專利名稱：FGFR-Fc融合蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及疾病的治療，尤其是與FGF過度表達相關的疾病的治療。具體地，本發(fā)明涉及FGFR-Fc融合蛋白及其在治療與血管新生調控相關的疾病中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及分離的可溶性FGFR-Fc融合蛋白及其在制備用于治療與血管新生調控相關的疾病的藥物中的應用。
背景技術：
血管新生(Angiogenesis)是導致惡性腫瘤生長和轉移的基本要素之一 [1]。血管新生過程受多種因子的調節(jié)，有些因子促進血管新生，有些因子抑制血管新生，因而，血管新生的調控是一個十分復雜的動態(tài)平衡過程[2]?？寡苄律委熤荚谕ㄟ^阻斷血管新生刺激因子或者用血管新生抑制因子阻止腫瘤中血管的新生，從而達到控制腫瘤生長的目的。目前已經知道相當數(shù)目的血管新生刺激因子，例如血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)、@ 千會IfiHISi (Fibroblast growth factor, FGF)、肝細胞生長因子Ofepatocyte growth factor, HGF)等，這些因子能刺激血管內皮細胞的分裂、分化和血管的形態(tài)發(fā)生。其中，VEGF是目前所知對血管新生最特異、最有效的生長因子[3，4]。在腫瘤組織內的缺氧環(huán)境中，腫瘤細胞分泌大量的VEGF，誘導血管內皮細胞的分裂和遷移，最終建立腫瘤血管網(wǎng)絡。眾多動物試驗證明，抑制VEGF能阻止血管新生，進而抑制腫瘤的生長。正因為此，VEGF及其受體是抗血管新生藥物最重要的靶標，目前在臨床試驗中取得顯著療效的抗血管新生藥物有貝伐單抗(Bevacizumab，商品名Avastin)，它能夠直接阻斷VEGF，抑制腫瘤血管的新生，于2004年被美國FDA批準上市作為結直腸癌的一線用藥，是第一個被批準上市的通過抑制血管新生發(fā)揮抗癌作用的新藥。Avastin是一種人源化的抗VEGF的單克隆抗體，由美國著名生物技術公司Genentech生產。在大規(guī)模三期臨床試驗中，Avastin與化療聯(lián)合用藥可以顯著延長多種腫瘤病人的生存時間，包括直腸癌、肺癌、乳腺癌、腎癌等[5，6]。Avastin在臨床上的成功具有劃時代的意義，它證明以腫瘤血管系統(tǒng)為靶標的抗血管新生治療是一個在臨床上有效的治療手段，為多種腫瘤的治療開辟了一個全新的途徑。在西方國家，Avastin已在腫瘤治療上得到廣泛應用，是目前全球銷售額最大的藥物之一。除了 Avastin，國際上還有若干個抗VEGF信號的藥物正處于人體臨床試驗的后期，有望在將來幾年進入臨床應用。其中，美國生物技術公司Regeneron和Sanofi-Aventis 合作的AfliberC印t(或稱VEGF-Trap)目前正在進行大規(guī)模第三期臨床試驗[7]。Imclone 公司的抗VEGF受體II (VEGFR2)單克隆抗體藥物IMC-1121B也在第三期臨床試驗[8]。在國內，以抗血管新生為靶標的腫瘤藥物新藥也是目前新藥開發(fā)的熱點。國內有若干公司和科研機構正在研發(fā)針對VEGF及其受體，或其它血管新生靶標的藥物。毫無疑問，這些新藥將為癌癥的治療提供新的選擇，給病人帶來新的希望?？筕EGF藥物在腫瘤的臨床治療上取得了重大的進展，但是，臨床試驗也顯示抗VEGF治療也存在相當大的局限。從腫瘤的治療效果看，Avastin對直腸結腸癌病人能延長半數(shù)生存時間約3-4個月[9，10]，對乳腺癌病人能延長半數(shù)生存時間約為7-8個月[11]， 因此，Avastin并不能長期有效地抑制腫瘤血管的生長。因此，如何進一步提高抗血管新生的臨床治療效果是腫瘤研究者需要解決的問題，也是研究開發(fā)下一代抗血管新生藥物的重
點ο導致抗VEGF治療失敗或產生抗性的的根本原因可能在于腫瘤血管新生是受到多種因子控制的，盡管VEGF在血管新生中起到重要作用，但它不是唯一的血管新生刺激因子。同時，由于腫瘤細胞的非均質性和腫瘤微環(huán)境的復雜性以及機體的代償性反應機制，當 VEGF的活性被長時間抑制，其它血管新生刺激因子便會被表達[12]，從而使腫瘤血管的生長不再依賴于VEGF信號途徑。美國加州大學舊金山分校Hanahan教授的小組研究了胰島腫瘤在接受抗VEGFR2治療過程中腫瘤表達血管生長因子的變化，發(fā)現(xiàn)在抗VEGF的治療過程中有若干基因的表達發(fā)生了變化，其中最為突出的是FGF-2的表達顯著增加，研究表明對抗VEGF治療出現(xiàn)耐受的腫瘤中FGF，尤其是FGF-2的表達顯著增加，從而再次激活血管新生，而阻斷FGF信號途徑后腫瘤再生則被抑制[13]。由此可見FGF-2的過度表達與腫瘤獲得逃逸抗VEGF治療的能力有著密切的關系。因此，我們認為阻斷FGF通路能夠高效地阻止腫瘤血管新生，抑制腫瘤的生長，從而單獨或與抗VEGF治療相組合地治療與血管新生有關的疾病。