專利名稱：一種生產(chǎn)蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)產(chǎn)物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)產(chǎn)物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蟬花即蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)，是一種蟲生真菌，因其與冬蟲夏草一樣同屬蟲菌復(fù)合體，且含有相近的化學(xué)、營養(yǎng)成分，所以常用被用作冬蟲夏草的代用品。蟬花具有免疫調(diào)節(jié)、解熱鎮(zhèn)痛、改善腎功能、鎮(zhèn)靜催眠、抗輻射等多種藥理作用，可被應(yīng)用到食品、保健品、藥品、化妝品等領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，在蟬擬青霉孢子中檢測出與其他部位如孢梗束、菌質(zhì)中同樣的營養(yǎng)成分，甚至含量更高。此外，蟬擬青霉作為擬青霉屬的蟲生真菌，其分生孢子同樣可作為生物防治的有效手段，從源頭上解決農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問題?，F(xiàn)有專利中蟬花的人工培育方法只是為了獲得菌絲體、孢梗束或帶蟲體的子實體而設(shè)計的培養(yǎng)基和方法，并沒有專門為了獲得蟬花孢子粉而設(shè)計的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。另外，現(xiàn)有的培養(yǎng)方法中，單純的液體培養(yǎng)并不能獲得蟬擬青霉分生孢子，而固體培養(yǎng)存在生產(chǎn)周期長、菌劑含孢量低、成本高等弊端。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)產(chǎn)物及其應(yīng)用。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題
一種生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的固相培養(yǎng)基，所述固相培
麩皮20 45 ■量份；
玉米粉5 30重量份；
蔗糖0. 5 5 ■量份；
蠶蛹粉0. 5 5 ■量份；
KNO30. 1 3 1I量份；
KH2PO40. 05 1重量份；
MgSO40. 05 0.8重量份；
H2O25 70I量份。
或者，所述固相培養(yǎng)基的原料組分包括
麩皮40 70重量份；
營養(yǎng)液30 60重量份；
貝殼粉0. 01 2 ■量份；
蠶蛹粉0. 01 5 ■量份；
其中，所述I爹養(yǎng)液中含有的組分名稱及其重量百分比為
KNO3蔗糖KH2PO,
0. 1 5% ； 1 20% ； 0. 05 3%MgSO4 0.01 0.5%:檸檬酸銨 0.01 0.1%;H2O余量。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的液相培養(yǎng)基，所述液相培養(yǎng)基中含有的組分名稱及其重量百分比為馬鈴薯 10 30%;蔗糖1 10%;檸檬酸0.01 1%;H2O余量。本發(fā)明還提供了一種蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法采用上述固相培養(yǎng)基及液相培養(yǎng)基，且所述培養(yǎng)方法包括如下步驟1)斜面菌種制備將蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，20 25°C下，培養(yǎng)3 5天；2)種子液的制備從斜面上刮取菌絲接種到以PDA液體為基礎(chǔ)的三角瓶液體培養(yǎng)基中，20 25°C下，140 160rpm，培養(yǎng)3 5天即可制得蟬擬青霉種子液；3)將步驟幻中制得的蟬擬青霉種子液按重量百分比為10 15%接入所述液體培養(yǎng)基中，在20 25°C下，140 160rpm，振蕩發(fā)酵3 5天；4)將步驟3)中制得的發(fā)酵液按重量百分比為3% 10%接入滅菌后的所述固相培養(yǎng)基中，在溫度為18 23°C，濕度為50 90%的條件下，靜置開放式培養(yǎng)15 25天。