專利名稱：奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物疫苗及其制備領(lǐng)域，特別是涉及一種奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎是影響牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量的最重要傳染病。根據(jù)國內(nèi)外研究，奶牛乳房炎的主要病原分傳染性病原和環(huán)境病原兩類。傳染性病原主要包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌；環(huán)境病原主要有大腸埃希氏菌、乳房鏈球菌和其它腸桿菌科的細(xì)菌。 國外研究表明，在奶牛乳房炎病例中金黃色葡萄球菌分離率為15—50%，但在泌乳期由該菌引起的乳房炎治愈率僅為25%，因而該類病原感染所致的乳房炎危害最大；雖然在奶牛乳房炎病例中鏈球菌的分離率達(dá)50%，而由該菌引起的乳房炎治愈率達(dá)70—90%。在發(fā)達(dá)國家，由于先進(jìn)的飼養(yǎng)管理技術(shù)、嚴(yán)格消毒和優(yōu)越衛(wèi)生條件，上述疾病比例明顯下降，由大腸埃希氏菌引起的乳房炎在一些地區(qū)占居優(yōu)勢。我國以及我區(qū)(新疆地區(qū))的初步調(diào)查表明， 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌也是當(dāng)前我區(qū)奶牛乳房炎主要的病原。對(duì)于奶牛乳房炎的防治，國外主要采用早期診斷、圈舍環(huán)境和乳房消毒、免疫預(yù)防以及抗生素預(yù)防和治療。但是，近年來隨著消費(fèi)者安全意識(shí)的增強(qiáng)以及國際貿(mào)易中食品藥物殘留監(jiān)測水平的提高，各國已禁止使用抗生素進(jìn)行奶牛乳房炎預(yù)防，此外，由于長期使用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌抗藥性增強(qiáng)，使奶牛乳房炎的治療成本急劇增加、治療效果不明顯，并且， 由于耐藥菌的出現(xiàn)和擴(kuò)散，也威脅到人類自身的安全與健康。因而研制開發(fā)預(yù)防奶牛乳房炎疫苗，通過免疫預(yù)防進(jìn)行防制已成為該病防治研究的重點(diǎn)。目前，國外在乳房炎疫苗的研究和開發(fā)中已得到一些成功美國Nabi生物醫(yī)藥公司(Nabi Biopharmaceutical)的MaphVAX葡萄球菌莢膜多價(jià)苗、泛普公司 (U. S. PanProbe. Ltd)研制開發(fā)的奶牛乳房炎多聯(lián)疫苗和美國加州大學(xué)研制的針對(duì)大腸桿菌性乳房炎的高利多疫苗(Golicure— J5)。此外，澳大利亞、以色列、德國、阿根廷、加拿大等國也針對(duì)本國奶牛乳房炎中特異的病原，研制開發(fā)出了相應(yīng)的疫苗并進(jìn)入田間試驗(yàn)。以上國家所研制開發(fā)的奶牛乳房炎疫苗技術(shù)路線和方法主要有以下幾種(1)針對(duì)單一病原的單價(jià)或多價(jià)疫苗①金黃色葡萄球菌乳房炎疫苗澳大利亞CSIRO的Watson從本國奶牛乳房炎病例分離出的金黃色葡萄球菌中篩選出了一株具有較好抗原代表性的菌株，并篩選出了擬體內(nèi)營養(yǎng)的培養(yǎng)基，使該菌具有重要免疫原性和致病意義的多糖外莢膜和毒素得到充分的表達(dá)。他分別提取該菌多糖外莢膜和毒素將其加入滅活全細(xì)胞中，選用了合適的佐劑取得了較好的免疫效果(1993)。美國USDA免疫與疫病控制實(shí)驗(yàn)室O'Brien等人分別用本國分離出的金黃色葡萄球菌主要血清型P8、P5、P336型制備了金黃色葡萄球菌多聚糖， 并將其連接到rEPA上，再與多聚微球結(jié)合制備疫苗。用該疫苗免疫牛產(chǎn)生了高效價(jià)LgG2抗體和有效抗金黃色葡萄球菌感染免疫(2000)。以色列農(nóng)業(yè)和農(nóng)村發(fā)展部Kimiron獸醫(yī)研究所的G. Leitner等人從本國患病牛中分出了三株不同生物學(xué)特性和毒力的金黃色葡萄球
5菌，將其分別培養(yǎng)后經(jīng)一定處理，按比例與佐劑結(jié)合制備金黃色葡萄球菌多價(jià)疫苗，用該疫苗免疫保護(hù)率達(dá)70% (2003)；②大腸桿菌乳房炎疫苗美國加州大學(xué)的Hagan等人從奶牛乳房炎患牛中分離出了一株具有不完全0多糖的大腸桿菌變異株，用該菌株裸露的核心抗原制備疫苗在臨床應(yīng)用中可保護(hù)多種血清型大腸桿菌的感染(1992); (2)針對(duì)多病原的多聯(lián)疫苗，由于奶牛乳房炎病原種類多樣，研制和開發(fā)多聯(lián)疫苗具有很大的應(yīng)用潛力，目前國外多聯(lián)疫苗的研制正在進(jìn)行之中。但迄今為止，還未見正式的產(chǎn)品研制成功和臨床應(yīng)用的報(bào)告。(3)表面多糖血清型是金黃色葡萄球菌的一個(gè)重要特征。研究證實(shí)，相同多糖血清型菌株之間可以產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)。金黃色葡萄球菌有11種血清型，奶牛乳房炎中分離的金黃色葡萄球菌的優(yōu)勢血清型為莢膜多糖5型(CP5)、莢膜多糖8型(CP8)和外膜多糖336 型(336PS型)。不同國家和地區(qū)主要流行血清型并不相同。Poutrel (1988年)對(duì)法國分離的212株牛源性金黃色葡萄球菌分型證實(shí)，70%為CP5和CP8 ；美國對(duì)其44%的奶牛場分離的金黃色葡萄球菌分型發(fā)現(xiàn)，CP5占51%，CP8和未能分型的分別占18%和31% ；但這兩個(gè)國家的研究均未進(jìn)行336PS的分型。韓國Hong-Ryul Han等2000年對(duì)本國107株奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌進(jìn)行血清型分型發(fā)現(xiàn)，336型占46. 7%，CP5和CP8均為12. 1%，CP5/336 為17. 8%，CP5/336為6. 5%，未分型的為4. 7%。據(jù)此，0’ Brien等人從美國分離的金黃色葡萄球菌中分別提取CP5、CP8、336PS，將其與綠膿假單胞菌無毒重組外毒素A(rEPA)偶聯(lián)，再與多聚微球結(jié)合制成金黃色葡萄球菌亞單位疫苗免疫奶牛，證實(shí)其可有效抵抗抗金黃色葡萄球菌感染。在國內(nèi)，2006年張捷等對(duì)我國臨床型乳房炎病例中獲取的56株金黃色葡萄球菌進(jìn)行血清型分型發(fā)現(xiàn)336型占67. 9%，5型占7. 1%，8型占3. 6% ；2010年王登峰等對(duì)新疆分離的117株金黃色葡萄球菌分型表明，CP5占10. 36%, CP8占13. 68%，336型占64. 96%，未分型菌株占11. 11%。本發(fā)明涉及的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌、大腸桿菌二聯(lián)多價(jià)滅活疫苗的抗原即包含了我國奶牛乳房炎病例中金黃色葡萄球菌的優(yōu)勢血清型，又含有主要環(huán)境性病原大腸桿菌，可以有效預(yù)防我國由上述病原引起的乳腺感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是
