專利名稱：敬釗纓毛蛛毒素的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種敬釗纓毛蛛毒素的新用途，具體涉及敬釗纓毛蛛毒素在治療和/ 或預(yù)防腦卒中(中風)的藥物中的應(yīng)用，以及敬釗纓毛蛛毒素在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
伴隨著世界范圍人口老齡化速度的加快，腦卒中發(fā)病率呈逐年增高的趨勢。近年來，腦中風已成為世界范圍內(nèi)第一位的致殘原因和第二位致死原因。世界衛(wèi)生組織MONICA 計劃調(diào)查顯示，腦中風平均發(fā)病率東方要高于西方，日本等亞洲國家腦中風發(fā)病率位于世界前位；同時，該計劃對我國約500萬人進行長達8年的監(jiān)測結(jié)果顯示我國的腦中風發(fā)病率為250/10萬，僅次于俄羅斯西伯利亞地區(qū)300/10萬的發(fā)病率。由于腦中風愈后效果差，大多數(shù)患者會有輕重不等的偏癱、失語或癡呆等后遺癥，嚴重影響著患者的生活質(zhì)量，同時也給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。缺血性腦中風是一個復(fù)雜的病理過程，包括缺血期的原發(fā)性損傷和再灌注期的繼發(fā)性損傷，是由多種病理過程相互影響或互為因果形成的病變，與損傷級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。腦中風的有效治療時間僅為發(fā)病后6小時或更短，如果在這段時間內(nèi)無法有效打通栓塞或清除出血，腦損傷將無法挽回，但目前從發(fā)病到完成手術(shù)融栓或清血治療一般需要20小時。 因此，延長治療時間窗，增強神經(jīng)細胞對缺血缺氧的耐受性，抵御缺血再灌注引起的繼發(fā)損傷，將有效提高腦中風的治愈程度。神經(jīng)生物學(xué)的基礎(chǔ)研究為神經(jīng)損傷性疾病治療方法的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)，眾多新的與神經(jīng)損傷相關(guān)機制以及相關(guān)因子相繼被發(fā)現(xiàn)，為神經(jīng)損傷治療以及神經(jīng)功能恢復(fù)提供了理論依據(jù)。腦中風主要分為三類①缺血性腦中風；②出血性腦中風(腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血)；③混合型腦中風。缺血性腦中風占到59.8%，常在睡眠或安靜條件下發(fā)病，由于血管阻塞引起腦缺血損傷而致局部或全腦的功能障礙，主要引發(fā)大腦神經(jīng)元損傷，涉及興奮性毒性、鈣超載、細胞凋亡、炎癥、自由基、一氧化氮以及線粒體的損傷等機制，包括神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞及聯(lián)系纖維由于供血障礙所發(fā)生的變性、壞死或易過性的功能喪失。神經(jīng)保護劑已逐漸成為臨床使用中的熱門藥物。其中具有自由基的清除、保護、修復(fù)與激活神經(jīng)元的優(yōu)勢的腦循環(huán)代謝保護劑已成為研發(fā)的新熱點。此類藥物具有降低血黏度和抑制血小板聚集，延長細胞生存能力、改善腦循環(huán)系統(tǒng)等功能。生物毒素是一大類生物活性物質(zhì)的總稱，是由動物、植物和微生物等產(chǎn)生的對其他生物有毒害作用并不可復(fù)制的化學(xué)物質(zhì)。部分毒素具有明顯的降低血液黏度，溶解血栓等功能，應(yīng)用于臨床，有較明顯的治療效果。目前國外有兩種蛇毒鎮(zhèn)痛藥=Cobroxin和 Nyloxin，均為神經(jīng)毒素，用于治療各種頑固性疼痛和惡性腫瘤疼痛。國內(nèi)有“克痛寧注射液”和“蛇毒新克痛寧，，兩種蛇毒鎮(zhèn)痛藥，均來自于眼鏡蛇毒，使用劑量小，一般沒有嚴重的副作用。默克制藥公司的研究人員在棲息于美國南方的小響尾蛇毒液中分離出一種抗凝血素。他們根據(jù)該分子的結(jié)構(gòu)開發(fā)出兩種環(huán)型多肽類新藥Eptifi-tatide和tirofitan，抗凝血效果遠勝于阿司匹林，成為有效治療心肌梗塞等嚴重心血管疾病的新一代抗凝血藥。我國對蜘蛛毒的研究有著很長的歷史，在《本草拾遺》中就已經(jīng)有了蜘蛛的藥用價值，性味甘、微苦、微寒、有大毒，具有解毒消炎之功效，主治瘡瘍、毒蟲咬傷、中風口斜、小兒驚風等癥。