較佳的，步驟1)中，所述斜面培養(yǎng)基為PDA固相培養(yǎng)基，其制備可由本領(lǐng)域技術(shù)人員參考現(xiàn)有技術(shù)進行確認(rèn)。進一步優(yōu)選的，所述PDA固相培養(yǎng)基的制備方法為挑取新鮮馬鈴薯，去皮洗凈并切碎后與水混合，其中，馬鈴薯和水的重量比例為1 (3 7)，滅菌后過濾，其濾液為馬鈴薯煮汁，然后在所述馬鈴薯濾液中加入瓊脂2 %份，蔗糖2 %份，加熱溶解后加水補足使得體積至原來馬鈴薯濾液體積，然后分裝至試管，在121°C，1. 05Kg/cm2滅菌30min后擺斜面， 冷卻后使用。優(yōu)選的，步驟4)中，所述的生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的固相培養(yǎng)基，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基的制備方法為先將玉米粉和麩皮煮熟，將蔗糖、KN03、KH2P04、MgS04在水中溶解，再與蠶蛹粉、煮熟后的玉米粉和麩皮按照比例混合均勻。較佳的，步驟4)中，所述靜置開放式培養(yǎng)過程中，周圍環(huán)境為萬級潔凈空間，同時通無菌風(fēng)保證培養(yǎng)室內(nèi)空氣交換流通；進一步優(yōu)選的，在靜置開放式培養(yǎng)過程中，還需要在培養(yǎng)基上面覆蓋多層厚度為0. 1 0. 3mm/層，含水量為飽和的無菌吸水紙進行固相發(fā)酵。 更佳的，所述靜置開放式培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基上面覆蓋多層厚度為0. 1 0. 3mm/層，在所述固相培養(yǎng)基的營養(yǎng)液中浸泡至飽和的無菌吸水紙進行固體發(fā)酵。本發(fā)明第三方面提供了一種由上述蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)方法所產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物， 該發(fā)酵產(chǎn)物包括發(fā)酵過程產(chǎn)生的孢子、次生代謝產(chǎn)物以及剩余培養(yǎng)基等。
本發(fā)明的培養(yǎng)產(chǎn)物中含有多糖、蟲草酸、腺苷、多種氨基酸等成分，具有免疫調(diào)節(jié)、 解熱鎮(zhèn)痛、改善腎功能、降血壓、抗輻射、抗腫瘤及降血糖等功能，可以應(yīng)用于人們的健康生活領(lǐng)域，比如用于制備功能食品、藥品或日化洗護用品等。同時發(fā)酵過程能夠產(chǎn)生大量孢子，且培養(yǎng)產(chǎn)生的孢子可以作為生物防治的有效手段，從源頭上解決農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問題，因此，可以用于生物防治領(lǐng)域，比如生物農(nóng)藥等。


圖1 人工培養(yǎng)蟬擬青霉分生孢子對PHA刺激或未刺激的淋巴細(xì)胞作用M小時時對淋巴細(xì)胞增殖的影響。圖2 人工培養(yǎng)蟬擬青霉分生孢子對PHA刺激或未刺激的淋巴細(xì)胞作用48小時時對淋巴細(xì)胞增殖的影響。圖3 人工培養(yǎng)蟬擬青霉分生孢子對PHA刺激或未刺激的淋巴細(xì)胞作用72小時時對淋巴細(xì)胞增殖的影響。圖4 蟬擬青霉分生孢子對PHA刺激的人淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期的影響試驗結(jié)果。
具體實施例方式下面通過具體實施例進一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例11、培養(yǎng)基的制備1.PDA斜面制備(固體)挑取新鮮無發(fā)芽無病害的馬鈴薯，去皮洗凈，切成小薄片，稱200g，加水lOOOmL， 煮沸30min后過濾，其濾液為馬鈴薯煮汁。然后加入瓊脂20g，蔗糖20g，加熱溶解后補足水至IOOOmL,分裝試管，121°C，1. 05Kg/cm2,滅菌30min后，擺成斜面，冷卻后使用。2.