為了解決我國奶牛養(yǎng)殖中奶牛乳房炎免疫預(yù)防的實(shí)際生產(chǎn)問題，根據(jù)我國奶牛乳房炎病原的情況，本發(fā)明提供了一種預(yù)防奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗及其制備方法。1、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是(1)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗，所述疫苗按體積份數(shù)比包括4份抗原，所述抗原包括a，金黃色葡萄球菌金黃色亞種 Staphylococcus aureus subsp. aureusCGMCC NO. 4595、4596、 4597,4598的菌體多糖、蛋白混合物抗原中任意2種或2種以上的組合；b，CGMCC NO. 4595、 4596、4597、4598毒素抗原中任意2種或2種以上的組合；c，大腸埃希氏菌Escherichia coliCGMCC NO. 4594的菌體蛋白抗原；d，CGMCC NO. 4594的毒素抗原；和6份的e，Montanide ISA70M VG免疫油佐劑組成。在于所述4份抗原中，CGMCC N0. 4595、4596、4597、4598菌體多糖、蛋白混合物抗原中任意2種或2種以上的組合含50% ； CGMCC NO. 4594菌體蛋白抗原含12. 5% ；CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598毒素抗原中任意2種或2種以上的組合含12. 5% ；CGMCC NO. 4594 毒素抗原含25%。(2)上述奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法， 具有以下步驟
(1)CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 菌種和 CGMCC NO. 4594 菌種的制備；
(2)CGMCC N0. 4595、4596、4597、4598 的菌體多糖、蛋白抗原和 CGMCC N0. 4594 的菌體蛋白抗原的制備；
(3)CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 的毒素抗原和 CGMCC N0. 4594 的毒素抗原的制
備；
(4)將上述獲得的CGMCCN0. 4595、4596、4597、4598的菌體多糖蛋白抗原中的任意 2種或2種以上的組合與獲得的CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598的毒素抗原中的任意2 種或2種以上的組合與CGMCC N0. 4594的菌體蛋白抗原與CGMCC N0. 4594的毒素抗原與 Montanide ISA70M VG免疫油佐劑按上述體積份數(shù)比混合，制成疫苗。所述CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598菌種中的任意一種都可以按照以下步驟制備
(1)無菌條件下挑取少量菌種，在含有7%綿羊血平板上劃線，將其放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)， 溫度控制在37°C下培養(yǎng)；
(2)從培養(yǎng)的菌種中挑取單個(gè)菌落，接種到改良的哥倫比亞培養(yǎng)基試管中，放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，振搖速度保持170rpm ；
(3)從試管中取培養(yǎng)物接種到改良的哥倫比亞液體培養(yǎng)基三角瓶中，接種量為培養(yǎng)劑量的1%，將其放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱保持37°C，振搖轉(zhuǎn)數(shù)保持170rpm ；
(4)對(duì)培養(yǎng)物鏡檢無雜菌后，放置在4°C冰箱中備用。所述CGMCC N0. 4594菌種按照以下步驟制備
(1)無菌條件下挑取少量菌種，在LB固體培養(yǎng)平板上劃線，將其放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度控制在37°C下培養(yǎng)Mh;
(2)無菌條件下，從培養(yǎng)的菌種中挑取單個(gè)菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基試管中，放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，振搖轉(zhuǎn)數(shù)保持170rpm ；
(3)從試管中取培養(yǎng)物接種到LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，接種量為培養(yǎng)劑量的1%，將其放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱保持37°C，振搖培養(yǎng)箱保持170rpm ；
(4)對(duì)培養(yǎng)物鏡檢無雜菌后，放置在4°C冰箱中備用。所述CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598中任意一種菌體多糖、蛋白抗原都可以按照以下步驟制備
(1)從制備好的菌種中使用涂菌棒將菌液均勻的接種在改良的哥倫比亞固體培養(yǎng)平板上，菌液吸收后放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，培養(yǎng)Mh ；
(2)從培養(yǎng)后的培養(yǎng)平板上刮取菌苔，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為濕重30g/L，用組織細(xì)胞均漿器處理菌懸液，收集菌懸液的上清液；
(3)將獲得的上清液冷卻至4°C，8000X g離心15min，再收集上清液，向上清液中每 1000ml加入25mg的DNase和75mg的RNase，將其放置在溫箱中37°C條件下孵育2h，冷卻至 4°C 再加入 10mMPMSF2ml，IOmM TLCK 和 TPCK 各 4ml ；
