專利名稱：一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一。該病的主要特征是懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)、胚胎死亡和胎兒木乃伊化，而母豬本身不表現(xiàn)臨床癥狀，其他豬感染后也無(wú)明顯的臨床癥狀。本病一般呈地方性流行或散發(fā)，有時(shí)也呈現(xiàn)流行性或稱為“暴發(fā)”，這種“暴發(fā)”多見于豬群初次感染，特別是初產(chǎn)母豬癥狀明顯。目前該病已普遍存在于世界各地的豬群中，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。為了減少豬細(xì)小病毒病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的損失，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了廣泛的研究，在疫苗研制上也取得了一定的進(jìn)展。國(guó)外Paul (Paul PS, Mengeling WL，Evaluation of a modified live-virus vaccine for the prevention of porcine parvovirus induced reproductive disease in swine. Am. J. Vet. Res,1980, 41 (2) :2007-2011), Fujisaki(Fujisaki, et.al, Establishment of the attenuated strain of porcine parvovirus parvovirus by serial at low temperature. Natl. Inat, Anim. Health, 1982, (22),1-7), Akhiro(Akhiro, et. al, Establishment of the attenuated strain of porcine parvovirus for the live vaccine and its bioIogical-immunological characteristics)培育出了豬細(xì)小病毒弱毒活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用免疫原性良好的豬細(xì)小病毒(TOF01株)毒株接種于ST細(xì)胞 (原始ST細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)和生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)由本發(fā)明人鑒定、建立、保管和供應(yīng)。該細(xì)胞無(wú)致瘤性或無(wú)致癌性，無(wú)細(xì)胞毒性，無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體、外源病毒污染。從現(xiàn)有代次(56代)可連續(xù)使用50代。)培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活，加入礦物油佐劑混合乳化制成。用于預(yù)防由豬細(xì)小病毒引起的豬細(xì)小病毒病。一、生產(chǎn)用毒株1.毒種的來(lái)源制造用豬細(xì)小病毒YBF01株，由本發(fā)明人2000年在山東省某豬場(chǎng)患病豬流產(chǎn)物分離的一株自然弱毒株(PPV-01株病毒)，用蝕斑克隆技術(shù)對(duì)該病毒分離株進(jìn)行克隆，篩選到一株高增殖力毒株，命名為豬細(xì)小病毒(Porcine ParvovirusHBFOl株(簡(jiǎn)稱PPV-YBF01 株)該病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4809。在對(duì)該毒株的理化特性及生物學(xué)特性進(jìn)行系列研究、鑒定的基礎(chǔ)上，制備了豬細(xì)小病毒滅活疫苗。2. YBF01株病毒毒株的特點(diǎn)(1)致細(xì)胞病變作用將TOF01株病毒含量不低于106_°TCID5(1/0. Iml的種毒按
的量接種于長(zhǎng)勢(shì)良好的ST細(xì)胞，置37°C培養(yǎng)72 96h，出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、脫落，繼而出現(xiàn)空洞、拉網(wǎng)等特異性病變。