成纖維細胞生長因子(FGF)是結合肝素的生長因子家族，在哺乳動物中其具有22 個家族成員(FGF 1-14，16-23)。FGF在多種生物學功能上具有重要作用，例如細胞增殖、分化、遷移、血管新生和腫瘤發(fā)生等。成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)是與成纖維細胞生長因子家族成員相結合的受體。FGF可以結合FGFR并激活下游信號通路，在胚胎發(fā)生、發(fā)育、血管發(fā)生、血管舒張、神經調節(jié)、缺血保護、創(chuàng)傷愈合和腫瘤發(fā)生等生理和病理過程中起重要作用[14，15]?，F(xiàn)已證實，體內FGF/FGFR的過度表達與包括腫瘤(如纖維瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、前列腺瘤、淋巴瘤、白血病、泌尿系統(tǒng)癌等)、骨骼系統(tǒng)疾病(侏儒、顱縫早閉、軟骨發(fā)育不全、黑棘皮癥)和腎衰竭等多種疾病密切相關[14-19]。已有報道稱，F(xiàn)GF及其受體表達水平的提高有可能直接促進腫瘤細胞的存活和增殖，并且通過siRNA下調FGF顯著降低了肝癌細胞的存活[22]。因此，構建具有拮抗 FGF能力的FGFR-Fc融合蛋白有望阻斷FGF通路，具有治療與FGF過度表達相關疾病的潛能。目前在臨床試驗中以FGF及其受體為靶標的抗血管新生新藥的研發(fā)相對較少，美國Five Prime公司研發(fā)的FP-1039處于一期臨床招募志愿者階段，F(xiàn)P-1039是由人FGFRl 整個細胞外結構域與人IgGl的Fc片段相融合而成的蛋白。而Wang和Olsen等人的研究均表明人FGFRl細胞外結構域的第一個Ig樣結構域及其與第二個Ig樣結構域之間的連接片段會抑制FGFRl與FGF的結合[20，21]。因此，構建具有拮抗FGF能力的FGFR-Fc融合蛋白有望阻斷FGF通路，從而有效抑制血管新生或者直接作用于腫瘤細胞并抑制其生長，有治療與FGF過度表達相關疾病的潛能，達到治療腫瘤等與血管新生有關的疾病的目的
發(fā)明內容
蛋白質的空間結構與其生物學功能具有密切的關系。FGFR的細胞外結構域的各 Ig-Iike結構域及連接片段的構象的不同直接影響其與FGF結合的能力，通過基因工程的方法構建不同長度的FGFR細胞外結構域片段與IgG Fc組成不同的融合蛋白，形成具有不同構象的融合蛋白，可以從中篩選獲得高效結合FGF且具有生物學活性的融合蛋白。哺乳動物中有四個FGFR基因fgffRl-fgfR4。成纖維細胞生長因子受體由胞外區(qū)、跨膜結構域和胞內結構域組成，F(xiàn)GFR家族有許多個成員，其配體結合性質和激酶結構域各有不同，但是都具有相似的胞外區(qū)。它們的胞外區(qū)包含三個免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域第一 Ig樣結構域、第二 Ig樣結構域和第三Ig樣結構域，在第一和第二 Ig樣結構域之間還包含一段序列，在本技術方案中，將所述第一 Ig樣結構域和第二 Ig樣結構域之間的序列稱為FGFR Ig樣結構域中間功能性序列(在本文中，可簡稱為IFS)。所述中間功能性序列可包含一個酸性氨基酸區(qū)段，稱為酸性盒(acidic box, AB) 0本發(fā)明涉及一種分離的可溶性成纖維細胞生長因子受體(FGFR)融合蛋白，其包含源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列(本文中也稱為IFS)的部分、FGFR第二 Ig樣結構域(本文中也稱為D2)、FGFR第三Ig樣結構域(本文中也稱為D3)和免疫球蛋白Fc區(qū)。

本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其包含下列項或由其組成源自TOFR Ig樣結構域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結構域、FGFR第三Ig樣結構域和免疫球蛋白Fc區(qū)。 在一些實施方案中，所述源自IFS的部分不包含酸性盒。在另一些實施方案中，所述IFS的部分具有SEQ IDNO :1第134至162位、145至162位或151至162位的氨基酸序列，或者具有與SEQ ID NO :1第134至162位、145至162位或151至162位的氨基酸序列有至少 90%同一性的氨基酸序列，優(yōu)選93%、95%、97%、98%或99%同一性。本發(fā)明還涉及一種融合蛋白，其包含下列項或由其組成FGFR第一 Ig樣結構域 (本文也稱為Dl)或其一部分、源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結構域、FGFR第三Ig樣結構域和免疫球蛋白Fc區(qū)。優(yōu)選地，所述Dl結構域或其一部分具有SEQ ID NO 1的40至118位的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :1第40至118位的序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的