(4)隨后將上清液用Braedford方法測定菌體多糖、蛋白抗原濃度，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為15g/L ( 士0. 3g/L),再先后用孔徑為0. Sum和0. 45um的濾膜過濾，置_20°C備用。所述CGMCC NO. 4594菌體蛋白抗原按照以下步驟制備
(1)從制備的菌種中，取培養(yǎng)物按1%的比例接種在裝有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并且LB液體培養(yǎng)基的量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1:1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)16h ；
(2)從培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集菌體沉淀物，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為濕重30g/L ；用組織細(xì)胞均漿器處理菌懸液，收集菌懸液的上清液；
(3)將獲得的上清液冷卻至4°C，8000X g離心15min，再收集上清液，向上清液中每 IOOOml加入25mg的DNase和75mg的RNase，將其放置在溫箱中37°C條件下孵育2h，冷卻至 4°C 再加入 10mMPMSF2ml, IOmM TLCK 和 TPCK 各 4ml ；
(4)隨后將上清液用Braedford方法測定菌體多糖、蛋白抗原濃度，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為15g/L ( 士0. 3g/L),再先后用孔徑為0. Sum和0. 45um的濾膜過濾，置_20°C備用。所述CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598菌毒素抗原中的任意一種都可以按照以下步驟制備
(1)從菌種中，取菌液按1%的比例接種在裝有改良的哥倫比亞液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1:1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)20h ；
(2)將培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集上清液；
(3)向上清液中加入甲醛，使甲醛的最終濃度控制在0.15%，溫度在4°C條件下滅活 48h或者在溫度為25°C條件下滅活Mh，在滅活過程中每天充分?jǐn)嚢?-3次；
(4)滅活液用分子截留量為IOKDa的超濾濃縮膜濃縮20倍，置_20°C備用。所述CGMCC NO. 4594毒素抗原按照以下步驟制備
(1)從制備的菌種中，取菌液按1%的比例接種在裝有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1 1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)24h ；
(2)將培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集上清液；
(3)向上清液中加入甲醛，使甲醛的最終濃度控制在0.15%，溫度在4°C條件下滅活 48h或者在溫度為25°C條件下滅活Mh，在滅活過程中每天充分?jǐn)嚢?-3次；
(4)滅活液用分子截留量為IOKDa的超濾濃縮膜濃縮20倍，置_20°C備用。以上所述改良的哥倫比亞培養(yǎng)基，是由哥倫比亞培養(yǎng)基，添加1.5%的氯化鈉，經(jīng)滅菌后，冷至55-60°C，再加入10%的小牛血清和10%的乳清混勻冷卻后制成。以上所述用于專利程序申請(qǐng)的菌株都已經(jīng)在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行和保藏，并且出具了存活證明。具體如下(1)保藏編號(hào)CGMCC NO. 4594，分類命名大腸埃希氏菌，拉丁文名稱Escherichia coli，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年02元21日；(2)保藏編號(hào)CGMCC NO. 4595，分類命名金黃色葡萄球菌金黃色亞種，拉丁文名稱staphylococcus aureus subsp. aureus，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期 2011年02元21日；(3)保藏編號(hào)CGMCC NO. 4596，分類命名金黃色葡萄球菌金黃色亞種，拉丁文名稱staphylococcus aureus subsp. aureus，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年 02元21日；(4)保藏編號(hào)CGMCC NO. 4597，分類命名金黃色葡萄球菌金黃色亞種，拉丁文名稱staphylococcus aureus subsp. aureus，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年02元21 日；(5)保藏編號(hào)CGMCC NO. 4598，分類命名金黃色葡萄球菌金黃色亞種，拉丁文名稱 Staphylococcus aureus subsp. aureus，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年02元21日。其中， 金黃色葡萄球菌金黃色亞種Maphylococcus aureus subsp. aureusCGMCC Ν0· 4595的材料編號(hào)是XJMPAm0 ；所述的CGMCC N0. 4596，材料編號(hào)是XJMP50 ；所述的CGMCC N0. 4597 材料編號(hào)是XJMP69 ；所述的CGMCC N0. 4598材料編號(hào)是XJMP92。所述的大腸埃希氏菌 Escherichia coliCGMCC NO. 4594 材料編號(hào)XJMEY9。上述中PMSF 苯甲基磺酰氟；TLCK N-甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基化酮；TPCK 甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮；DNase 脫氧核糖核酸酶；RNase:核糖核酸內(nèi)切酶；LB 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；Montanide ISA70M VG免疫油佐劑為法國賽比克公司生產(chǎn)的商品；Braedford方法為通用的蛋白測定方法。本發(fā)明的有益效果
