專利名稱：EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸在制備治療鼻咽癌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于含有兩個或多個單核苷酸單元的化合物領(lǐng)域，特別是涉及具有以核苷基的糖化物基團(tuán)連接的單獨(dú)的磷酸酯基或多磷酸酯基的化合物。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(NPC)是我國南方地區(qū)常見的頭頸部惡性腫瘤，是頭頸部腫瘤中復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率最高的疾病，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達(dá)80%，治愈后5年內(nèi)仍有20 30%患者出現(xiàn)鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是臨床上導(dǎo)致死亡的主要因素之一，傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、放療或化療等對防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移效果不理想，相比較而言，應(yīng)用生物治療方法更適合第二階段的治療，其中基因療法對防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有更重要的臨床意義。EB病毒(Epstein Barr virus, EBV)是一種Y皰疹病毒,幾乎所有的未分化和低分化鼻咽癌都與EB病毒潛伏性感染有關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)EB病毒編碼的miRNA可參與調(diào)控EB病毒編碼的基因和人宿主基因的表達(dá)EBV-miR-BART2能與編碼病毒DNA聚合酶的基因BALF5的3—UTR完全互補(bǔ)。在裂解感染期大量病毒復(fù)制時，miR_BART2表達(dá)水平降低，對 BALF5基因的分解作用減弱，有利于病毒復(fù)制循環(huán)。隨著miR-BART2選擇壓力變化，BALF5 表達(dá)降低，EBV感染細(xì)胞釋放的病毒顆粒不斷減少，感染進(jìn)入潛伏狀態(tài)(Nucleic Acids Res 37 :1035-48,2009) ；EBV-miR-BHRFI-3 與細(xì)胞 IFN 誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞趨化因子 CSX-11/ I-TAC的表達(dá)水平相關(guān)，推測CXCL-11/1-TAC是miR-BHRF1 _3作用靶點(diǎn)，EB病毒可以此作為調(diào)節(jié)方式來干擾宿主的免疫監(jiān)視和免疫清除作用(Cancer Res 68 1436-42，2008)； EBV-miR-BART5能通過抑制宿主的凋亡前蛋白PUMAHl，上調(diào)P53的表達(dá)。如果從EBV感染的細(xì)胞中去除miR-BART5，將促進(jìn)PUMA介導(dǎo)的凋亡作用，提示EBV能夠抑制凋亡的發(fā)生，從而保護(hù)其感染的上皮細(xì)胞(J Exp Med 205 :2551-60,2008，J Biol Chem 285 =33358-70, 2010) ；miR-BART6-5p能抑制EBNA2病毒癌基因的表達(dá)，而這種癌基因的表達(dá)在I型和II型潛伏狀態(tài)(免疫低反應(yīng))向III型潛伏狀態(tài)(免疫高反應(yīng))轉(zhuǎn)化的過程中是不可缺少的， 表明miR-BART6在EBV的感染和潛伏中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用(J Biol Chem 285 =33358-70, 2010)。由此可見，EB病毒miRNA —方面可作用于病毒本身的靶基因，促進(jìn)病毒的感染和潛伏，另一方面也可以作用于宿主的靶基因，促進(jìn)病毒逃避宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，并抑制宿主細(xì)胞的凋亡。然而，有關(guān)EB病毒miR_BART3的作用及機(jī)制的研究卻很少，Lo等(PNAS 104 16164-9，2007)報道 3 種 EB 病毒編碼的 miRNA (miR-BARTl_5p，miR-BART16 和 miR-BART 17-5p)可下調(diào)EB病毒的LMPl基因的表達(dá)。當(dāng)LMPl受到病毒miRNA調(diào)控時，其下游信號途徑會受到抑制，NF-KB表達(dá)降低，凋亡受到抑制，使EB病毒感染的細(xì)胞易向腫瘤發(fā)展(Cell Mol Immunol 4 :185-96,2007) 另有報道 EBV-miR-BARTl 可與 BBLF4 和 LMP2A mRNA 3，端結(jié)合，從而達(dá)到調(diào)節(jié)病毒自身基因表達(dá)的目的(PNAS，1993，90 :378-382)。重要的是，迄今為止，有關(guān)EB病毒miR-BART3與其他EB病毒miRNA促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展尤其是促鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用仍未見任何報道。