氨基酸序列；或者SEQ ID NO 1的77至118位的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :1第77至118位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同
一性的氨基酸序列。在一個方面，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其包含下列項或由其組成FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區(qū)或其一部分、reFR第二 Ig樣結構域、FGFR第三Ig樣結構域和免疫球蛋白Fc區(qū)，其中FGFR第二 Ig樣結構域具有SEQ ID NO :1第163至247位的氨基酸序列，或者與 SEQ ID NO :1第163至247位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、 93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或FGFR第三Ig樣結構域具有SEQ ID NO :1第270至359位的氨基酸序列，或者與 SEQ ID NO :1第270至359位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列本發(fā)明還涉及一種融合蛋白，其包含衍生自FGFR胞外區(qū)的區(qū)域和免疫球蛋白Fc 區(qū)或由其組成，其中所述衍生自FGFR胞外區(qū)的區(qū)域(1)具有 SEQ ID NO 9 第 358-580 位、SEQ ID NO 10 第 304-526 位、SEQ ID NO 11 第 278-500 位、SEQ ID NO 12 第 246-468 位、SEQ IDNO 13 第 235-457 位、SEQ ID NO 14 第229-451位和SEQ ID NO 15第224-446位任一項中所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO 16 第 1074-1740 位、SEQ ID NO 17 H 912-1578 位、SEQ ID NO 18 H 834-1500 位、SEQID NO 19 第 738-1404 位、SEQ ID NO 20 第 705-1371 位、SEQ ID NO 21 第 687-1353 位和 SEQ ID NO 22第672-1338位任一項中所示核苷酸序列編碼；(2)包含與 SEQ ID NO :9 第 358-580 位、SEQ ID NO 10 第 304-526 位、SEQ ID NO: 11 第 278-500 位、SEQ ID NO 12 H 246-468 位、SEQ IDNO :13 第 235-457 位、SEQ ID NO 14第229-451位和SEQ ID NO 15第224-446位任一項中所示氨基酸序列有至少70 %同一性的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性；或者(3)包含由與 SEQ ID NO 16 H 1074-1740 位、SEQ ID NO 17 H 912-1578 位、SEQ ID NO 18 第 834-1500 位、SEQ ID NO 19 第 738-1404 位、SEQ ID NO 20 第 705-1371 位、 SEQ ID NO :21第687-1353位和SEQID NO :22第672-1338位任一項中所示核苷酸序列有至少70%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少80%、90%、 93%、95%、97%、98%或 99% 同一性。本發(fā)明還涉及一種融合蛋白，所述蛋白(1)包含SEQ ID NO :9_15任一項所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO 16-22任一項所示核苷酸序列編碼；(2)包含與SEQ ID NO :9_15任一項所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性；或者(3)包含由與SEQ ID NO :16_22任一項所示核苷酸序列有至少70%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或 99%同一性。