1，疫苗菌株抗原覆蓋面廣，免疫原性好。本發(fā)明采用的菌種是在對(duì)全國不同地方奶牛乳房炎病原調(diào)查的基礎(chǔ)上，篩選出的抗原性好，毒力強(qiáng)的菌株，上述金黃色葡萄球菌攜帶莢膜多糖5型(CP5)、8型(CP8)、外膜多糖336型(336PQ或同時(shí)攜帶上述多糖抗原中的兩種； 這些菌株產(chǎn)生α、β毒素或同時(shí)產(chǎn)生兩種毒素。上述大腸埃希氏菌產(chǎn)ST毒素且具有廣泛抗原代表性。通過對(duì)菌體和毒素的處理，得到疫苗抗原，并通過篩選優(yōu)化疫苗佐劑，制備的二聯(lián)多價(jià)滅活疫苗。2，效果明顯。使用本發(fā)明疫苗大大降低了奶牛由于感染金黃色葡萄球菌或大腸埃希氏菌而發(fā)生臨床型乳房炎的風(fēng)險(xiǎn)。臨床攻毒試驗(yàn)表明，本疫苗免疫牛發(fā)生金黃色葡萄球菌或大腸埃希氏菌型臨床乳房炎的機(jī)率比對(duì)照牛低70%以上；田間試驗(yàn)顯示，免疫牛發(fā)生隱性乳房炎的機(jī)率比對(duì)照牛低30%，免疫牛的日產(chǎn)奶量比對(duì)照牛高8%以上。3，疫苗安全性高
佐劑為礦物油佐劑Montanide ISA70M VG，使用高剪切分散乳化機(jī)乳化。乳化后制備的油佐劑滅活疫苗按2005年版《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄分別進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、粘度檢驗(yàn)和穩(wěn)定性檢驗(yàn)。試驗(yàn)中選距分娩期30天和60天的健康妊娠荷斯坦奶牛各 5頭，每頭頸部或臀部肌肉注射疫苗5ml，觀察30天。注苗后母牛食欲、體溫正常，無流產(chǎn)發(fā)生，注苗部位出現(xiàn)直徑不超過3cm的腫塊且在注射后3周內(nèi)消失，所有注苗母牛在正常預(yù)產(chǎn)期產(chǎn)犢且犢牛發(fā)育正常，證明這批疫苗為合格產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述
實(shí)施例1 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗，疫苗按體積份數(shù)比包括4份抗原，所述抗原包括a，金黃色葡萄球菌金黃色亞種Maphylococcus aureus subsp. aureusCGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 的菌體多糖、蛋白混合物抗原的組合；b，CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598毒素抗原的組合；c，大腸埃希氏菌hcherichia coIiCGMCC NO. 4594的菌體蛋白抗原；d，CGMCC NO. 4594的毒素抗原；和6份的e，Montanide ISA70M VG免疫油佐劑的組成。所述4份抗原中，CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598菌體多糖、蛋白混合物抗原的組合含 50% ； CGMCC N0. 4594 菌體蛋白抗原含 12. 5% ；CGMCC N0. 4595、4596、4597、4598 毒素抗原的組合含12. 5% ；CGMCC N0. 4594毒素抗原含25%。上述奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，具有以下步驟
(1)CGMCC N0. 4595、4596、4597、4598 菌種和 CGMCC N0. 4594 菌種的制備；
(2)CGMCC N0. 4595、4596、4597、4598 的菌體多糖、蛋白抗原和 CGMCC N0. 4594 的菌體蛋白抗原的制備；
(3)CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 的毒素抗原和 CGMCC N0. 4594 的毒素抗原的制
備；
(4)將上述獲得的CGMCCN0. 4595、4596、4597、4598的菌體多糖蛋白抗原中的組合與獲得的CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598的毒素抗原中的組合與CGMCC N0. 4594的菌體蛋白抗原與CGMCC N0. 4594的毒素抗原與Montanide ISA70M VG免疫油佐劑按上述體積份數(shù)比混合，制成疫苗。所述CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598菌種中的任意一種都可以按照以下步驟制備
(1)無菌條件下挑取少量菌種，在含有7%綿羊血平板上劃線，將其放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)， 溫度控制在37°C下培養(yǎng)；
(2)從培養(yǎng)的菌種中挑取單個(gè)菌落，接種到改良的哥倫比亞培養(yǎng)基試管中，放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，振搖轉(zhuǎn)速保持170rpm ；
(3)從試管中取培養(yǎng)物接種到改良的哥倫比亞液體培養(yǎng)基三角瓶中，接種量為培養(yǎng)劑量的1%，將其放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱保持37°C，振搖轉(zhuǎn)數(shù)保持170rpm ；
(4)對(duì)培養(yǎng)物鏡檢無雜菌后，放置在4°C冰箱中。所述CGMCC N0. 4594菌種按照以下步驟制備
(1)無菌條件下挑取少量菌種，在LB固體培養(yǎng)平板上劃線，將其放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度控制在37°C下培養(yǎng)Mh;
(2)無菌條件下，從培養(yǎng)的菌種中挑取單個(gè)菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基試管中，放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，振搖轉(zhuǎn)數(shù)保持170rpm ；
(3)從試管中取培養(yǎng)物接種到LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，接種量為培養(yǎng)劑量的1%，將其放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱保持37°C，振搖轉(zhuǎn)速保持170rpm ；
(4)對(duì)培養(yǎng)物鏡檢無雜菌后，放置在4°C冰箱中備用。
所述CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598中任意一種菌體多糖、蛋白抗原都可以按照以下步驟制備
(1)從制備好的菌種中使用涂菌棒將菌液均勻的接種在改良的哥倫比亞固體培養(yǎng)平板上，菌液吸收后放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，培養(yǎng)Mh ；