納米顆粒具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等優(yōu)勢，通過增強(qiáng)滲透和保留作用 (EPR)可有效地靶向腫瘤區(qū)域，近年來研究納米載藥系統(tǒng)應(yīng)用于腫瘤治療成為熱點(diǎn) (Biomacromolecules. 11，3531-3538，2010)。納米顆?？砂?、濃縮、保護(hù)核苷酸，使其免受核酸酶降解；通過表面功能化，可連接特異靶向分子；體內(nèi)循環(huán)時間明顯長于普通大小顆粒，IOOnm以下的納米顆粒能夠逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，從而延長給藥時間，提高給藥效果；合適的納米基因藥物既能夠發(fā)揮陽離子聚合物的體外高效轉(zhuǎn)染的優(yōu)點(diǎn)，也可以有效避免體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過程中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除，提高治療效果，因此將納米技術(shù)應(yīng)用于基因治療具有很好的臨床應(yīng)用前景。粒徑為Inm 150nm的金顆粒(AuNP)為惰性物質(zhì)，無毒，制備方法簡單，成本較低，具有特殊的光學(xué)性質(zhì)以及良好的生物相容性和表面易于功能化等優(yōu)點(diǎn)，可與藥物分子、生物大分子等結(jié)合，廣泛地應(yīng)用于免疫標(biāo)記、生物芯片、生物傳感及藥物輸送系統(tǒng)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(Adv. Drug Deliv. Rev. 60，1307-1315，2008)。近年來以金納米顆粒為載體，表面進(jìn)行適當(dāng)功能化的基團(tuán)修飾，再進(jìn)一步負(fù)載AMO、siRNA等進(jìn)行基因治療獲得了許多可喜的成果。美國西北大學(xué)研究團(tuán)隊，應(yīng)用13nm左右金顆粒穩(wěn)定多股巰基化寡核苷酸，使其進(jìn)細(xì)胞能力大大增強(qiáng)，可綁定到目標(biāo)信使的核酸(mRNAs)使其表達(dá)下調(diào)，并具有抗核酸酶性質(zhì)，轉(zhuǎn)染效率高于未經(jīng)過修飾的寡核苷酸及商品用轉(zhuǎn)染脂質(zhì)載體 Lipofectamine2000 (Science. 312，27-30，2006) ；Klibavov 小組將帶有低分子量 PEI (2KDa)的金納米顆粒作為載體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA進(jìn)猴腎細(xì)胞C0S-7，既增加了 PEI的有效分子量又降低了其細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)染效率較單一的PEI增加了 12倍(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(16) :9138-9143,2003)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸的藥物用途，體現(xiàn)該用途的藥物可以有效地與EB病毒miR-BART3結(jié)合，阻斷miR_BART3的表達(dá)及其對鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控促進(jìn)作用，從而達(dá)到抗鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移和治療鼻咽癌的目的。上述EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸的藥物用途具體是，EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸在制備抗鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，其中所述的反義寡聚核苷酸的序列是 ACACCUG⑶GACUA⑶GGUGCG (SEQ ID NO :1)。本發(fā)明所述的反義寡聚核苷酸采用本領(lǐng)域常規(guī)方法合成，如，先采用核酸合成儀合成，再經(jīng)簡單的單鏈化學(xué)修飾(如，2’-甲氧修飾，變成增強(qiáng)型寡核苷酸)和HPLC純化制得。本發(fā)明人推薦的方法由以下步驟組成1.反義寡核苷酸探針的設(shè)計(1. 1)根據(jù)國際公用的Sanger mirtase數(shù)據(jù)庫中的EB病毒miR_BART3序列，進(jìn)行反義設(shè)計，獲得反義寡核苷酸序列；其中探針設(shè)計的基本原則是，1)探針內(nèi)部的發(fā)夾結(jié)構(gòu)不超過2個；2)經(jīng)BLAST比較與其它序列的相似性小于20%;3)經(jīng)BLAST比較與其它基因序列的重復(fù)連續(xù)不超過3個堿基；(1. 2)采用21-23 nt -甲氧修飾，得到SEQ ID NO 1所示序列；2.反義寡核苷酸探針的合成及純化(2. 1)將SEQ ID NO 1所示的序列輸入3900合成儀自動合成，得到含SEQ ID NO 1所示序列的反義寡核苷酸的合成柱；(2. 2)對合成柱進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，然后，冰凍、干燥、去氨水，溶于9 1的甲酞胺和TBE混合溶液中；(2. 