專利名稱：Toll樣受體5激動劑stFla抗肺纖維化的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)Toll樣受體5激動劑stFla在治療肺纖維化中的新用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織異常重構(gòu)是導(dǎo)致器官功能衰竭的主要原因，而纖維化作為組織重構(gòu)的重要病理表現(xiàn)之一，是當(dāng)今臨床許多疾病致殘、致死的主要原因，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命。肺纖維化(Pulmonary fibrosis)是多種肺間質(zhì)性炎癥疾病的主要病理改變,包括哮喘、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、肺癌、間質(zhì)性肺病等，其典型特征為過度纖維化組織替代功能性肺組織，導(dǎo)致肺功能受損。近年來肺纖維化發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢。例如特發(fā)性肺纖維化臨床診斷明確后平均生存時間僅為3到5年。肺纖維化的確切發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。但已有的研究結(jié)果表明，肺泡持續(xù)性損傷、細(xì)胞外基質(zhì)反復(fù)破壞-修復(fù)、持續(xù)的炎癥反應(yīng)都是該疾病的重要影響因素。遺憾的是，對于肺纖維化這類預(yù)后差、致殘率及·死亡率高的慢性復(fù)雜疾病，至今還沒有真正有效的藥物問世。除2008年吡非尼酮在日本獲準(zhǔn)用于治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(對該藥的效果美國FDA仍有質(zhì)疑)外，還沒有其它有效的藥物和治療方法。因此，深入研究肺纖維化的發(fā)生機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)新藥靶、開發(fā)新藥物迫在眉睫。博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型是迄今為止應(yīng)用最廣泛，與人類肺纖維化發(fā)生發(fā)展最為相似的動物模型。小鼠肺纖維化的誘導(dǎo)因素包括高濃度氧、石棉、二氧化硅、放射線等，但只有博萊霉素導(dǎo)致的肺部病變具有典型的間質(zhì)性肺纖維化病理特征早期為彌漫性肺泡炎，肺泡上皮損傷，肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂，隨后大量間質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性聚集以致取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響肺部功能。因此，使用博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型具備廣泛的代表意義。模式識別受體家族成員Toll樣受體(Toll-Like Receptors, TLRs)是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，并且TLRs的活化信號影響著獲得性免疫應(yīng)答的方向。雖然目前未見TLRs與肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的直接證據(jù)，但大量的研究報(bào)道TLRs與多種纖維化疾病有密切聯(lián)系，例如本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，無論是敲除TLR2還是治療性給予中和性TLR2抗體均可顯著抑制肺臟抑制性免疫微環(huán)境的形成，降低博來霉素所致肺損傷、纖維化和動物死亡；治療性給予TLR4激動劑可改善博來霉素或二氧化硅所致小鼠肺纖維化；預(yù)防性或治療性給予TLR9激動劑能夠顯著改善單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的小鼠腎纖維化病變。TLR5是Toll樣受體家族的一員，表達(dá)于細(xì)胞表面，鞭毛蛋白是目前鑒定到的唯一的TLR5特異性配基。TLR5能夠迅速識別鼠傷寒沙門菌、李斯特菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌表面的鞭毛蛋白而激活先天免疫應(yīng)答。Gewirtz等首先發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予鞭毛蛋白能夠明顯提高小鼠對口服化學(xué)制劑、細(xì)菌、輪狀病毒以及輻射的抵抗力。stFla是來源于
S.thyphimurium(鼠傷寒沙門菌)細(xì)胞壁鞭毛蛋白單體。與TLR4激動劑LPS不同，TLR5特異性配基stFla能夠激發(fā)溫和的先天免疫反應(yīng)，在小鼠腫瘤模型上證實(shí)具有較強(qiáng)的腫瘤抑制活性。