(2)從培養(yǎng)后的培養(yǎng)平板上刮取菌苔，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為濕重30g/L，用組織細(xì)胞均漿器處理菌懸液，收集菌懸液的上清液；
(3)將獲得的上清液冷卻至4°C，8000X g離心15min，再收集上清液，向上清液中每 IOOOml加入25mg的DNase和75mg的RNase，將其放置在溫箱中37°C條件下孵育2h，冷卻至 4°C 再加入 10mMPMSF2ml，IOmM TLCK 和 TPCK 各 4ml ；
(4)隨后將上清液用Braedford方法測定菌體多糖、蛋白抗原濃度，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為15g/L ( 士0. 3g/L),再先后用孔徑為0. Sum和0. 45um的濾膜過濾，置_20°C備用。所述CGMCC NO. 4594菌體蛋白抗原按照以下步驟制備
(1)從制備的菌種中，取培養(yǎng)物按1%的比例接種在裝有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并且LB液體培養(yǎng)基的量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1:1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)16h ；
(2)從培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集菌體沉淀物，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為濕重30g/L ；
(3)將獲得的上清液冷卻至4°C，8000X g離心15min，再收集上清液，向上清液中每 IOOOml加入25mg的DNase和75mg的RNase，將其放置在溫箱中37°C條件下孵育2h，冷卻至 4°C 再加入 10mMPMSF2ml，IOmM TLCK 和 TPCK 各 4ml ；
(4)隨后將上清液用Braedford方法測定菌體多糖、蛋白抗原濃度，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為15g/L ( 士0. 3g/L),再先后用孔徑為0. Sum和0. 45um的濾膜過濾，置_20°C備用。所述CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598菌毒素抗原中的任意一種都可以按照以下步驟制備
(1)從菌種中，取菌液按1%的比例接種在裝有改良的哥倫比亞液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1:1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)20h ；
(2)將培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集上清液；
(3)向上清液中加入甲醛，使甲醛的最終濃度控制在0.15%，溫度在4°C條件下滅活 48h或者在溫度為25°C條件下滅活Mh，在滅活過程中每天充分?jǐn)嚢?-3次；
(4)滅活液體用分子截留量為IOKDa的超濾濃縮膜濃縮20倍，置_20°C備用。所述CGMCC NO. 4594毒素抗原按照以下步驟制備
(1)從制備的菌種中，取菌液按1%的比例接種在裝有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1 1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)24h ；
(2)將培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集上清液；
(3)向上清液中加入甲醛，使甲醛的最終濃度控制在0.15%，溫度在4°C條件下滅活
1148h或者在溫度為25°C條件下滅活Mh，在滅活過程中每天充分?jǐn)嚢?-3次； (4)滅活液用分子截留量為IOKDa的超濾濃縮膜濃縮20倍，置_20°C備用。所述改良的哥倫比亞培養(yǎng)基，是由哥倫比亞培養(yǎng)基，添加1.5%的氯化鈉，經(jīng)滅菌后，冷至55-60°C，加入10%的小牛血清和10%的乳清混勻冷卻后制成。制備的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗中含有5株菌的多糖、蛋白和毒素抗原。其中，金黃色葡萄球菌金黃色亞種Maphylococcus aureus subsp. aureusCGMCC NO. 4595 的材料編號(hào) XJMPAN10 ；所述的 CGMCC NO. 4596，材料編號(hào) XJMP50 ；所述的CGMCC NO. 4597材料編號(hào)XJMP69 ；所述的CGMCC NO. 4598材料編號(hào)XJMP92。大腸埃希氏菌hcherichia coliCGMCC NO. 4594材料編號(hào)XJMEY9。4株金黃色葡萄球菌培養(yǎng)毒素抗原，1株大腸埃希氏菌培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素抗原、礦物油佐劑為Montanide ISA70M VG，使用高剪切分散乳化機(jī)乳化。乳化后制備的油佐劑滅活疫苗按2005年版《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄分別進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、粘度檢驗(yàn)和穩(wěn)定性檢驗(yàn)。實(shí)施例2 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗，疫苗按體積份數(shù)比包括4份抗原，所述抗原包括a，金黃色葡萄球菌金黃色亞種Maphylococcus aureus subsp. aureusCGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 的菌體多糖、蛋白混合物抗原中任意2種的組合；b, CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598毒素抗原中任意2種的組合；c，大腸埃希氏菌Escherichia coliCGMCC NO. 4594的菌體蛋白抗原；d，CGMCC NO. 4594的毒素抗原； 和6份的e，Montanide ISA70M VG免疫油佐劑的組成。所述4份抗原中，CGMCC N0. 4595、4596、4597、4598菌體多糖、蛋白混合物抗原中任意2種的組合含50% ； CGMCC N0. 4594菌體蛋白抗原含12. 5% ；CGMCC N0. 4595、4596、 4597,4598毒素抗原中任意2種的組合含12. 