3)上樣于HPLC進(jìn)行純化；(2.4)酒精沉淀、洗滌、真空抽干后得到序列為SEQ ID N0:1的反義寡核苷酸，-20°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)移和侵襲試驗(yàn)(Transwell實(shí)驗(yàn)和Boyden小室實(shí)驗(yàn))分析發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞中呈高度表達(dá)的EB病毒miR-BART3能明顯促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。將 EB病毒編碼的miR-BART3轉(zhuǎn)染進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞株CNEl后，與沒有轉(zhuǎn)染EB病毒miR_BART3的 CNEl細(xì)胞株相比較，細(xì)胞穿透濾膜和基質(zhì)膜的數(shù)量顯著增多，表明該miRNA調(diào)控促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本發(fā)明人將EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸作用鼻咽癌細(xì)胞后，EB病毒 miR-BART3表達(dá)水平發(fā)生顯著性差異變化(ffelch/F = 104. 400，P = O. 000, 24h和48h干擾抑制效率均可達(dá)到80%以上(表明其反義抑制作用至少能維持兩天)，表明經(jīng)EB病毒 miR-BART3反義寡聚核苷酸作用的鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力出現(xiàn)明顯降低，穿過透濾膜和基質(zhì)膜的數(shù)量明顯減少。本發(fā)明所述的治療鼻咽癌的藥物由EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸和藥學(xué)上可以接受的賦形劑組成。為了提高藥效，最好是先將EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸吸附在納米球上， 然后再加入適當(dāng)?shù)馁x形劑制成所需要的劑型。本發(fā)明所述的納米球的粒徑為30nm 50nm，該納米球由含巰基的納米金、分子量為Ida的聚乙烯亞胺、反義寡核苷酸與聚乙二醇單甲醚和支鏈型聚乙烯亞胺的共聚物組成；所述的納米球可以由以下方法制備得到(a)將含巰基的納米金和質(zhì)量為含巰基的納米金10倍的分子量為Ida的聚乙烯亞胺加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到聚乙烯亞胺包裹納米(b)將步驟(a)制備的聚乙烯亞胺包裹納米金和質(zhì)量為含巰基的納米金80倍的序列為SEQ ID NO :1的反義寡聚核苷酸加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到負(fù)載反義寡核苷酸納米金；(c)將步驟(b)制備的負(fù)載反義寡核苷酸納米金、質(zhì)量為含巰基的納米金6倍的聚乙二醇單甲醚和支鏈型聚乙烯亞胺的共聚物加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到納米球其中，聚乙二醇單甲醚的分子量為觀叔，支鏈型聚乙烯亞胺的分子量為25Kda，且聚乙二醇單甲醚與支鏈型聚乙烯亞胺的物質(zhì)的量之比為1 1.5。上述納米球的制備方法中，所述的共聚物的制備方法可參照文獻(xiàn)的報導(dǎo)(如 Macromolecules,35，6867-6874，2002)。上述納米球的制備方法中，所述的含巰基的納米金的粒徑為15 20nm。其中， 所述的含巰基的納米金可以依據(jù)本領(lǐng)域常用的方法制備，具體步驟可以參照文獻(xiàn)的報導(dǎo) (如ACS Nano, 4 (9) :5505-5511，2010)。本發(fā)明所述的反義寡核苷酸可阻斷EB病毒編碼的miRNA的復(fù)制、生存和表達(dá)，其堿基序列與反向互補(bǔ)的序列結(jié)合，具有比抗體更高的專一性，使鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移受到有效抑制，且miRNA無免疫原性，有利于更好地防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。更進(jìn)一步地，本發(fā)明將所述的反義寡核苷酸制備成納米基因藥物，以保護(hù)反義寡核苷酸免受核酸酶降解，延長作用時間，比商品用脂質(zhì)體有更高的轉(zhuǎn)染效率，有利于進(jìn)一步的臨床實(shí)際開發(fā)和應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明所述的EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的直方圖，圖中Control為未加反義寡核苷酸的鼻咽癌細(xì)胞株Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果， BART3-AM0是反義寡核苷酸作用后的鼻咽癌細(xì)胞株Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2是本發(fā)明所述的EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)直方圖，圖中Control為未加反義寡核苷酸的鼻咽癌細(xì)胞株Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果， BART3-AM0是反義寡核苷酸作用后的鼻咽癌細(xì)胞株Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、含有EB病毒miR-BART3的鼻咽癌細(xì)胞株CNEl的制備；細(xì)胞CNEl細(xì)胞株購自湖南中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。