(gè)6孔培養(yǎng)皿(BECT0N DCKINS0N)，該培養(yǎng)皿具有孔徑大小為0.4微米的薄膜分開細(xì)胞及組織，這些肝臟組織是取自于一種雄性的老鼠，而這些雄性的老鼠在培養(yǎng)之前其父母以350毫克/公斤的劑量暴露于一種肝毒性的試劑，例如硫乙酰胺中M小時(shí)，在培養(yǎng)期間的第二天及第四天，從華頓氏膠干細(xì)胞萃取出所有的RNA，同時(shí)cDNA則被制備成樣本以進(jìn)行肝臟特異基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析(PCR)。該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是在下列條件下進(jìn)行35個(gè)周期，每一周期包含在95°C進(jìn)行變性反應(yīng)30秒，再進(jìn)行退火30秒，依據(jù)所使用的引物對(duì)(primer set)在56_60°C進(jìn)行，在 72°C延伸60秒，最后在72°C進(jìn)行10分鐘的培養(yǎng)，使用這些引物對(duì)擴(kuò)增的DNA則使用凝膠電泳進(jìn)行分析。白蛋白(F)5' -TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG-3‘ (SEQ ID NO :1)禾口(R) 5' -AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3‘ (SEQ ID NO :2)。色氨酸2，3雙加氧酶(F)5' -TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG-3‘ (SEQ ID NO :3)和(R)5' -CTCTGGATTGACTGTGGAAGT-3‘ (SEQ ID NO :4)。a-胎兒蛋白(F) 5' -ATACAGAGACTTCAGGAGC-3 ‘ (SEQ ID NO :5)禾口(R)5' -GTGAAGAGGGAAGACATAACTG-3‘ (SEQ ID NO :6。肝臟生長(zhǎng)因子(F) 5' -CAGATCATCCATTGCATTCG-3 ‘ (SEQ ID NO :7)禾口(R)5' -ACTCCAGAGGCATTTCCATG-3‘ (SEQ ID NO :8)。金屬蛋白酶(F) 5，-TgAATgCCCTTgATgTCATCCT-3，(SEQ ID NO :9)和(R)5，-ACACCTACACCAAgAACTTC-3，(SEQ ID NO :10)。CYP7A1 (F) 5，-GAGAAGGCAAACGGGTGAAC-3，(SEQ ID NO :11)禾口(R)5，-ATCGGGTCAATGCTTCTGTG-3，(SEQ ID NO :12)。Nanog (F) 5，-TGCCTCACACGGAGACTGTC-3，(SEQ ID NO :13)禾口(R)5，-TGCTATTCTTCGGCCAGTTG-3，(SEQ ID NO :14)。OCT 4 (F) 5，-CTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAA-3，(SEQ ID NO :15)禾口(R)5，-CTGCAGTGTGGGTTTCGGGCA-3，(SEQ ID NO :16)。ckit (F) 5，-ATGAGAGGCGCTCGCGGCGC-3，(SEQ ID NO :17)禾口(R)5，-AGCTTGGCAGGATCTCTAAC-3，(SEQ ID NO :18)。甘油酸-3-磷酸脫氧酶(F)5' -GGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3‘ (SEQ ID NO 19)禾口(R)5' -GCAGGTTTTTCTAGACGG-3‘ (SEQ ID NO :20)。建立老鼠肝臟纖維化的模型及確定其肝臟纖維化的程度Wistar Kyoto (WKY)老鼠自LASCO公司(臺(tái)北、臺(tái)灣)取得，所有的試驗(yàn)程序皆遵 循道德規(guī)范并由東華大學(xué)動(dòng)物照護(hù)使用委員會(huì)所批準(zhǔn)。20只成年的雄性WKY老鼠重量320士20克被使用來(lái)建立慢性肝臟纖維化的模型， 其中的20只在父母內(nèi)被注射200毫升/公斤的硫乙酰胺(SIGMA-ALDRICH)，鋒三天一次總 共60天，亦即總共注射20次以作為纖維化模型組，其中的八只則被注射食鹽水做為對(duì)照 組，在第64天，亦即在最后一次注射之后的四天，這些老鼠被處死并且取其心臟血液樣本 及肝臟樣本。