固相培養(yǎng)基的制備稱取麩皮800g，玉米粉 150g，H20 720ml，混合蒸煮 lh，蔗糖 10g，KNO3 5g，KH2P043g， MgSO4 2g，用少量H2O溶解后，與蠶蛹粉10g，與煮熟后的麩皮和玉米粉混合均勻，121°C， 1. 05Kg/cm2，滅菌 30min 后使用。所述固體培養(yǎng)基還可為稱取麩皮1200g，蠶蛹粉20g，貝殼粉15g，營養(yǎng)液IOOOmL,混合后，121°C，1. 05Kg/ cm2,滅菌30min后使用。其中，所述營養(yǎng)液具體組成如下=KNO3為0. 5 %，蔗糖為10 %，KH2PO4 為1 %, MgSO4 % 1%，檸檬酸銨為0. 05%，H2O為余量。3.液體培養(yǎng)基的制備挑取新鮮無發(fā)芽無病害的馬鈴薯，去皮洗凈，切成小薄片，稱200g，加水lOOOmL， 煮沸30min后過濾，其濾液為馬鈴薯煮汁。然后加入蔗糖20g，檸檬酸0. Ig加熱溶解后補足水至 lOOOmL，混合后，121°C，1. 05Kg/cm2，滅菌 30min 后使用。2、蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)過程1.蟬擬青霉菌種的制備將蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae)接到PDA斜面固體培養(yǎng)基上，22°C恒溫培養(yǎng)4 6天，備用。2.液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)蟬擬青霉孢子取斜面種，用接種環(huán)刮取少量帶分生孢子的菌絲體接入液體培養(yǎng)基中，搖瓶裝液量200mL/500mL，22°C下，140rpm，振蕩發(fā)酵3 5天，再將發(fā)酵液按照3 5%的接種量接入固相培養(yǎng)基上，混勻，在培養(yǎng)基上面覆蓋一層厚度為0. 1 0. 3mm，含水量為飽和的無菌吸水紙進行固體發(fā)酵，25°C，濕度為60%的條件下培養(yǎng)10 25天即得到大量蟬擬青霉孢子。在所述含有營養(yǎng)液組分的固相培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基上面覆蓋一層厚度為 0. 1 0. 3mm，在所述固相培養(yǎng)基的營養(yǎng)液中浸泡至飽和的無菌吸水紙，然后將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的蟬擬青霉菌絲體按照3 5%的接種量噴灑在吸水紙表面，25°C，濕度為 60%的條件下培養(yǎng)10 25天即得到大量蟬擬青霉孢子。3.蟬擬青霉分生孢子的收集方法，具體包括以下步驟(1)菌種培養(yǎng)實施例1(2)培養(yǎng)物烘干將培養(yǎng)物整體倒入沸騰干燥機，脫水烘干；(3)培養(yǎng)物粗粉碎將烘干的培養(yǎng)物進行粗粉碎，使孢子從培養(yǎng)物上脫落；(4)孢子分離開啟旋風(fēng)收集器，將孢子與培養(yǎng)物分離，使孢子從管道中進入收集室；(5)孢子收集孢子從管道中進入收集室，在收集室頂端通過微風(fēng)裝置將孢子吹至收集室底部收集袋，獲得蟬擬青霉孢子粉。4、培養(yǎng)產(chǎn)物的成分分析試驗1)多糖含量測定精確稱取實施例1中制得的蟬擬青霉孢子粉0.5g，加入IOmL蒸餾水，超聲萃取 lOmin，然后放入90°C水浴鍋，熱水浸提2h，4000r/min離心lOmin，獲得上清液。重復(fù)上述步驟一次，合并上清液，用紫外可見分光光度法在490nm的波長處測定吸光度首先將樣液稀釋12. 5倍；然后用加樣搶精確吸取ImL稀釋后樣液，加入ImL蒸餾水，再加入5%苯酚溶液，搖勻；再加入5mL 98%濃硫酸，搖勻并冷卻至室溫后采用紫外可見分光光度計檢測，波長為490nm。其中，所述多糖含量測定計算公式為多糖含量=a - C - V/W ；上述公式中，a 稀釋倍數(shù)，C 由回歸方程計算得到的浸提液中糖濃度(mg ·πι 。)， V 體積(mL) ；W 為樣品的重量(mg)。結(jié)果見表1。2)總?cè)坪繙y定稱0. 05g供試品于25mL容量瓶，超聲20min，用無水乙醇定容到刻度。供試品溶液中取0. 4mL，沸水浴揮去無水乙醇，冷卻，加入5%香草醛冰乙酸溶液0. 2mL，高氯酸0. 8mL, 將容量瓶放人60°C水浴中加熱15min，冷卻至室溫，用冰醋酸定容到刻度，搖勻。在548nm 波長處測定吸光度值。以熊果酸作為對照品溶液。結(jié)果見表1。3)腺苷含量測定A.溶液的制備對照品溶液稱取腺苷對照品適量，精密稱定，加90%甲醇溶解制成含量為 16. 04μ g/mL的腺苷對照品溶液，搖勻，即得。