而且我國的蜘蛛資源非常豐富，其中許多物種為我國所特有，因此對蜘蛛藥用價值的研究有著得天獨厚的優(yōu)勢。敬釗纓毛蛛就是分布于我國南方的特有大型毒蜘蛛，此蜘蛛隸屬狒蛛科，棒刺蛛亞科，纓毛蛛屬，是近年在海南發(fā)現(xiàn)蜘蛛新種，個體較大，毒性較強， 毒液采集相對容易。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種敬釗纓毛蛛毒素的新用途。本發(fā)明提供了敬釗纓毛蛛毒素的如下任一所述的用途(a)在制備治療和/或預(yù)防腦卒中(中風)的藥物中的應(yīng)用；(b)在制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了敬釗纓毛蛛毒素在制備具有如下至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用(1)腦保健作用和/或神經(jīng)保護作用；(2)溶解血栓作用；(3)降低腦卒中動物血清中的谷氨酸含量；(4)提高腦卒中動物血清中的超氧化物歧化酶含量；(5)降低腦卒中動物血清中的丙二醛含量；(6)降低腦卒中動物腦組織中的環(huán)氧化酶2含量；(7)降低腦卒中動物大腦皮層中的Calpain蛋白含量。所述環(huán)氧化物酶2 (C0X-2)的氨基酸序列如序列表的序列1所示，核苷酸序列如序列表的序列2所示。所述腦卒中具體可為缺血性腦卒中。本發(fā)明還保護一種治療和/或預(yù)防腦卒中的藥物，它的活性成分為敬釗纓毛蛛毒
ο本發(fā)明還保護一種治療和/或預(yù)防神經(jīng)損傷的藥物，它的活性成分為敬釗纓毛蛛毒素。本發(fā)明還保護一種活性成分為敬釗纓毛蛛毒素的產(chǎn)品；所述產(chǎn)品具有如下至少一種功能(1)腦保健作用和/或神經(jīng)保護作用；(2)溶解血栓作用；(3)降低腦卒中動物血清中的谷氨酸含量；(4)提高腦卒中動物血清中的超氧化物歧化酶含量；(5)降低腦卒中動物血清中的丙二醛含量；(6)降低腦卒中動物腦組織中的環(huán)氧化酶2含量；(7)降低腦卒中動物大腦皮層中的Calpain蛋白含量。所述腦卒中具體可為缺血性腦卒中。
本發(fā)明公開了一種敬釗纓毛蛛毒素(YM)的新用途，具體涉及敬釗纓毛蛛毒素在治療和/或預(yù)防腦卒中(中風)的藥物中的應(yīng)用，以及敬釗纓毛蛛毒素在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)敬釗纓毛蛛毒素對神經(jīng)損傷的具有明顯的修復(fù)作用，如抗凝血、清除自由基(包括增強SOD的活性以及降低MDA水平、降低炎癥炎癥C0X-2 轉(zhuǎn)錄水平等作用途徑)、緩解缺血性中風癥狀、減少腦梗死面積等。


圖1為敬釗纓毛蛛毒素的平板實驗。圖2為TTC染色確定腦梗死面積的照片。圖3為體現(xiàn)血清谷氨酸含量變化的峰面積結(jié)果。圖4為體現(xiàn)血清中SOD和MDA變化的結(jié)果。圖5為腦組織C0X_2mRNA表達量變化的結(jié)果。圖6為腦組織中炎癥因子C0X-2表達量變化的結(jié)果。圖7為大腦皮層中Calpain含量變化的結(jié)果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。凝血酶北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，500u/50mg。人纖維蛋白原Sigma，F(xiàn)3879。 尿激酶麗珠集團麗珠制藥廠，每瓶尿激酶的酶活力單位為25萬單位。法舒地爾天津紅日藥業(yè)，每個包裝為anl，其中含有30mg法舒地爾。敬釗纓毛蛛毒素購自海南生物制藥研究中心。實施例中所用的PBS緩沖液的制備方法如下稱取8g NaCl、0. 2g KCl、1.42g Na2HPO4和0. 27g KH2PO4,溶于800ml去離子水中，用HCl調(diào)pH值至7. 4，最后加去離子水定容至IL0實施例1、敬釗纓毛蛛毒素的體外溶栓活性一、纖維蛋白平板的制備1、把0. 04g人纖維蛋白原稀釋到IOml滅菌的PBS緩沖液中，使之終濃度為^ig/ ml，即為纖維蛋白原溶液。2、凝血酶用Iml PBS緩沖液稀釋至終濃度為lmg/ml，即為凝血酶溶液。3、稱0. Ig瓊脂糖溶于IOml PBS緩沖液中，加熱溶解，即為瓊脂糖溶液。4、將Iml的凝血酶溶液貼壁加入IOml纖維蛋白原溶液中，快速混勻后傾入37°C 融化了的IOml瓊脂糖溶液中，立即混勻后倒入直徑為10. 5cm的一次性培養(yǎng)皿中；室溫放置 30分鐘，轉(zhuǎn)移到4°C冰箱放置30分鐘，得到纖維蛋白平板；用100μ 1 tip頭在纖維蛋白平板上打孔；紫外線下照射10分鐘。二、敬釗纓毛蛛毒素的體外溶栓活性的檢測1、制作標準曲線將尿激酶溶于PBS緩沖液，得到尿激酶溶液。