5% ；CGMCC N0. 4594毒素抗原含25%。奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)疫苗制備方法與實(shí)施例1中的制備方法相同。實(shí)施例3 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗，疫苗按體積份數(shù)比包括4份抗原，所述抗原包括a，金黃色葡萄球菌金黃色亞種Maphylococcus aureus subsp. aureusCGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 的菌體多糖、蛋白混合物抗原中任意3種的組合；b, CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598毒素抗原中任意3種的組合；c，大腸埃希氏菌Escherichia coliCGMCC NO. 4594的菌體蛋白抗原；d，CGMCC NO. 4594的毒素抗原； 和6份的e，Montanide ISA70M VG免疫油佐劑組成。所述4份抗原中，CGMCC N0. 4595、4596、4597、4598菌體多糖、蛋白混合物抗原中任意3種的組合含50% ； CGMCC N0. 4594菌體蛋白抗原含12. 5% ；CGMCC N0. 4595、4596、 4597,4598毒素抗原的組合含12. 5% ；CGMCC N0. 4594毒素抗原含25%。奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗制備方法與實(shí)施例1中的制備方法相同。本疫苗的實(shí)際應(yīng)用試驗(yàn)及檢測
安全性檢測選距分娩期30天和60天的健康妊娠荷斯坦奶牛各5頭，每頭頸部或臀部肌肉注射疫苗5ml，觀察30天，疫苗注射部位允許出現(xiàn)直徑不超過3cm腫塊，注射后20日內(nèi)消失，沒有出現(xiàn)由疫苗注射而引起的全身反應(yīng)或流產(chǎn)，說明本批次的疫苗為合格產(chǎn)品。效力檢驗(yàn)30頭3胎次內(nèi)，距離分娩期40-60天、荷斯坦懷孕奶牛，分A、B、C、D、E五個(gè)組，每組6頭奶牛，其中各組3頭于分娩前40 60天進(jìn)行第一次免疫，分娩后30-40天進(jìn)行第二次免疫。第一次免疫頸部肌肉注射疫苗3ml，第二次免疫2ml，另外3頭奶牛作為對(duì)照牛，二免60天，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。A組6頭牛使用金黃色葡萄球菌XJMPAN10、XJMP69、 XJMP50、XJMP92四株菌中任意一株進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)使用改良的哥倫比亞液體培養(yǎng)基 37°C培養(yǎng)20h，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7. 0-7. 5)稀釋為60cfu/mL，攻毒劑量為5mL (300cfu/乳區(qū))，每頭牛選擇同一部位乳區(qū)進(jìn)行攻毒，攻毒方法為使用通乳針將5mL 菌液注入乳池內(nèi)，并按摩l-2min，攻毒后觀察7天，攻毒乳區(qū)7天內(nèi)出現(xiàn)乳汁異?；蛉榉考t、腫、熱、痛等局部或伴隨全身癥狀確定為發(fā)病牛；B組6頭牛使用XJMPPAN10、XJMP69、 XJMP50、XJMP92四株菌中除去A組使用的菌株其它任意一株進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)、攻毒劑量、攻毒乳區(qū)選擇、攻毒方法及發(fā)病判斷與A組一致；C組6頭牛使用臨床分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)、攻毒劑量、攻毒乳區(qū)選擇、攻毒方法及發(fā)病判斷與A組一致; D組6頭牛使用大腸埃希氏菌XJMEY9進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)使用LB液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) 20h，攻毒劑量為2000cfu/乳區(qū)，每頭牛選擇同一部位乳區(qū)進(jìn)行攻毒，攻毒方法為使用通乳針將5mL菌液注入乳池內(nèi)，并按摩l-2min，攻毒后觀察7天，攻毒乳區(qū)7天內(nèi)出現(xiàn)乳汁異?；蛉榉考t、腫、熱、痛等局部或伴隨全身癥狀確定為發(fā)病牛；E組6頭牛使用從奶牛乳房炎病料中分離的大腸埃希氏菌進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)、攻毒劑量、攻毒乳區(qū)選擇、攻毒方法及發(fā)病判斷與D組一致。按照如下公式計(jì)算免疫保護(hù)率，A、B、C、D、E五個(gè)試驗(yàn)組中，五個(gè)組免疫保護(hù)率均不低于50%的疫苗為合格產(chǎn)品。免疫保護(hù)率(%)=(對(duì)照組奶牛發(fā)病率-免疫組奶牛發(fā)病率) /對(duì)照組奶牛發(fā)病率X100%。1、奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗臨床攻毒試驗(yàn)實(shí)例 (1)攻毒方法
30頭3胎次內(nèi)，距離分娩期40 60天的荷斯坦懷孕奶牛，分A、B、C、D、E五個(gè)組，每組 6頭奶牛，其中各組3頭于分娩前40 60天進(jìn)行第一次免疫，分娩后30-40天進(jìn)行第二次免疫。第一次免疫頸部肌肉注射疫苗:3ml，第二次免疫anl，另外3頭奶牛作為對(duì)照牛，二免 60天，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。A組6頭牛使用金黃色葡萄球菌XJMP 69進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)使用哥倫比亞液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)20h，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7. 0-7. 5)稀釋為60cfu/mL，攻毒劑量為5mL (300cfu/乳區(qū))，每頭牛選擇同一部位乳區(qū)進(jìn)行攻毒，攻毒方法為使用通乳針將5mL菌液注入乳池內(nèi)，并按摩l-2min，攻毒后觀察7天，攻毒乳區(qū)7天內(nèi)出現(xiàn)乳汁異?；蛉榉考t、腫、熱、痛等局部或伴隨全身癥狀確定為發(fā)病牛；
B組6頭牛使用XJMP 92號(hào)菌進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)、攻毒劑量、攻毒乳區(qū)選擇、攻毒方法及發(fā)病判斷與A組一致；