這些血液樣本使用生化分析儀(INTEGRA 800 ；ROCHE, Holliston, MA, USA)分析，以測(cè)量肝功能指數(shù)，這些肝功能指數(shù)包含GOT (谷草轉(zhuǎn)氨酶，glutamate oxaloacetate transaminase)與 GPT (谷丙轉(zhuǎn)氨酶，glutamate pyruvate transaminase)。這些肝臟組織的樣本使用膠質(zhì)纖維染色法(麻省三色染色，Masson’ s trichrome staining)檢查組織，并以是否有過(guò)度膠原蛋白的累積造成的纖維化切片，這些肝臟組織樣本以3. 7%的甲醛固定，然后包埋于石蠟中，然后一系列的三微米厚的切片是被包埋的組織中取出，并以蘇木色素、曙紅染料與麻省三色染色。就膠質(zhì)纖維染色法而言，被切片的樣本放置于56 °C的布安氏液(Bouin’ s solution ；SIGMA-ALDRICH)中一個(gè)小時(shí)，然后依照順序在下列溶液中培養(yǎng)，蘇木紫溶液 (Mayer' s hematoxylin solution) 5 分I中、酸溶液(Biebrich scarlet-acid fuchsin solution) 15 分鐘、磷銷酸-磷鶴酸溶液(phosphomolybdic acid-phosphotungstic acid) 15分鐘、苯胺藍(lán)溶液(aniline blue)5分鐘。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的肝臟纖維化程度由以下文獻(xiàn)記載的方法加以定量(Bruck et al.，2007，J. Gastroenterol. Hepatol. 22(12) :2189-2194)，這些由膠質(zhì)纖維染色的肝臟組織切片被拍照，然后由三位獨(dú)立的病理學(xué)家從0-3作半定量的評(píng)分，每一塊載玻片選取十個(gè)不同位置加以評(píng)分，然后平均這些分?jǐn)?shù)以確定肝臟纖維化的程度，分?jǐn)?shù)越高表示肝臟纖維化的程度越高。細(xì)胞移植步驟如前所述華頓氏膠干細(xì)胞QX IO7個(gè))已經(jīng)與硫乙酰氨中毒的肝臟組織在75平方公分的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，然后華頓氏膠干細(xì)胞以胰蛋白酶消化的方法分離并用離心的方法加以收集，這些收集的細(xì)胞再以2X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度懸浮于一般的食鹽水中。細(xì)胞移植是依照一個(gè)改良的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)方案記載于以下文獻(xiàn)(Abdel Aziz et al. , 2007, Clin. Biochem. 40 (12) :893-899 and Zhao et al. ,2005, World J. Gastroenterol. 11(22) :3431-3440)，在上述建立肝臟纖維化模型中所提到的，用硫乙酰胺引起纖維化肝臟的30只老鼠在第64天，即在最后一次注射硫乙酰胺后的4天，被用于細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，這些老鼠被隨意分成兩組，一組是華頓氏膠干細(xì)胞組，一組偽治療組，15只在華頓氏膠干細(xì)胞組的老鼠用乙醚加以麻醉后，再經(jīng)由門靜脈注入含有100萬(wàn)個(gè)華頓氏膠干細(xì)胞的食鹽水，而治療組的老鼠則被注射0. 5毫升的一般生理食鹽水。自細(xì)胞移植之后，每周從兩組各取出5只老鼠加以處死，連續(xù)三周，然后進(jìn)行生化肝功能組織檢查及肝臟病理組織學(xué)檢查。被移植的華頓氏膠干細(xì)胞s的特征被移植的華頓氏膠干細(xì)胞的表達(dá)對(duì)人類白蛋白、人類線粒體、人類金屬蛋白酶以及人類肝臟生長(zhǎng)因子有特異性的單株抗體被用來(lái)確定被移植的華頓氏膠干細(xì)胞是否有表達(dá)出如前面所述的肝臟標(biāo)記。使用抗人類白蛋白，抗金屬蛋白酶以及抗人類肝臟生長(zhǎng)因子的試劑，對(duì)包埋于石蠟并經(jīng)過(guò)切片的肝臟樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，然后一個(gè)免疫組織化學(xué)分析的套組(INN0GENEX，San Ramon, CA, USA)用來(lái)將存在的抗原予以可視化，為使用于熒光顯微鏡檢測(cè)抗原，這些被切片的肝臟樣本先在抗人類線粒體培育一個(gè)晚上，再與二級(jí)抗體(羅丹明連接的抗小鼠二抗)一起培育。統(tǒng)計(jì)分析
所有取得的數(shù)據(jù)與具有標(biāo)準(zhǔn)差的平均值呈現(xiàn)，使用學(xué)生氏t實(shí)驗(yàn)(student’ s t test)來(lái)比較治療組與對(duì)照組的數(shù)據(jù)差異，考慮到治療組及對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)差異ρ值小于 0. 05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果華頓氏膠干細(xì)胞的形態(tài)及其表面標(biāo)記分別用顯微鏡及流式細(xì)胞儀加以確定，華頓氏膠干細(xì)胞的表面標(biāo)記類似于前面所述(Tang et al.，2006，World J. Gastroenterol. 