發(fā)明內(nèi)容
針對肺纖維化危害嚴(yán)重及缺少臨床有效藥物和治療方法的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種新的技術(shù)方案，即利用Toll樣受體5激動劑用于治療肺纖維化。優(yōu)選Toll樣受體5激動劑選自stFla。本發(fā)明通過系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)對于C57BL/6小鼠經(jīng)氣管內(nèi)注射博萊霉素(5U/Kg)造成肺纖維化模型,在造模后14天開始,腹腔注射stFla(5ug/ 3day)至第35天。通過病理組織學(xué)及生化檢測等方法分別分析和評價博萊霉素灌注小鼠肺部炎癥、損傷和纖維化的改變，發(fā)現(xiàn)激活TLR5信號通路能顯著降低博萊霉素灌注小鼠的死亡率；激活TLR5信號通路顯著降低博萊霉素誘導(dǎo)的肺部炎癥和損傷，減小博萊霉素所致肺纖維化，包括降低肺部膠原沉積、輕脯氨酸含量和a -SMA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TLR5激動劑stFla能抑制博萊霉素所致肺纖維化，改善肺纖維化小鼠的肺部炎癥，大大降低其死亡率。術(shù)語及簡稱BLM博萊霉素TLR5Toll 樣受體 5a -SMAa平滑肌肌動蛋白


Sham:假手術(shù)組BLM:模型組stFla TLR5 激動劑 stFla 治療組圖I.治療性給予TLR5激動劑stFla顯著改善BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠生存率。圖2. stFla顯著減輕BLM所致肺部炎癥。A，肺HE染色；B，肺部炎癥評分。圖3. stFla顯著改善BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺臟臟器指數(shù)圖4.治療性給予TLR5激動劑stFla顯著降低BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺部膠原沉積。A,肺Masson染色；B,膠原沉積統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖5.治療性給予TLR5激動劑stFla顯著降低BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織中羥
脯氨酸的含量。圖6.治療性給予TLR5激動劑stFla顯著降低BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺部a -SMA蛋白的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合實(shí)施例對發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I材料和方法
實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑SPF級C57BL/6小鼠(雄性，6 8周，16_18g)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK (京)2008-0003。所有動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，恒溫恒濕，自由飲食。所有動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物管理協(xié)會批準(zhǔn)進(jìn)行。博萊霉素(Bleomycin, BLM)購自日本化藥株式會社；stFla購自Invivogen公司；羥脯氨酸測定試劑盒購自江蘇南京建成生物有限公司；a -SMA抗體購自Boster公司；Western Blot 實(shí)驗(yàn)中所使用的 ECL pluswestern blotting detection reagents 購自Amersham Bioscienceslnc. (Piscataway, NJ)。蘇木素染色液，伊紅試劑以及 Masson 三色染色試劑盒均購自福州邁新生物科技開發(fā)有限公司。肺纖維化動物模型(BLM致肺纖維化動物模型)雄性C57BL/6J(6-8周齡，18g)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥鈉(45mg/kg, i. p.)麻 醉。氣管內(nèi)注射BLM(5U/kg)，具體方案如下以盡量小的創(chuàng)傷切開頸部皮膚，在彎頭眼科鑷的協(xié)助下，暴露氣管，使用微量進(jìn)樣器穿刺氣管，向氣管內(nèi)注入約50ul適量BLM，迅速地旋轉(zhuǎn)并直立5分鐘，以便使BLM均勻地進(jìn)入左右肺葉。假手術(shù)組氣管內(nèi)注射等體積的生理鹽水。