優(yōu)選地，在本發(fā)明的融合蛋白中，所述免疫球蛋白Fc區(qū)是人IgGl的Fc區(qū)，更優(yōu)選地其具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 7的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；或者SEQ ID NO 8的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO 8的核苷酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述免疫球蛋白Fc區(qū)位于融合蛋白的C端。優(yōu)選地，本發(fā)明還涉及包含分泌信號肽區(qū)的融合蛋白前體，例如VEGFRl信號肽區(qū)，優(yōu)選地所述分泌信號肽區(qū)具有SEQ ID NO :2的1至26位的氨基酸序列或者SEQ ID NO 23的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。所述信號肽區(qū)優(yōu)選在所述前體的N端。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其從N端到C端依次包含源自IFR的部分、D2、D3和免疫球蛋白Fc區(qū)。在又一個方面，本發(fā)明的融合蛋白所包含的結構域和/或區(qū)域之間直接連接和/ 或通過接頭連接。在一個實施方案中，衍生自FGFR胞外區(qū)的區(qū)域和免疫球蛋白Fc區(qū)直接連接。在另一個實施方案中，衍生自FGFR胞外區(qū)的區(qū)域和免疫球蛋白Fc區(qū)通過接頭連接。在一個方面，本發(fā)明的融合蛋白抑制血管新生。在另一個方面，本發(fā)明的融合蛋白在體內和/或在體外結合FGF，優(yōu)選結合FGF2。在又一個方面，本發(fā)明的融合蛋白直接抑制腫瘤細胞。本發(fā)明還涉及FGFR-Fc融合蛋白，其包含衍生自FGFR胞外區(qū)的部分以及衍生自免疫球蛋白Fc區(qū)的部分。特別地，所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分是衍生自FGFRl胞外區(qū)的部分。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白Fc區(qū)是人免疫球蛋白Fc區(qū)，例如人IgGl的Fc區(qū)。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白具有結合和/或拮抗FGF的能力，因此抑制血管新生。在本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白中，所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分可包含選自下列的一項或多項D1結構域或其一部分、源自IFS的部分、D2結構域或其一部分以及D3結構域或其一部分。在一個實施方案中，所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分可包含Dl或其一部分、 源自IFS的部分、D2結構域和D3結構域。在另一個實施方案中，所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分可包含源自IFS的部分、D2結構域和D3結構域，優(yōu)選地所述源自IFS的部分具有SEQ ID NO :1第134至162位、145至162位或151至162位的氨基酸序列。在一些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白不包含Dl或其一部分。在另一些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白不包含IFS除了 SEQ ID NO :1第134至162位、145至162位或151 至162位的氨基酸序列之外的部分。在本發(fā)明的一些實施方案中，F(xiàn)GFR-Fc融合蛋白中所包含的各區(qū)域和/或各個結構域從N端到C端的順序可以是任意的。在另一些實施方案中，所述順序可以是圖1所示的順序。在又一些實施方案中，所述順序可以與圖1所示的順序不同。在一些實施方案中，本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白還包含一個或多個鏈內二硫鍵， 優(yōu)選在Ig樣結構域中包含一個或多個鏈內二硫鍵。在本發(fā)明的一個方面中，F(xiàn)GFR-Fc融合蛋白可通過在哺乳動物細胞系中表達包含 SEQ ID NO :16-22任一項所示核苷酸序列的核酸來產生。特別地，所述哺乳動物細胞系是 CHO細胞系。另外，本發(fā)明還提供了 FGFR-Fc融合蛋白，其中所述融合蛋白包含的結構域和/或區(qū)域有效連接和/或通過接頭連接。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明融合蛋白或融合蛋白前體的分離的核酸分子。優(yōu)選地，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 16-22任一項所示核苷酸序列。