在所述纖維蛋白平板的孔中每孔加入20 μ 1尿激酶溶液(含有不同酶活力單位的尿激酶)，37°C下孵育24小時后用游標卡尺測量溶圈的橫向直徑及縱向直徑。結(jié)果見表1。根據(jù)溶圈的測量結(jié)果制作標準曲線，得到尿激酶標準曲線方程如下Y = O. 47X-0. 36 (其中Y為酶活力單位的以10為底的對數(shù)值，X為橫縱直徑乘積的以10為底的對數(shù)值)。(2)敬釗纓毛蛛毒素的體外溶栓活性的檢測將敬釗纓毛蛛毒素溶于PBS緩沖液，即為敬釗纓毛蛛毒素溶液。在所述纖維蛋白平板的孔中每孔加入20 μ 1敬釗纓毛蛛毒素溶液(含有不同濃度的敬釗纓毛蛛毒素；敬釗纓毛蛛毒素(YM)的含量分別為2g/100ml、lg/100ml或
0.5g/100ml)，用PBS緩沖液作為空白對照。37°C孵育24小時后拍照，照片見圖1。濃度為2%和1 %的敬釗纓毛蛛毒素溶液出現(xiàn)了較為明顯的溶圈。37°C孵育24小時后用游標卡尺測量溶圈的橫向直徑及縱向直徑，測量結(jié)果見表1。表1溶解圈直徑及相關(guān)數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.敬釗纓毛蛛毒素在制備治療和/或預(yù)防腦卒中的藥物中的應(yīng)用。
2.敬釗纓毛蛛毒素在制備治療和/或預(yù)防神經(jīng)損傷的藥物中的應(yīng)用。
3.敬釗纓毛蛛毒素在制備具有如下至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用(1)腦保健作用和/或神經(jīng)保護作用；(2)溶解血栓作用；(3)降低腦卒中動物血清中的谷氨酸含量；(4)提高腦卒中動物血清中的超氧化物歧化酶含量；(5)降低腦卒中動物血清中的丙二醛含量；(6)降低腦卒中動物腦組織中的環(huán)氧化酶2含量；(7)降低腦卒中動物大腦皮層中的Calpain蛋白含量。
4.如權(quán)利要求1或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述腦卒中為缺血性腦卒中。
5.治療和/或預(yù)防腦卒中的藥物，它的活性成分為敬釗纓毛蛛毒素。
6.治療和/或預(yù)防神經(jīng)損傷的藥物，它的活性成分為敬釗纓毛蛛毒素。
7.活性成分為敬釗纓毛蛛毒素的產(chǎn)品；所述產(chǎn)品具有如下至少一種功能(1)腦保健作用和/或神經(jīng)保護作用；(2)溶解血栓作用；(3)降低腦卒中動物血清中的谷氨酸含量；(4)提高腦卒中動物血清中的超氧化物歧化酶含量；(5)降低腦卒中動物血清中的丙二醛含量；(6)降低腦卒中動物腦組織中的環(huán)氧化酶2含量；(7)降低腦卒中動物大腦皮層中的Calpain蛋白含量。
8.如權(quán)利要求5所述的藥物或如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于所述腦卒中為缺血性腦卒中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種敬釗纓毛蛛毒素的新用途，具體涉及敬釗纓毛蛛毒素在治療和/或預(yù)防腦卒中(中風)的藥物中的應(yīng)用，以及敬釗纓毛蛛毒素在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)敬釗纓毛蛛毒素對神經(jīng)損傷的具有明顯的修復(fù)作用，如抗凝血、清除自由基(包括增強SOD的活性以及降低MDA水平、降低炎癥炎癥COX-2轉(zhuǎn)錄水平等作用途徑)、緩解缺血性中風癥狀、減少腦梗死面積等。
文檔編號A61K38/17GK102205113SQ201110130680
公開日2011年10月5日 申請日期2011年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月19日
發(fā)明者侯圣陶, 史小軍, 張旭旭, 李新明, 米錫陽 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院