造模后每日記錄體重及動物的死亡情況，至第35天結(jié)束實(shí)驗(yàn)。肺纖維化動物實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)共分為3組，每組20只小鼠，即假手術(shù)組(Sham)、模型組(BLM)及stFla治療組(stFla)。BLM造模后第14天開始腹腔注射stFla (5ug/kg/3day)至BLM造模后第35天。假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。肺臟臟器系數(shù)測定肺指數(shù)能夠反映肺部炎癥及纖維化程度。于氣管注射BLM造模35天后，隔夜禁食，稱重，麻醉處死小鼠，稱取肺臟重量并計(jì)算臟器系數(shù)(mg/g)。公式肺指數(shù)(mg/g)=肺重(mg) / 體重(g)。病理切片和結(jié)果分析取動物右側(cè)下葉肺組織，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，并在最大橫截面積切片。分別通過蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色觀察炎癥和纖維化狀況。應(yīng)用Spot Advanced3.0獲得高清晰的病理圖片(200倍)，HE染色觀察病理基本改變，并進(jìn)行炎癥評分。使用Image-Pro Plus 5. I分析Masson染色后膠原的著色面積和肺組織面積。使用Image-ProPlus5. I測量出每個視野Masson染色后的膠原著色面積、視野下肺組織面積，以著色面積與視野肺組織面積比表示該組織膠原的相對含量。實(shí)驗(yàn)中每組分析10個標(biāo)本，每個標(biāo)本隨機(jī)取10個視野，取均值代表一個動物膠原組織在肺組織內(nèi)的相對含量和表達(dá)強(qiáng)度。通過非參數(shù)方差分析比較各組膠原面積。羥脯氨酸測定羥脯氨酸是膠原蛋白的特異性組成部分，在正常組織中含量極低。BLM所致肺纖維化實(shí)驗(yàn)中，檢測動物左肺最大肺葉羥脯氨酸的含量，評價肺纖維化的情況。方法參照南京建成生物工程技術(shù)有限公司堿水解法測定組織羥脯氨酸含量試劑盒說明書。Western Blot 檢測 a -SMA 的表達(dá)取凍存的小鼠肺臟組織，加入蛋白裂解緩沖液(含25mmol/L三羥甲基氨基甲烷pH = 7. 6, 5 % (v/v)甘油，150mmol/L 氯化鈉,2. 5mmol/L 氯化鎂，lmmol/L 乙二胺四乙酸，
0.5% NP-40, 5mmol/L P -巰基乙醇，50mmol/L 氟化鈉，lmmol/L I凡酸鈉，lmmol/L 二硫蘇糖醇，lmmol/L苯甲基磺酰氟化物，I u g/mL蛋白酶抑制劑亮肽素，抑胃肽以及抑肽酶)。勻漿后，冰上放置15分鐘；4°C，12000g離心5分鐘，得到的上清為胞漿蛋白。Bradford法定蛋白，調(diào)蛋白濃度一致后，加上樣緩沖液煮沸，經(jīng)12 %十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后將蛋白條帶轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉后，依次加入抗小鼠ct _SMA抗體,辣根酶標(biāo)記馬抗小鼠二抗,使用Amersham Biosciences ECL顯色系統(tǒng)顯色，經(jīng)Gel-pix)3. I軟件測出各條帶的光密度值，用于統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用X土SE，經(jīng)參數(shù)或者非參數(shù)方差檢驗(yàn)， 經(jīng)比較P < 0. 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P <0.01有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病理學(xué)分級資料的統(tǒng)計(jì)使用卡方檢驗(yàn)，經(jīng)比較？ < 0. 05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P <0.01認(rèn)為有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果治療性給予TLR5激動劑stFla顯著減少BLM所致動物死亡在所有肺纖維化動物模型中，BLM所致肺纖維化的發(fā)病機(jī)制與人類間質(zhì)性肺纖維化最為接近。因此，我們選擇BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型。氣管注射BLM可造成動物急性肺損傷甚至引起死亡，隨著急性炎癥的消退逐漸形成明顯的肺纖維化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，比較氣管注射BLM后35天內(nèi)各組小鼠的生存率，造模35天后，sham組動物全部存活，BLM可引起35%動物死亡，TLR5激動劑stFla治療組只有5%動物死亡，顯著減少BLM所致肺纖維化小鼠死亡率(圖I)。