在又一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸分子的載體。再一個方面，本發(fā)明提供了所述載體轉染的細胞，優(yōu)選CHO細胞。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明融合蛋白的組合物，其與可藥用載體相混合。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的融合蛋白、核酸分子、載體或者細胞，以及可藥用載體。在又一個方面，本發(fā)明提供了一種生產抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通過在原核細胞或真核細胞尤其是哺乳動物細胞系中表達本發(fā)明的融合蛋白來進行。本發(fā)明還涉及一種生產抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通過在哺乳動物細胞系中表達本發(fā)明的核酸分子來進行。優(yōu)選地，所述哺乳動物細胞系是CHO細胞系。 在另一個方面中，本發(fā)明提供了抑制血管新生的方法，其包括向有此需要的對象施用抑制血管新生有效量的本發(fā)明FGFR-Fc融合蛋白、編碼其的核酸分子、包含所述核酸分子的載體和/或包含上述任一項的藥物組合物。優(yōu)選地，所述方法在哺乳動物中進行。在又一個方面中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療或預防腫瘤的方法，其包括向有此需要的對象施用治療或預防有效量的本發(fā)明FGFR-Fc融合蛋白、編碼其的核酸分子、 包含所述核酸分子的載體和/或包含上述任一項的藥物組合物，優(yōu)選地其中所述腫瘤是實體瘤。在又一個方面中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療或預防眼中血管新生相關疾病的方法，其包括向有此需要的對象施用治療或預防有效量的本發(fā)明FGFR-Fc融合蛋白、編碼其的核酸分子、包含所述核酸分子的載體和/或包含上述任一項的藥物組合物，優(yōu)選地所述眼中血管新生相關疾病是年齡相關黃斑變性。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白、編碼其的核酸分子、包含所述核酸分子的載體和/或包含上述任一項的藥物組合物在制備用于抑制血管新生的藥物中的用途。 另外，本發(fā)明還涉及FGFR-Fc融合蛋白、編碼其的核酸分子、包含所述核酸分子的載體和/ 或包含上述任一項的藥物組合物在制備用于治療或預防血管新生相關疾病的藥物中的用途，優(yōu)選地所述血管新生相關疾病是腫瘤或者眼中血管新生相關疾病?？紤]到不同國家的專利制度對保護主題有不同規(guī)定，本公開內容還提供與以上方法相對應的制藥用途以及用于預定用途的藥物。這些各種制藥用途和藥物也在本發(fā)明保護范圍內，就像它們已經具體記載在本公開內容中一樣。本公開內容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術方案中所記載的技術特征可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經組合而得到的技術方案也在本申請保護范圍內，就像這些經組合而得到的技術方案已經在本公開內容中具體記載一樣。將結合附圖以及以下進一步的詳細說明來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。 本發(fā)明的保護范圍以所附權利要求書記載的內容為準。


圖1是FGFRl-Fc融合蛋白的結構示意圖。其中FGFRl-Fc融合蛋白以實線表示， 缺失的氨基酸以虛線表示；抗體樣結構域用環(huán)型表示；不同的抗體樣結構域以數(shù)字1-3表示；二硫鍵以ss表示；人IgGl Fc用灰色框表示；SP表示VEGFRl信號肽；酸性盒序列以帶 AB字母的方框表示。圖2顯示了不同的FGFRl-Fc融合蛋白結合FGF-2的比較。通過ELISA法檢測 20ng/mL 的各個 FGFRl-Fc 融合蛋白與 50ng/mL FGF-2 (含 100ng/mL 肝素 Ofeparin))或單獨的50ng/mL FGF-2的結合。圖3顯示了 26號FGFRl-Fc融合蛋白的SDS-PAGE圖。
圖4顯示了 26號FGFRl-Fc融合蛋白梯度與FGF-2的結合。圖5顯示了 26號FGFRl-Fc融合蛋白與FGF-2的親和力。圖6顯示了 26號FGFRl-Fc融合蛋白對FGF-2誘導的HUVEC細胞分裂的影響。
具體實施例方式