過表達(dá)miR-BART3的CNEl細(xì)胞制備化學(xué)合成EB病毒miR_BART3前體分子序列 (282bp)，連接到含GFP表達(dá)的慢病毒載體pMAGic 4. O中，經(jīng)pNL_EGFP/CMV/WPREDU3載體質(zhì)粒、pCD/NL-BH*DDD包裝質(zhì)粒和pLTR-G質(zhì)粒，在細(xì)胞中的包裝，產(chǎn)生能表達(dá)EB病毒 miR-BART7的慢病毒載體pMAGic_EB病毒miR_BART3。用此慢病毒載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株 CNE1，經(jīng)流式分篩，定量PCR證實(shí)，獲得EB病毒miR_BART3穩(wěn)定高表達(dá)的CNEl (含GFP表達(dá))。具體步驟可以參照文獻(xiàn)(南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2011 ；31 (3) :419)。寡核苷酸EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸的序列為SEQ ID NO :1，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。另外，對于EB病毒編碼的miR_BART3及其反義寡核苷酸的生物活性實(shí)驗(yàn)，均用商品化脂質(zhì)體LipofectamindOOO為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。EB病毒miR-BART3反義寡核苷酸抑制EB病毒miR_BART3活性的測定方法(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染取單層過表達(dá)miR_BART3的鼻咽癌細(xì)胞株，以不含抗生素的10% 小牛血清完全培養(yǎng)基(PBR1640或DMEM)培養(yǎng)接種于6孔板，37°C，5 %的CO2孵育過夜，次日，每孔用無血清培基稀釋lipofectamine 2000，室溫孵育5min，同時用無血清培基稀釋 EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸，混合稀釋的lipofectamine 2000和稀釋的EB病毒 miR-BART3反義寡聚核苷酸，室溫下放置20min，6孔板細(xì)胞移去培基后，沖洗2次，加入2mL 無血清培基后，將混合液加入每孔中輕輕混勻，37 °C，5%的C02培養(yǎng)箱孵育他后，更換含有 10 %小牛血清全培養(yǎng)基，應(yīng)用熒光定量PCR檢測不同時間的轉(zhuǎn)染水平。(2)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染水平所有用于RNA制備的器皿均經(jīng)去RNase處理，所需液體均用滅活的DEPC水配制。細(xì)胞總RNA的抽提按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行。取對數(shù)生長期的鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)至細(xì)胞待測密度，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入ImL TRIzoUKi靜置5min后裂解液轉(zhuǎn)移至1. 5mL EP管，加入氯仿0. 2mL,劇烈振搖15sec，室溫放置5分鐘后12000rpm 4oC離心15min，吸出上層水相，下層轉(zhuǎn)移至另一 1. 5ml EP管，按等比例加入異丙醇，混勻后室溫靜置5min，離心30min，75%乙醇洗滌沉淀，離心10分鐘，下層在超凈臺中自然干燥5-lOmin，待酒精揮發(fā)后用適量DEPC水溶解，-80°C保存?zhèn)溆?。RNA標(biāo)本稀釋后測定A260和A280，計算RNA濃度和純度，在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳檢測RNA有無降解。檢測完好的RNA用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照TIANkript cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。應(yīng)用熒光定量PCR檢測不同時間的轉(zhuǎn)染水平。2、EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸抗鼻咽癌細(xì)胞侵襲的實(shí)驗(yàn)；用matrigel在Transwell上室制備人工基底膜，轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞用無血清培基稀釋成密度為ι χ 106/ml的細(xì)胞懸液，100 μ L細(xì)胞懸液加入Transwell上室，下室加600 μ L 條件培養(yǎng)液，370C 5%,CO2培養(yǎng)箱孵育3 后，取出Transwell小室，吸棄液體，用棉簽擦凈基底膜膠，PBS漂洗后甲醛固定30min，蘇木精染色。