C組6頭牛使用臨床分離的編號(hào)為XJMP 52的金黃色葡萄球菌進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)、 攻毒劑量、攻毒乳區(qū)選擇、攻毒方法及發(fā)病判斷與A組一致；
D組6頭牛使用大腸桿菌XJMEY9進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)使用LB液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng) 20h，攻毒劑量為IOOOcfu/乳區(qū)，每頭牛選擇同一部位乳區(qū)進(jìn)行攻毒，攻毒方法為使用通乳針將5mL菌液注入乳池內(nèi)，并按摩Ι-aiiin，攻毒后觀察5天，攻毒乳區(qū)5天內(nèi)出現(xiàn)紅、腫、熱、 痛等局部或伴隨全身癥狀等臨床型乳房炎癥狀確定為發(fā)病牛；E組6頭牛使用從奶牛乳房炎病料中分離的編號(hào)為K5大腸桿菌進(jìn)行攻毒，攻毒菌培養(yǎng)、 攻毒劑量、攻毒乳區(qū)選擇、攻毒方法及發(fā)病判斷與D組一致。(2)攻毒結(jié)果
攻毒結(jié)果顯示各分組內(nèi)免疫牛的發(fā)病率低于33. 3%，而對(duì)照組的發(fā)病率大于66. 7%，按照免疫保護(hù)率(%)=(對(duì)照組奶牛發(fā)病率-免疫組奶牛發(fā)病率)/對(duì)照組奶牛發(fā)病率X 100% 的計(jì)算方法，該疫苗對(duì)金黃色葡萄球菌的保護(hù)率A組66. 7% ；B組100% ；C組100%，平均保護(hù)率為88. 9% ；該疫苗對(duì)大腸桿菌的保護(hù)率D組100% ；E組100%，平均保護(hù)率為100%。表1奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗臨床攻毒試驗(yàn)保護(hù)
權(quán)利要求
1.奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗，其特征在于所述疫苗按體積份數(shù)比包括4份抗原，所述抗原包括a，金黃色葡萄球菌金黃色亞種Maphylococcus aureus subsp. aureusCGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 的菌體多糖、蛋白抗原中任意 2 種或2種以上的組合；b, CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598毒素抗原中任意2種或2種以上的組合；c，大腸埃希氏菌hcherichia coliCGMCC NO. 4594的菌體蛋白抗原；d，CGMCC NO. 4594的毒素抗原；和6份的e，Montanide ISA70M VG免疫油佐劑組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗， 其特征在于所述4份抗原中，CGMCC N0.4595、4596、4597、4598菌體多糖、蛋白抗原中任意 2種或2種以上的組合含50% ； CGMCC NO. 4594菌體蛋白抗原含12. 5% ；CGMCC NO. 4595、 4596、4597、4598毒素抗原中任意2種或2種以上的組合含12. 5% ；CGMCC NO. 4594毒素抗原含25%。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于該方法具有以下步驟(1)CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 菌種和 CGMCC NO. 4594 菌種的制備；(2)CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 的菌體多糖、蛋白抗原和 CGMCC NO. 4594 的菌體蛋白抗原的制備；(3)CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598 的毒素抗原和 CGMCC NO. 4594 的毒素抗原的制備；(4)將上述獲得的CGMCCNO. 4595、4596、4597、4598的菌體多糖、蛋白抗原中的任意 2種或2種以上的組合與獲得的CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598的毒素抗原中的任意2 種或2種以上的組合與CGMCC NO. 4594的菌體蛋白抗原與CGMCC NO. 4594的毒素抗原與 Montanide ISA70M VG免疫油佐劑按上述體積份數(shù)比混合，制成疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于所述CGMCC N0. 4595、4596、4597、4598菌種中的任意一種都可以按照以下步驟制備(1)無菌條件下挑取少量菌種，在含有7%綿羊血平板上劃線，將其放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)， 溫度控制在37°C下培養(yǎng)；(2)從培養(yǎng)的菌種中挑取單個(gè)菌落，接種到改良的哥倫比亞培養(yǎng)基試管中，放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，振搖速度保持170rpm ；(3)從試管中取培養(yǎng)物接種到改良的哥倫比亞液體培養(yǎng)基三角瓶中，接種量為培養(yǎng)劑量的1%，將其放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱保持37°C，振搖轉(zhuǎn)數(shù)保持170rpm ；(4 )培養(yǎng)物鏡檢無雜菌后，放置在4 V冰箱中備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于所述CGMCC N0. 