定義除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關于本領域的定義及術語，專業(yè)人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。盡管本發(fā)明的廣義范圍所示的數(shù)字范圍和參數(shù)近似值，但是具體實施例中所示的數(shù)值盡可能準確的進行記載。然而，任何數(shù)值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測量中存在的標準偏差所致。另外，本文公開的所有范圍應理解為涵蓋其中包含的任何和所有子范圍。例如記載的“1至10”的范圍應認為包含最小值1和最大值10之間(包含端點)的任何和所有子范圍；也就是說，所有以最小值1或更大起始的子范圍，例如1至 6. 1，以及以最大值10或更小終止的子范圍，例如5. 5至10。另外，任何稱為“并入本文”的參考文獻應理解為以其整體并入。另外應注意，如本說明書中所使用的，單數(shù)形式包括其所指對象的復數(shù)形式，除非清楚且明確的限于一個所指對象。術語“或”可與術語“和/或”互換使用，除非上下文另有清楚指明。本文使用的術語“Fc”、“Fc區(qū)”、“Fe片段”或“免疫球蛋白Fc區(qū)”等表示免疫球蛋白的可結晶片段，在本發(fā)明人，所述Fc區(qū)優(yōu)選人IgGl的Fc區(qū)。術語“Fe融合蛋白”指將異源蛋白質的結合特異性與免疫球蛋白恒定結構域的效應子功能相結合的抗體樣分子。從結構上來說，F(xiàn)c融合蛋白包含具有所需結合特異性的氨基酸序列以及免疫球蛋白恒定結構域序列。Fc融合蛋白分子通常包含受體或配體的結合位點。所述免疫球蛋白恒定結構域序列可以獲得自任何免疫球蛋白，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3 或 IgG-4 亞型，IgA(包括 IgA-I 和 IgA-2)，IgE, IgD 或 IgM0本文使用的術語“可溶性”蛋白是指在生物學相關的溫度、pH水平和滲透壓下可溶于水溶液的蛋白。本文使用的“可溶性融合蛋白”表示該融合蛋白不包含跨膜區(qū)和胞內區(qū)。如本文所用，術語“分離的”是指以下物質和/或實體，⑴與起初產生時(在天然環(huán)境中和/或在試驗設置中)和其相關聯(lián)的至少一些組分相分離和/或(2)通過人工生產、制備和/或制造。分離的物質和/或實體可與至少約10%、約20%、約30%、約40%、 約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 95%、約 98%、約 99%、基本 100%或 100% 的其初始相關聯(lián)的其他組分相分離。術語“部分”和“片段”可互換的指代多肽、核酸或其它分子構建物的一部分。本文使用的術語“Ig樣結構域”表示免疫球蛋白樣結構域，其可見于多種蛋白質家族，參與多種生物學功能，包括細胞-細胞識別、細胞表面受體、免疫功能等等。成纖維細胞生長因子(FGF)是結合肝素的生長因子家族，在哺乳動物中其具有22 個家族成員(FGF 1-14，16-23)。FGF在多種生物學功能上具有重要作用，例如細胞增殖、分化、遷移、血管新生和腫瘤發(fā)生。其通過結合并活化細胞表面FGF受體(FGFR)發(fā)揮其多種生物學功能。(參見,例如 Eswarakumar et al. Cytokine Growth Factor Rev. 16 139-149, 2005)。成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)是與成纖維細胞生長因子家族成員相結合的受體。成纖維細胞生長因子受體中的一部分參與疾病過程。哺乳動物中有四個FGFR基因fgfRl-fgfR4。成纖維細胞生長因子受體由胞外區(qū)、 跨膜結構域和胞內結構域組成，F(xiàn)GFR家族有許多個成員，其配體結合性質和激酶結構域各有不同，但是都具有相似的胞外區(qū)。它們的胞外區(qū)包含三個免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域 第一 Ig樣結構域、第二 Ig樣結構域和第三Ig樣結構域，在第一和第二 Ig樣結構域之間還包含一段序列，在本文中，我們將所述第一 Ig樣結構域和第二 Ig樣結構域之間的序列稱為 FGFR Ig樣結構域中間調控序列。所述中間調控序列包含一個酸性氨基酸區(qū)段，稱為酸性盒 (acidic box, AB)本文使用的術語“FGFR第一 Ig樣結構域”或“第一 Ig樣結構域”表示FGFR蛋白中自N端起第一個Ig樣結構域，其具有例如SEQ ID NO :1第40至118位的氨基酸序列。 類似地，術語“FGFR第二 Ig樣結構域”或“第二 Ig樣結構域”表示FGFR蛋白中自N端起第二個Ig樣結構域，其具有例如SEQ ID NO :1第163至247位的氨基酸序列；術語“FGFR第三Ig樣結構域”或“第三Ig樣結構域”表示FGFR蛋白中自N端起第一個Ig樣結構域，其具有例如SEQ ID NO :1第270至359位的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述FGFR是FGFRl，F(xiàn)GFR 第一 Ig樣結構域是FGFRl第一 Ig樣結構域，F(xiàn)GFR第二 Ig樣結構域是TOFRl第二 Ig樣結構域，F(xiàn)GFR第三Ig樣結構域是FGFRl第三Ig樣結構域。下面給出hFGFRl的部分序列，陰影部分依次表示各個Ig樣結構域，可參見 http//www, ncbi. nlm. nih. Rov/protein/AAH15035. IMWSffKCLLFffAVLVTATLCTARPSPTLPEQA