12(25) :4014-4019)，在此一研究中所取得的華頓氏膠干細(xì)胞并不具有造血細(xì)胞的標(biāo)記，例如⑶14、⑶34或⑶45但是具有間葉干細(xì)胞的標(biāo)記(例如⑶四、⑶44、 ⑶49b、⑶49d、⑶73、⑶90和⑶10 及骨髓細(xì)胞的標(biāo)記⑶13，及主要組織兼容性復(fù)合體標(biāo)記HLA-DR，如圖第IA到圖IM所示，同時(shí)華頓氏膠干細(xì)胞具有類似人類纖維母細(xì)胞的形態(tài)， 如圖IN所示。為了測(cè)試華頓氏膠干細(xì)胞與受硫乙酰胺所傷害的老鼠肝臟組織共同培養(yǎng)時(shí)是否能夠進(jìn)行肝臟細(xì)胞分化，前面所述方法去測(cè)試肝臟細(xì)胞標(biāo)志，RT-PCR顯示，在分化條件下所培養(yǎng)的華頓氏膠干細(xì)胞能夠取得肝臟特異性基因的表達(dá)，包括色氨酸2，3雙加氧酶、白蛋白、α -胎兒蛋白和CYP7A1，同時(shí)肝臟生長(zhǎng)因子和金屬蛋白酶的基因表達(dá)亦有所增加，而干細(xì)胞的基因表達(dá)，包括nan0g、0ct4和ckit則減少，這些結(jié)果顯示華頓氏膠干細(xì)胞具有在試管中分化成類肝臟細(xì)胞的潛力。肝臟纖維化模型的特征及華頓氏膠干細(xì)胞細(xì)胞治療的效果評(píng)估如表1所示，相較于正常的老鼠群組，肝臟纖維化老鼠群組的GOT及GPT有顯著的增加(GOT 從 110 士 16U/L 至 1034士 361U/L，以及 GPT 從 77 士 10U/L 至 185 士 50U/L)，這樣的結(jié)果顯示肝臟有受到傷害。表1正常老鼠及肝纖維化老鼠的血漿生化值
權(quán)利要求
1.一種取得肝祖細(xì)胞的方法，包括取得含有被培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞的制備物，所述制備物對(duì)一種或多種選自以下群組的標(biāo)記呈陽(yáng)性反應(yīng)，所述群組由⑶29、⑶44、⑶49b、 ⑶49d、⑶73、⑶90、⑶105、⑶13和HLA-DR所組成，并對(duì)一種或多種取自以下群組的標(biāo)記呈陰性反應(yīng)，所述群組由⑶14、⑶34和⑶45所組成，將所述多功能動(dòng)物細(xì)胞與肝臟組織培養(yǎng)于培養(yǎng)液中一段時(shí)間，然后收集所述共培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞的后代以取得肝祖細(xì)胞，其中，所述多功能動(dòng)物細(xì)胞是取自于第一實(shí)驗(yàn)對(duì)象的臍帶的華頓氏膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一實(shí)驗(yàn)對(duì)象是人類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述共培養(yǎng)肝臟組織是一種受傷的肝臟組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述受傷的肝臟組織是通過(guò)以下過(guò)程取得，所述過(guò)程包含使取自于第二試驗(yàn)對(duì)象的肝臟組織經(jīng)受肝臟毒性試劑的作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述肝臟毒性試劑是一種化學(xué)試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述化學(xué)試劑是硫乙酰胺或四氯甲烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述肝祖細(xì)胞表達(dá)一種或多種選自于以下群組的基因，所述群組由CK18、白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶、α-胎兒蛋白、CYP7A1、nanog、 oct4、ckit、肝臟生長(zhǎng)因子和金屬蛋白酶所組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多功能動(dòng)物細(xì)胞對(duì)肝臟生長(zhǎng)因子或金屬蛋白酶呈陽(yáng)性反應(yīng)。
9.一種制備物，包含肝祖細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種選自以下群組的基因， 所述群組由0(18、白蛋白、色氨酸2，3雙加氧酶、0-胎兒蛋白丄丫 7六1、皿11(^、0(^4、01^仏肝臟生長(zhǎng)因子和金屬蛋白酶所組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備物，其中，所述細(xì)胞由權(quán)利要求1所述的方法制備。