鏡下計數(shù)(平均計數(shù)4個視野)，以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。結(jié)果如圖1所示。圖1表明，與帶有EB病毒-miR-BARTl-5p的鼻咽癌細(xì)胞株相比較，經(jīng)EB病毒miR-BART3的反義寡核苷酸作用后的細(xì)胞，細(xì)胞穿透濾膜數(shù)量減少，具有顯著差異(P < 0. 0000)，說明EB病毒miR-BART3的反義寡核苷酸抑制了鼻咽癌細(xì)胞的遷移。3、EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸抑制鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)。與Transwel 1侵襲實(shí)驗(yàn)相同，只是Transwel 1上室不需用人工基底膜覆蓋，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立反復(fù)3次。結(jié)果如圖2所示。圖2表明，與帶有EB病毒miR-BART3的鼻咽癌細(xì)胞株比較， 經(jīng)EB病毒miR-BART3的反義寡核苷酸作用后的細(xì)胞，細(xì)胞穿透基質(zhì)膜數(shù)量減少，具有顯著差異(P < 0. 0000)，說明EB病毒miR-BART3的反義寡核苷酸抑制了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲。從圖1和圖2可以知道EB病毒miR_BART3反義寡聚核苷酸抑制了鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲，具有治療鼻咽癌效果。實(shí)施例21.納米球的制備1. 1制備聚乙烯亞胺包裹納米金將含巰基的納米金加入濃度為ImM的NaCl溶液，調(diào)整納米金濃度為0. lmg/mL ；向反應(yīng)液中加入聚乙烯亞胺(PEI，Mw = 2k)至聚乙烯亞胺濃度為1. Omg/mL，常溫反應(yīng)30分鐘，用157500xg離心10分鐘，重復(fù)2次，制備得到聚乙烯亞胺包裹金納米；將聚乙烯亞胺包裹納米金重懸于濃度為IOmM的NaCl溶液，得到0. lmg/mL聚乙烯亞胺包裹納米金NaCl溶液，待用；其中含巰基的納米金可以依據(jù)以下方法制備得到取IOOmL氯金酸水溶液(0. 01 ，加熱至沸，攪拌下準(zhǔn)確加入1 %檸檬酸三鈉水溶液2mL，金黃色的氯金酸水溶液在5分鐘內(nèi)變?yōu)槌燃t色，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后，用220nm 的濾膜除去大粒子，用蒸餾水恢復(fù)到原體積；取新制備的金溶膠溶液用IN的NaOH溶液調(diào)整PH值為11，加入11-巰基十一烷酸至終濃度為0. lmg/mL，常溫攪拌過夜，用離心轉(zhuǎn)速 157500xg離心10分鐘，重復(fù)2次，得到含巰基納米金。經(jīng)TEM檢測含巰基的納米金粒徑為 15 20nmo1.2.制備負(fù)載反義寡核苷酸的納米金
取0. lmg/mL聚乙烯亞胺包裹納米金NaCl溶液5. 5mL，加入序列為SEQ ID NO 1的 EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸4. Omg,常溫下攪拌30分鐘，用157500xg離心10分鐘， 重復(fù)2次，得到負(fù)載反義寡核苷酸金納米。將負(fù)載反義寡核苷酸納米金重懸于濃度為IOmM 的NaCl溶液，得到0. lmg/mL負(fù)載反義寡核苷酸納米金NaCl溶液，待用；1. 3.制備納米球取0. lmg/mL負(fù)載反義寡核苷酸納米金NaCl溶液10mL，加入分子量為Ida的聚乙二醇單甲醚3. 3mg和分子量為2漲叔的支鏈型聚乙烯亞胺62. 6mg，常溫反應(yīng)30分鐘，用 157500xg離心10分鐘，重復(fù)2次，得到納米球。將納米球加入濃度為IOmM的NaCl溶液，密封保存。2.納米球性能檢測應(yīng)用紫外光分光光度計測定納米球在51911111和^Onm處的顯示吸收峰。其中， 519nm處吸收峰是納米金的特征吸收峰；260nm處吸收峰是核酸特征吸收峰。利用透射電鏡(TEM)觀察負(fù)載藥物納米球，粒徑為30 50nm。3.抑制鼻咽癌細(xì)胞中EB病毒-miR_BART3效果序列SEQ ID NO 1的反義寡核苷酸及負(fù)載該反義寡核苷酸納米球抑制鼻咽癌細(xì)胞 CNEl中EB病毒-miR-BART3的表達(dá)及有效作用時間3. 1納米球抑制鼻咽癌細(xì)胞中EB病毒miR_BART3實(shí)驗(yàn)取單層過表達(dá)miR_BART3的鼻咽癌CNEl細(xì)胞株，以不含抗生素的10%小牛血清 PBR1640培養(yǎng)基培養(yǎng)接種于6孔板，37°C，5 %的C02孵育過夜，次日，6孔板細(xì)胞移去培基后，沖洗2次，每孔加入2mL用無血清培基稀釋載有反義寡核苷酸納米球(含有反義寡核苷酸5nmol)，輕輕混勻，37°C，5 %的C02培養(yǎng)箱孵育Mi后，更換含有10 %小牛血清全培養(yǎng)基。 