供試品溶液稱取蟬擬青霉孢子粉0. 5g，精密稱定，置于帶塞錐形瓶中，加入90% 甲醇10mL，閉塞，搖勻，稱定重量，加熱回流30min，冷卻，再稱定重量，用90%甲醇補足減少的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。B.色譜條件Diamonsil Cw 色譜柱 6mmX 250mm，5 μ m)，以磷酸鹽緩沖液(PH6. 5)-甲醇 (17 3)為流動相；流速為lmL/min，檢測波長為260nm，理論塔板數(shù)以腺苷峰計不低于 2000。磷酸鹽緩沖液(PH6. 5)制備取0. Olmol/L磷酸二氫鈉68. 5mL與0. 01mol/L磷酸氫二鈉31. 5mL,混合，調(diào)PH至6. 5。C.測定法按照色譜條件，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ L，注入液相色譜儀，測定，即得。結(jié)果見表1。4)蟲草酸含量測定稱取0. 500g樣品加去離子水10mL，超聲30min，4000r/min離心10分鐘，獲取上清液。兩個循環(huán)，上清液定容到20mL。精密量取待測樣品溶液lmL，加入IOmL刻度試管中， 加ImL高碘酸鉀溶液，混勻，室溫放置IOminJn 2mL 0. 1% L-鼠李糖溶液以除去過多的高碘酸鹽，混合后加4mL新鮮配制的NaS1試劑，53°C水浴加熱15min使其呈色；之后快速冷卻至室溫，用分光光度計以蒸餾水代替待測樣品溶液，用同樣方法操作作為對照，測定其吸光度，其計算公式如下=M = C ^ V/m ；其中，M 蟲草酸含量(mg/g) ；C 蟲草酸濃度(mg/mlL)； V 提取溶液體積(mL) ；m 測試樣品量(g)。結(jié)果見表1。表1孢子和天然蟬花的成分比較
權(quán)利要求
1. 一種生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的固相培養(yǎng)基，所述固相培養(yǎng)基的原料組分包括麩皮20 -45 ]重量份；玉米粉5 30 S量份；蔗糖0. 5 5 ]重量份；蠶蛹粉0. 5 5 ]重量份；KNO30. 1 -^ 31■量份；KH2PO40. 05 1 ；重量份；MgSO40. 05 0.8重量份H2O25 70 I■量份。
2. —種生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的固相培養(yǎng)基，所述固相培養(yǎng)基的原料組分包括麩皮40 70重量份；營養(yǎng)液 30 60重量份；貝殼粉 0.01 2重量份；蠶蛹粉 0. 01 5重量份；其中，所述營養(yǎng)液中含有的組分名稱及其重量百分比為KNO30.1 5% ；蔗糖1 20% ；KH2PO40.05 3% ；MgSO40.01 0. 5%檸檬畫殖0 01 0. 1%H2O 余量。
3.—種生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的液相培養(yǎng)基，所述液相培養(yǎng)基中含有的組分名稱及其重量百分比為馬鈴薯 10 30% ；蔗糖 1 10%;檸檬酸 0. 01 1%;H2O余量。
4.一種蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法采用上述固相培養(yǎng)基，且所述培養(yǎng)方法包括如下步驟1)斜面菌種制備將蟬擬青霉菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，20 25°C下，培養(yǎng)3 5天；2)種子液的制備從斜面上刮取菌絲接種到以PDA液體為基礎(chǔ)的三角瓶液體培養(yǎng)基中，20 25°C下，140 160rpm，培養(yǎng)3 5天即可制得蟬擬青霉種子液；3)將步驟幻中制得的蟬擬青霉種子液按重量百分比為10 15%接入所述液相培養(yǎng)基中，在20 25°C下，140 160rpm，振蕩發(fā)酵3 5天；4)將步驟幻中制得的發(fā)酵液按重量百分比為3% 15%接入滅菌后的所述固相培養(yǎng)基中，在溫度為18 23°C，濕度為50 90%的條件下，靜置開放式培養(yǎng)15 25天。