治療性給予TLR5激動劑stFla顯著減輕BLM致肺部炎癥研究發(fā)現(xiàn)，引起肺間質(zhì)性疾病的原因高達(dá)150種以上，包括感染、毒物、藥物、自身免疫性疾病、嚴(yán)重創(chuàng)傷和輻射等，但是不同原因引起的肺間質(zhì)性疾病都以肺組織炎癥和組織纖維增生為共同病理特征。HE染色結(jié)果顯示，BLM能夠?qū)е滦∈蠓闻菘v隔增厚、正常肺組織結(jié)構(gòu)破壞、大量炎性細(xì)胞在肺組織內(nèi)浸潤。而TLR5激動劑stFla能夠維持肺組織正常結(jié)構(gòu)形態(tài)，顯著降低其炎癥程度(圖2)。由于在肺間質(zhì)性病變過程中.早期是肺泡炎.大量炎性細(xì)胞浸潤。后期是肺纖維化.大量間質(zhì)細(xì)胞增生及膠原蛋白的沉積等.使模型動物的肺臟重量增加。于氣管注射BLM造模35天后，相比于sham組，BLM顯著升高小鼠肺指數(shù)，而給予TLR5激動劑stFla則顯著抑制肺指數(shù)的增長(圖3)。治療性給予TLR5激動劑stFla顯著降低BLM致肺部膠原沉積臨床上多發(fā)的各種器官纖維化的主要病理特征在于膠原纖維的過度增生和降解嚴(yán)重不足，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，影響甚至代替正常器官的功能。BLM所致小鼠肺纖維化的典型病理改變便是肺組織內(nèi)出現(xiàn)大面積膠原沉積，對膠原沉積的影響是評價藥效的重要指標(biāo)。Masson染色結(jié)果顯示，正常肺組織中僅表達(dá)少量的膠原，而BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺部膠原大量沉積，給予TLR5激動劑stFla則能夠顯著抑制這一趨勢(圖3)。治療性給予TLR5激動劑stFla顯著降低BLM所致肺纖維化組織中羥脯氨酸的含量羥脯氨酸在膠原蛋白中占13. 4%，在彈性蛋白中占極少量，其他蛋白中均不存在，是膠原蛋白的特異性組成部分。因此，羥脯氨酸的含量能反映結(jié)締組織疾病中膠原的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺部羥脯氨酸表達(dá)明顯增加，而TLR5激動劑stFla顯著降低BLM所致的肺組織羥脯氨酸含量升高(圖4)。治療性給予TLR5激動劑stFla顯著降低BLM致肺部a -SMA的蛋白表達(dá)正常肺組織中a -SMA僅在較大血管、支氣管壁的平滑肌細(xì)胞胞漿中表達(dá)。纖維化病變時，肺上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，同時表達(dá)a-SMA，因此a-SMA成為成纖維細(xì)胞分化的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BLM所致肺纖維化小鼠肺部a-SMA蛋白的表達(dá)明顯增加，治療性給予TLR5激動劑stFla顯著抑制a -SMA的表達(dá)(圖5)。結(jié)論本發(fā)明采用TLR5激動劑stFla激活TLR5信號傳導(dǎo)通路，可顯著抑制博萊霉素所
致小鼠肺纖維化，改善肺部炎癥，顯著降低肺纖維化小鼠死亡率。
權(quán)利要求
1.抗Toll樣受體5激動劑在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗Toll樣受體5激動劑選自stFla。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗Toll樣受體5激動劑在制備治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選的Toll樣受體5激動劑選自stFla。纖維化是許多慢性疾病致殘和致死的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命。肺纖維化發(fā)病率和致死率呈不斷上升趨勢。本發(fā)明公開了Toll樣受體(TLR)5激動劑，優(yōu)選的Toll樣受體5激動劑選自stFla，能顯著降低博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的死亡率；激活TLR5信號通路，能夠顯著降低博萊霉素導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)，減輕博萊霉素導(dǎo)致的肺組織纖維化程度，包括降低肺部膠原沉積、羥脯氨酸含量及-SMA的表達(dá)。
文檔編號A61K45/00GK102784393SQ20111012842
公開日2012年11月21日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者呂小希, 楊紅振, 王曉星, 胡卓偉, 花芳 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所