同時，將Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染EB病毒miR_BART3反義寡核苷酸作為對照樣，未轉(zhuǎn)染EB 病毒miR-BART3反義寡核苷酸的細(xì)胞作為空白樣，進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，分別收集轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后24h和4 時的細(xì)胞。3. 2.應(yīng)用熒光定量PCR檢測對EB病毒miR_BART3的抑制效果和有效作用時間3. 2. 1對收集的細(xì)胞分別進(jìn)行總RNA抽提取對數(shù)生長期的鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)至細(xì)胞待測密度，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入lmLTRIzol，冰上靜置5min后裂解液轉(zhuǎn)移至1. 5mL EP管，加入氯仿0. 2mL,劇烈振搖 15sec，室溫放置5分鐘后12000rpm 4°C下離心15min，吸出上層水相，下層轉(zhuǎn)移至另一 1. 5ml EP管，加入等比例異丙醇，混勻后室溫靜置5min，離心30min，75%乙醇洗滌沉淀，離心10分鐘，下層在超凈臺中自然干燥5 lOmin，待乙醇揮發(fā)后用DEPC水溶解得到總抽提 RNA, -80°C保存?zhèn)溆??？偝樘酭NA標(biāo)本稀釋后測定A260和A280，計算RNA濃度和純度，在 1 %的瓊脂糖凝膠中電泳檢測總抽提RNA有無降解。3. 2. 2.熒光定量PCR檢測冊病毒miR_BART3的表達(dá)3.2.2. 1.依照 TaqMan MiRNA Reverse Transcription Kit 說明書，對總抽提 RNA 標(biāo)本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA(a)在 DEPC 水處理過的 EP 管中先加入 10XRT buffer 1. 5μ 1, dNTP 0·15μ1、 RNaseInhibitor 0· 19 μ 1、RT enzyme 1 μ 1 ；再力口入 3 μ 1 特異性 RT primer、5 μ 1 總抽提 RNA標(biāo)本，輕輕混勻。
權(quán)利要求
1.EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸在制備治療鼻咽癌的藥物中的應(yīng)用，其中所述的反義寡聚核苷酸的序列是ACACCUG⑶GACUA⑶GGUGCG (SEQ ID NO :1)。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是先將所述反義寡聚核苷酸負(fù)載到納米金上制成納米球，再加入藥學(xué)上可以接受的輔料制成。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的納米球的粒徑為30nm 50nm，該納米球由含巰基的納米金、分子量為^ida的聚乙烯亞胺、反義寡核苷酸與聚乙二醇單甲醚和支鏈型聚乙烯亞胺的共聚物組成；所述的納米球可以由以下方法制備得到(a)將含巰基的納米金和質(zhì)量為含巰基的納米金10倍的分子量為Ida的聚乙烯亞胺加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到聚乙烯亞胺包裹納米金；(b)將步驟(a)制備的聚乙烯亞胺包裹納米金和質(zhì)量為含巰基的納米金80倍的序列為 SEQ ID NO :1的反義寡聚核苷酸加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到負(fù)載反義寡核苷酸納米金；(c)將步驟(b)制備的負(fù)載反義寡核苷酸納米金、質(zhì)量為含巰基的納米金6倍的聚乙二醇單甲醚和支鏈型聚乙烯亞胺的共聚物加入ImM NaCl溶液中，常溫下反應(yīng)30分鐘，離心純化分離得到納米球；其中，聚乙二醇單甲醚的分子量為觀叔，支鏈型聚乙烯亞胺的分子量為25Kda，且聚乙二醇單甲醚與支鏈型聚乙烯亞胺的物質(zhì)的量之比為1 1.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸的藥物用途，具體涉及EB病毒miR-BART3反義寡聚核苷酸在制備治療鼻咽癌的藥物中的應(yīng)用，其中所述的反義寡聚核苷酸的序列是ACACCUGGUGACUAGUGGUGCG(SEQ ID NO1)。本發(fā)明所述的反義寡聚核苷酸可以有效地與EB病毒成熟miRNA結(jié)合，阻斷miRNA的表達(dá)及其相應(yīng)的調(diào)控作用，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，且miRNA無免疫原性，有利于進(jìn)一步應(yīng)用于防治鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。體現(xiàn)本發(fā)明所述用途的藥物，可保護(hù)反義寡核苷酸免受核酸酶降解，延長作用時間，比商品用脂質(zhì)體有更高的轉(zhuǎn)染效率，有利于進(jìn)一步的臨床實(shí)際開發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK102188719SQ201110122249
公開日2011年9月21日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者葉艷芬, 李欣, 王鶯, 蔡紅兵 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)