(2)病毒含量將YBFOl株毒種用細(xì)胞維持液O %新生牛血清的MEM液，購(gòu)自 GIBC0)進(jìn)行10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、10、個(gè)稀釋度，分別接種于長(zhǎng)勢(shì)良好的ST細(xì)胞(96孔細(xì)胞板)，每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔0.1ml。同時(shí)設(shè)病毒陽(yáng)性對(duì)照孔和細(xì)胞陰性對(duì)照孔，37°C培養(yǎng)和觀察7日，出現(xiàn)CPE者判為感染，計(jì)算TCID5tlt5每0. Iml病毒含量不低于 106°TCID5Q。C3)紅細(xì)胞凝集價(jià)種毒液對(duì)0.5%豚鼠紅細(xì)胞血凝效價(jià)應(yīng)不低于1 256。(4)毒力取懷孕30 50日豬細(xì)小病毒抗體陰性(HI抗體效價(jià)不高于1 8)健康初產(chǎn)母豬4頭，分別滴鼻和注射YBFOl株種毒液各2. 0ml，連續(xù)觀察母豬至分娩，無(wú)流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙出現(xiàn)。該毒株毒力較弱，對(duì)妊娠母豬安全。(5)免疫原性對(duì)豚鼠的免疫原性用病毒含量不低于106_°TCID5(1/0. Iml的TOFOl株病毒液按常規(guī)方法制備油乳劑滅活疫苗，接種體重300 450g豬細(xì)小病毒抗體陰性(HI抗體效價(jià)不高于 1 8)豚鼠4只，各肌肉注射疫苗0.5ml。觀日后，采血測(cè)定HI抗體效價(jià)，免疫豚鼠HI抗體效價(jià)均不低于1 64。對(duì)豬的免疫原性用病毒含量不低于106_°TCID5(1/0. Iml的TOFOl株病毒液按常規(guī)方法制備油乳劑滅活疫苗，接種豬細(xì)小病毒抗體陰性(HI抗體效價(jià)不高于1 8)健康豬4 頭，各肌肉注射疫苗2. 0ml。28日后，采血測(cè)定HI抗體效價(jià)，免疫豬HI抗體效價(jià)均不低于
1 128ο(6)特異性將YBFOl株病毒液用細(xì)胞維持液稀釋至200TCID5(1/0. Iml與等量特異性豬細(xì)小病毒高免血清(本發(fā)明人采用常規(guī)方法自制)混勻，置37°C中和1小時(shí)，接種于長(zhǎng)勢(shì)良好的ST細(xì)胞(6孔細(xì)胞培養(yǎng)板)2孔，每孔0. 5ml，置37°C作用1. 5小時(shí)，補(bǔ)充維持液至 4. 0ml，設(shè)正常細(xì)胞作陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)未經(jīng)特異性豬細(xì)小病毒高免血清中和的YBFOl株病毒液作陽(yáng)性對(duì)照，置37°C培養(yǎng)和觀察7日，判定結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)細(xì)胞病變，中和組和細(xì)胞陰性對(duì)照不出現(xiàn)細(xì)胞病變。(7)純凈無(wú)菌生長(zhǎng)，無(wú)支原體和外源病毒污染。二、豬細(xì)小病毒滅活疫苗的生產(chǎn)方法本發(fā)明所涉及的是一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗，該疫苗含有經(jīng)甲醛溶液滅活的 TOFOl株豬細(xì)小病毒(CGMMCC No. 4809)及常規(guī)的礦物油佐劑。其生產(chǎn)方法主要包括(1)將擴(kuò)大培養(yǎng)的ST細(xì)胞種子細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，37°C培養(yǎng)；按培養(yǎng)液的量將 YBFOl株豬細(xì)小病毒種子接入長(zhǎng)勢(shì)良好細(xì)胞貼壁達(dá)50% 80%棄去培養(yǎng)液的ST細(xì)胞，置 37°C吸附1. 5小時(shí)，加維持液繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲，凍融3次；(2)取凍融后的病毒液測(cè)定病毒含量和紅細(xì)胞凝集價(jià)，每0. Iml病毒含量不低于 IO6 qTCID5q，病毒液對(duì)0.5%豚鼠紅細(xì)胞血凝效價(jià)不低于1 256;(3)按常規(guī)方法收獲培養(yǎng)物經(jīng)甲醛溶液滅活，加入礦物油佐劑混合乳化制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。本發(fā)明的詳細(xì)描述一、疫苗制備1.生產(chǎn)用毒種制備將毒種按的量接種于長(zhǎng)勢(shì)良好的ST細(xì)胞，37°C吸附1. 5小時(shí)，加入維持液，置37°C培養(yǎng)72 96小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲，凍融3次，分裝于滅菌容器內(nèi)，取樣進(jìn)行鑒定。注明收獲日期、毒種代次等。2.細(xì)胞制備從液氮罐中取出結(jié)凍保存的ST種子細(xì)胞管置37°C水浴中融化，將細(xì)胞移入裝有IOml培養(yǎng)液的離心管中，lOOOr/min離心5min。用含20%新生牛血清的培養(yǎng)液 (MEM液，購(gòu)自GIBC0)懸浮細(xì)胞，置37°C培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)成良好單層時(shí)用胰酶-EDTA消化細(xì)胞。3.抗原制備(1)細(xì)胞單層培養(yǎng)將擴(kuò)大培養(yǎng)的種子細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，37°C培養(yǎng)。(2)接毒棄去培養(yǎng)液，按的量接種長(zhǎng)勢(shì)良好的ST細(xì)胞，置37°C吸附1. 