11.一種組合物，包含制備品，所述制備品含有培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞和肝臟組織， 其中，所述多功能動(dòng)物細(xì)胞對(duì)一種或多種取自于以下群組的標(biāo)記呈陽(yáng)性反應(yīng)，所述群組由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所組成，并對(duì)一種或多種取自于以下群組的標(biāo)記呈陰性反應(yīng)，所述群組由⑶14、⑶34和⑶45所組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述肝臟組織是一種分離的肝臟組織。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述肝臟組織是經(jīng)受肝臟毒性試劑作用而受傷的肝臟組織。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述多功能動(dòng)物細(xì)胞是取自于第一實(shí)驗(yàn)對(duì)象的臍帶的華頓氏膠。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中，所述第一實(shí)驗(yàn)對(duì)象是人類。
16.一種治療肝纖維化或肝硬化的方法，包括鑒定出患有肝硬化或肝纖維化或具有肝硬化或肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及施用于所述對(duì)象有效劑量的(一)第一制備物或(二) 第二制備物，其中，所述第一制備物包含培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞，所述第二制備物含有肝祖細(xì)胞，其中，所述多功能動(dòng)物細(xì)胞對(duì)一種或多種選自以下群組的標(biāo)記呈陽(yáng)性反應(yīng)，所述群組由 CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13 和 HLA-DR 所組成，并對(duì)一種或多種選自以下群組的標(biāo)記呈陰性反應(yīng)，所述群組由⑶14、⑶34和⑶45所組成。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述多功能動(dòng)物細(xì)胞或所述肝祖細(xì)胞施用于所述對(duì)象并分化成表達(dá)白蛋白的細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述肝祖細(xì)胞依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備。
19.一種增加肝臟中白蛋白、肝臟生長(zhǎng)因子或金屬蛋白酶含量的方法，包括施用于需要對(duì)象有效量的(一)第一制備品或(二)第二制備品，其中，所述第一制備品含有培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞，所述第二制備品含有肝祖細(xì)胞，其中，所述多功能動(dòng)物細(xì)胞對(duì)一種或多種選自以下群組的標(biāo)記呈陽(yáng)性反應(yīng)，所述群組由⑶四、⑶44、⑶49b、⑶49d、⑶73、⑶90、 ⑶105、⑶13和HLA-DR所組成，并對(duì)一種或多種選自以下群組的標(biāo)記呈陰性反應(yīng)，所述群組由⑶14、CD34和CD45所組成。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述肝祖細(xì)胞依據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明提供一種肝祖細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的取得肝祖細(xì)胞的方法包括取得含有被培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞的制備物，該制備物對(duì)一種或多種選自由CD29、CD44、CD49b、CD49d、CD73、CD90、CD105、CD13和HLA-DR所組成的群組的標(biāo)記呈陽(yáng)性反應(yīng)，并對(duì)一種或多種取自由CD14、CD34和CD45所組成的群組的標(biāo)記呈陰性反應(yīng)，將多功能動(dòng)物細(xì)胞與肝臟組織培養(yǎng)于培養(yǎng)液中一段時(shí)間，然后收集共培養(yǎng)的多功能動(dòng)物細(xì)胞的后代以取得肝祖細(xì)胞，其中，多功能動(dòng)物細(xì)胞是取自于第一實(shí)驗(yàn)對(duì)象的臍帶的華頓氏膠。通過(guò)本發(fā)明獲得的多功能肝祖細(xì)胞能夠用以治療肝病及其相關(guān)問題。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102234626SQ20111011742
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者林欣榮, 韓鴻志 申請(qǐng)人:國(guó)璽干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù)股份有限公司