5.如權(quán)利要求1中所述的生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的固相培養(yǎng)基，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基的制備方法為先將玉米粉和麩皮煮熟，將蔗糖、KN03、KH2PO4, MgSO4在水中溶解， 再與蠶蛹粉按照比例混合均勻。
6.如權(quán)利要求4中所述的蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1)中，所述斜面培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求6中所述的蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述斜面培養(yǎng)基的制備方法為馬鈴薯去皮洗凈并切碎后與水混合，其中，馬鈴薯和水的重量比例為1 (3 7)，滅菌后過濾得到馬鈴薯煮汁，然后在所述馬鈴薯濾液中加入瓊脂2%，蔗糖2%，加熱溶解后加水補足使得體積至原來馬鈴薯濾液體積，然后分裝至試管，在121°C，1. 05kg/cm2滅菌30min后擺斜面，冷卻后使用。
8.如權(quán)利要求4中所述的蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟4)中，所述靜置開放式培養(yǎng)過程中，周圍環(huán)境為萬級潔凈空間，同時通無菌風(fēng)保證培養(yǎng)室內(nèi)空氣交換流通；進一步優(yōu)選的，在靜置開放式培養(yǎng)過程中，還需要在培養(yǎng)基上面覆蓋多層厚度為0. 1 0. 3mm/層，含水量為飽和的無菌吸水紙進行固體發(fā)酵。
9.如權(quán)利要求4中所述的蟬擬青霉孢子的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟4)中，所述靜置開放式培養(yǎng)過程中，周圍環(huán)境為萬級潔凈空間，同時通無菌風(fēng)保證培養(yǎng)室內(nèi)空氣交換流通；進一步優(yōu)選的，在靜置開放式培養(yǎng)過程中，還需要在培養(yǎng)基上面覆蓋多層厚度為0. 1 0. 3mm/層，在所述固相培養(yǎng)基的營養(yǎng)液中浸泡至飽和的無菌吸水紙進行固體發(fā)酵。
10.一種蟬擬青霉的的發(fā)酵產(chǎn)物，所述發(fā)酵產(chǎn)物由蟬擬青霉經(jīng)過權(quán)利要求4-9中所述培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)后制得。
11.權(quán)利要求10中所述的蟬擬青霉的的發(fā)酵產(chǎn)物在功能食品領(lǐng)域、藥物制備領(lǐng)域、日化洗護用品制備領(lǐng)域以及生物防治領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)產(chǎn)物及其應(yīng)用。該生產(chǎn)蟬擬青霉分生孢子的培養(yǎng)基包括固相培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)方法能夠產(chǎn)生大量蟬擬青霉分生孢子，且其培養(yǎng)產(chǎn)物中含有多糖、蟲草酸、腺苷、三萜類、多種氨基酸等成分，具有免疫調(diào)節(jié)、解熱鎮(zhèn)痛、改善腎功能、降血壓、抗輻射、抗腫瘤及降血糖等功能，可以應(yīng)用于人們的健康生活領(lǐng)域，同時發(fā)酵過程能夠產(chǎn)生大量孢子，且培養(yǎng)產(chǎn)生的孢子可以作為生物防治的有效手段，從源頭上解決農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問題。
文檔編號A61P35/00GK102242079SQ20111012200
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者孫長勝, 李成, 趙偉, 陳祝安 申請人:浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司