5小時(shí)， 加維持液繼續(xù)培養(yǎng)。(3)觀察與收獲接毒后，每日觀察2次，記錄細(xì)胞病變情況。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲，凍融3次。-20°C保存，應(yīng)不超過(guò)30日。4.病毒滅活將檢驗(yàn)合格的病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，使甲醛的最終濃度為0.1%。經(jīng)37°C攪拌滅活16小時(shí)。滅活后的病毒液置2 8°C保存，不超過(guò)30日。5.疫苗制備(1)油相制備取注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C后，再加入司本-806份，至溫度達(dá)到125°C時(shí)維持30min，冷卻后，導(dǎo)入貯油罐中(2)水相制備將檢驗(yàn)合格的豬細(xì)小病毒抗原液96份與滅菌的吐溫-804份導(dǎo)入水相制備罐中，開啟攪拌電機(jī)攪拌20 30min，使吐溫-80完全溶解。(3)乳化取油相2份導(dǎo)入乳化罐中，開動(dòng)電機(jī)低速攪拌，同時(shí)徐徐加入水相1份后， 再以4000r/min攪拌40分鐘。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，3000r/min離心15min， 析出后，水相不超過(guò)0. 5ml。(4)分裝定量分裝，加蓋密封。二、疫苗的安全試驗(yàn)1.豬細(xì)小病毒滅活疫苗對(duì)靶動(dòng)物非使用日齡的安全性試驗(yàn)用本發(fā)明人按本法試制的豬細(xì)小病毒滅活疫苗01、02、03批分別對(duì)4 6周齡健康仔豬16頭和懷孕30 60日母豬8頭進(jìn)行肌肉注射，細(xì)1/頭，另1組注射生理鹽水作對(duì)照。觀察試驗(yàn)豬接種疫苗后的安全性，仔豬連續(xù)觀察14日，母豬觀察至分娩，統(tǒng)計(jì)母豬產(chǎn)仔情況。免后14日每組剖殺2頭， 觀察疫苗吸收情況。結(jié)果表明，免疫組和對(duì)照組仔豬、妊娠母豬采食、精神、糞便均正常，注射部位未見腫脹、結(jié)節(jié)、發(fā)炎；免疫組母豬正常分娩，未見流產(chǎn)、死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙現(xiàn)象發(fā)生。說(shuō)明我們?cè)囍频囊呙绶鞘褂萌正g接種仔豬和妊娠母豬是安全的。詳見表1、 表2。表1豬細(xì)小病毒滅活疫苗(YBF01株)接種仔豬的安全性試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種能預(yù)防由豬細(xì)小病毒引起的豬細(xì)小病毒滅活疫苗，其特征是該疫苗含有經(jīng)甲醛溶液滅活的YBFOl株豬細(xì)小病毒及常規(guī)的礦物油佐劑，該病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMMCC No. 4809。
2.一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于其生產(chǎn)方法主要包括(1)將擴(kuò)大培養(yǎng)的ST細(xì)胞種子細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，37°C培養(yǎng)；按培養(yǎng)液的量將 YBFOl株豬細(xì)小病毒種子接入長(zhǎng)勢(shì)良好細(xì)胞貼壁達(dá)50% 80%棄去培養(yǎng)液的ST細(xì)胞，置 37°C吸附1. 5小時(shí)，加維持液繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲，凍融3次；(2)取凍融后的病毒液測(cè)定病毒含量和紅細(xì)胞凝集價(jià)，每0.Iml病毒含量不低于 IO6 qTCID5q，病毒液對(duì)0.5%豚鼠紅細(xì)胞血凝效價(jià)不低于1 256;(3)按常規(guī)方法收獲培養(yǎng)物經(jīng)甲醛溶液滅活，加入礦物油佐劑混合乳化制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)小病毒滅活疫苗(YBF01株)的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好豬細(xì)小病毒YBF01株接種ST細(xì)胞培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活后，與油佐劑混合乳化制成。用于預(yù)防由豬細(xì)小病毒引起的豬細(xì)小病毒病。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/23GK102205120SQ20111013220
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者劉蕾, 李金積, 申洪銀, 胡瀟, 范根成, 鄒敏, 陶曉珊 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司