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mIU m Km)VQsi、、vi Qi \KS、KTm r(;· Λ ΚΛ (JI)SVPADSG
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寸乂 O本文使用的術語“一致性”、“百分比一致性”、“同源性”或“同一性”指兩個氨基酸序列之間或者核酸序列之間的序列同一性?？梢酝ㄟ^比對兩個序列來確定百分比一致性， 百分比一致性指所比較的序列共有位置相同殘基(即氨基酸或核苷酸)的數(shù)量。可使用本領域的標準算法(例如 Smith 和 Waterman, 1981，Adv. App 1. Math. 2 482 ；Needleman 禾口 Wunsch, 1970，J. MoI. Biol. 48 443 ；Pearson 禾口 Lipman，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. ，USA, 85 2444)或者通過這些算法的計算機化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release 7. O, Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, WI)進行序列比對和比較，所述計算機化版本公開可用為BLAST和FASTA。另外，通過國家衛(wèi)生研究院 (Bethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比較。當使用BLAST和缺口 BLAST程序時，可使用各個程序(例如BLASTN，在國家生物技術信息中心的因特網(wǎng)站點上可用)的缺省參數(shù)。在一個實施方案中，可使用缺口權重為1的GCG來確定兩個序列的百分比同一性，使得每個氨基酸缺口給予權重如同它是兩個序列間的單氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序(2.0 版)，其是GCG(Accelrys，San Diego, CA)序列比對軟件包的一部分。本文使用的術語“雜交”指兩個單鏈多核苷酸非共價結合以形成穩(wěn)定雙鏈多核苷酸的過程。術語“雜交”還可以指三鏈雜交。所產生的(通常是)雙鏈的多核苷酸為“雜交體”或“雙鏈體”。“雜交條件”一般包括低于約1M、更通常低于約500mM和低于約200mM的鹽濃度。雜交溫度可以低至5°C，但通常高于約22°C，更通常高于約30°C，優(yōu)選高于約37°C。 雜交通常在嚴格條件(即探針會與其靶序列雜交的條件)下進行。嚴格雜交條件取決于序列，并在不同的情況下存在差異。較長的片段可能需要較高的雜交溫度來進行特異性雜交。由于其他因素(包括互補鏈的堿基組成和長度、有機溶劑的存在和堿基錯配程度)可能影響雜交的嚴格度，因此參數(shù)的組合比任何一個單獨參數(shù)的絕對值更為重要。一般而言， 將嚴格條件選擇成比確定的離子強度和PH下該特定序列的Tm低約5°C。示例性嚴格條件包括pH7. O至8. 3下至少0. OlM至不高于IM的Na離子濃度(或其他鹽)和至少25°C的溫度。對于嚴格條件，參閱如 Sambrook，F(xiàn)ritsche 和 Maniatis. "Molecular Cloning A laboratory Manual，，第二版 Cold Spring Harbor Press (1989)以及 Anderson "Nucleic Acid Hybridization” 第一版，BIOS Scientific Publishers Limited (1999)，它們對于所有上述目的均通過參考整體并入本文。
本文使用的術語“接頭”、“肽接頭”、“連接序列”或“接頭序列”表示將本發(fā)明融合蛋白所包含的各個結構域和/或區(qū)域相連接的短氨基酸序列，其一般為0-20個氨基酸長， 優(yōu)選2-10個氨基酸。本文使用的術語融合蛋白或部分或結構域“與SEQ ID NO :N對應的氨基酸序列” 表示，所述融合蛋白或部分或結構域具有基本上如SEQ IDNO :N所示的氨基酸序列，優(yōu)選地其中含有不超過1、2、3、4、5、10或20個氨基酸替換、添加或缺失，又優(yōu)選地所述融合蛋白或部分或結構域具有與SEQ ID NO :N所示氨基酸序列至少80%、90%、93%、95%、97%、98% 或99%的同一性，更優(yōu)選地，所述融合蛋白或部分或結構域具有SEQ ID NO :N所示氨基酸序列。