4594菌種按照以下步驟制備(1)無菌條件下挑取少量菌種，在LB固體培養(yǎng)平板上劃線，將其放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度控制在37°C下培養(yǎng)Mh;(2 )無菌條件下，從培養(yǎng)的菌種中挑取單個(gè)菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基試管中，放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，振搖轉(zhuǎn)數(shù)保持170rpm ；(3)從試管中取培養(yǎng)物接種到LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，接種量為培養(yǎng)劑量的1%，將其放置在振搖培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，振搖培養(yǎng)箱保持37°C，振搖培養(yǎng)速度保持170rpm ；(4)對(duì)培養(yǎng)物鏡檢無雜菌后，放置在4°C冰箱中備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于所述CGMCC NO. 4595,4596,4597,4598中任意一種菌體多糖、蛋白抗原都可以按照以下步驟制備(1)從制備好的菌種中使用涂菌棒將菌液均勻的接種在改良的哥倫比亞固體培養(yǎng)平板上，菌液吸收后放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度保持在37°C，培養(yǎng)Mh ；(2)從培養(yǎng)后的培養(yǎng)平板上刮取菌苔，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為濕重30g/L，用組織細(xì)胞均漿器處理菌懸液，收集菌懸液的上清液；(3)將獲得的上清液冷卻至4°C，8000X g離心15min，再收集上清液，向上清液中每 IOOOml加入25mg的DNase和75mg的RNase，將其放置在溫箱中37°C條件下孵育2h，冷卻至 4°C 再加入 10mMPMSF2ml，IOmM TLCK 和 TPCK 各 4ml ；(4)隨后將上清液用Braedford方法測定菌體多糖、蛋白抗原濃度，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為15g/L ( 士0. 3g/L),再先后用孔徑為0. Sum和0. 45um的濾膜過濾，置_20°C備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于所述CGMCC NO. 4594菌體蛋白抗原按照以下步驟制備(1)從制備的菌種中，取培養(yǎng)物按1%的比例接種在裝有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，并且LB液體培養(yǎng)基的量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1:1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)16h ；(2)從培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集菌體沉淀物，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為濕重30g/L，用組織細(xì)胞均漿器處理菌懸液，收集菌懸液的上清液；(3)將獲得的上清液冷卻至4°C，8000X g離心15min，再收集上清液，向上清液中每 IOOOml加入25mg的DNase和75mg的RNase，將其放置在溫箱中37°C條件下孵育2h，冷卻至 4°C 再加入 10mMPMSF2ml，IOmM TLCK 和 TPCK 各 4ml ；(4)隨后將上清液用Braedford方法測定菌體多糖、蛋白抗原濃度，用磷酸鹽緩沖生理鹽水調(diào)整為15g/L ( 士0. 3g/L),再先后用孔徑為0. Sum和0. 45um的濾膜過濾，置_20°C備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于所述CGMCC NO. 4595、4596、4597、4598菌毒素抗原中的任意一種都可以按照以下步驟制備(1)從菌種中，取菌液按1%的比例接種在裝有改良的哥倫比亞液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1 1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)20h ；(2)將培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集上清液；(3)向上清液中加入甲醛，使甲醛的最終濃度控制在0.15%，溫度在4°C條件下滅活 48h或者在溫度為25°C條件下滅活Mh，在滅活過程中每天充分?jǐn)嚢?-3次；(4)滅活液用分子截留量為IOKDa的超濾濃縮膜濃縮20倍，置_20°C備用。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于所述CGMCC NO. 4594毒素抗原按照以下步驟制備(1)從制備的菌種中，取菌液按1%的比例接種在裝有LB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基量不超過發(fā)酵罐容積的40%，之后在溫度為37°C、壓力為0. 05MPa，每分鐘進(jìn)出空氣體積比為1 1以及170rpm攪拌條件下，培養(yǎng)24h ；(2)將培養(yǎng)物在溫度為4°C，8000X g離心30min，收集上清液；(3)向上清液中加入甲醛，使甲醛的最終濃度控制在0.15%，溫度在4°C條件下滅活 48h或者在溫度為25°C條件下滅活Mh，在滅活過程中每天充分?jǐn)嚢?-3次；(4)滅活液體用分子截留量為IOKDa的超濾濃縮膜濃縮20倍，置_20°C備用。
10.根據(jù)權(quán)利要求4、6、8所述的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于所述改良的哥倫比亞培養(yǎng)基，是由哥倫比亞培養(yǎng)基，添加1. 5% 的氯化鈉，經(jīng)滅菌后，冷至55-60°C，加入10%的小牛血清和10%的乳清混勻冷卻后制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-大腸埃希氏菌二聯(lián)多價(jià)疫苗及其制備方法。所述疫苗按體積份數(shù)比包括4份抗原，a，金黃色葡萄球菌金黃色亞種Staphylococcusaureussubsp.aureusCGMCC No.4595、4596、4597、4598的菌體多糖、蛋白混合物抗原中任意2種或2種以上的組合；b，CGMCC No.4595、4596、4597、4598毒素抗原中任意2種或2種以上的組合；c，大腸埃希氏菌EscherichiacoliCGMCCNO.4594的菌體蛋白抗原；d，CGMCC No.4594的毒素抗原；和6份的e，MontanideISA70MVG免疫油佐劑組成。該制備方法具有以下步驟菌種的制備；菌體抗原的制備；毒素抗原的制備；將上述獲得的菌體抗原、毒素抗原與MontanideISA70MVG免疫油佐劑按上述體積份數(shù)比混合，制成疫苗。本發(fā)明的有益效果1、疫苗菌株抗原覆蓋面廣，免疫原性好。2、效果明顯。3、疫苗安全性高。
文檔編號(hào)A61K39/09GK102205117SQ20111013052
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月19日
發(fā)明者王治才, 王登峰 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所