本文使用的術語“FGFR-Fc融合蛋白”表示包含衍生自FGFR胞外區(qū)的部分和衍生自免疫球蛋白Fc區(qū)的部分的融合蛋白，其中衍生自FGFR胞外區(qū)的部分可(1)包含與SEQ ID NO 9-15任一項所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少 80%、90%、93%、95%、97%、98%或 99% 同一性；(2)包含由與 SEQ ID NO 16-22 { 一項所示核苷酸序列有至少70%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少 80%、90%、93%、95%、97%、98%或 99% 同一性；或者(3)具有 SEQ ID NO 9-15 任一項所示氨基酸序列，或由SEQ ID Ν0:16-22任一項所示核苷酸序列編碼。在一些優(yōu)選實施方案中，所述FGFR-Fc融合蛋白可由核酸編碼，其中編碼衍生自 FGFR胞外區(qū)的部分的核苷酸序列包含其互補物在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO 16-22任一項所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO: 16-22任一項所示的核苷酸序列的簡并變體。在一些優(yōu)選實施方案中，編碼免疫球蛋白Fc區(qū)的核苷酸序列包含其互補物在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列的簡并變體。在又一些優(yōu)選實施方案中，所述FGFR-Fc融合蛋白包括FGFR-Fc融合蛋白變體。 在一個實施方案中，所述變體包括在源自IFS的部分對應于SEQ ID NO 1的134至162位、 145至162位或151至162位所示的氨基酸序列中含有不超過2、3、4、5或10個氨基酸替換、 添加或缺失的變體，所述變體優(yōu)選保持抑制血管新生的能力。在另一個實施方案中，所述變體包括在D2結構域對應于SEQ ID NO 1的163至247位所示的氨基酸序列中含有不超過 2、3、4、5、10或20個氨基酸替換、添加或缺失的變體，所述變體優(yōu)選保持抑制血管新生的能力。在另一個實施方案中，所述變體包括在D3結構域對應于SEQ ID NO 1的270至359位所示的氨基酸序列中含有不超過2、3、4、5、10或20個氨基酸替換、添加或缺失的變體，所述變體優(yōu)選保持抑制血管新生的能力。在又一個實施方案中，所述替換、添加或缺失位于接頭或連接部分。FGFR-Fc融合蛋白還可包含除了衍生自FGFR胞外區(qū)的部分中以及衍生自免疫球蛋白Fc區(qū)的部分中天然存在的修飾之外的翻譯后修飾。這樣的修飾包括但不限于乙?；?、 羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。結果，經修飾的FGFR-Fc融合蛋白可包含非氨基酸組分，例如聚乙二醇、脂質、多糖或單糖以及磷酸。這樣的非氨基酸組分對FGFR-Fc融合蛋白功能的作用可如本文針對其它FGFR-Fc融合蛋白變體所述的那樣進行測試。當FGFR-Fc 融合蛋白在細胞中產生時，翻譯后加工對于正確折疊和/或蛋白質功能可能也是重要的。 不同的細胞(例如CH0、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)擁有針對這些翻譯后活性的特定細胞機器和特有機制，并且可以選擇不同的細胞以確保FGFR-Fc融合蛋白的正確修飾和加工本文所述的融合蛋白可通過任何本領域已知的方法產生。例如化學合成或從核酸表達來產生?？筛鶕?jù)本領域已知的完善的標準液體或優(yōu)選固相肽合成方法容易地制備用于本發(fā)明的月太(參見，例如 J. M. Stewart 和 J. D. Young，Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford,Illinois (1984), in M. Bodanzsky 禾口 A. Bodanzsky,The Practice of Peptide Synthesis,Springer Verlag,New York(1984))。 可以使用本領域已知技術產生所述融合蛋白以在位于預期包含在所述蛋白中的多肽序列內的半胱氨酸殘基之間形成一個或多個分子內交聯(lián)(參見例如美國專利No. 5478925)。另夕卜，本文所述蛋白質可以通過在所述蛋白質的C端或N端添加半胱氨酸或生物素進行常規(guī)修飾。本文使用的“治療有效量”或“有效量”是指足以顯示其對于所施用對象益處的劑量。施用的實際量，以及施用的速率和時間過程會取決于所治療者的自身情況和嚴重程度。 治療的處方(例如對劑量的決定等)最終是全科醫(yī)生及其它醫(yī)生的責任并依賴其做決定， 通?？紤]所治療的疾病、患者個體的情況、遞送部位、施用方法以及對于醫(yī)生來說已知的其它因素。本發(fā)明人構建了一系列分離的可溶性FGFR-Fc融合蛋白，其可與FGF結合，并有效地抑制FGF誘導的細胞分裂。所述融合蛋白優(yōu)選地包含源自IFS的部分、D2、D3和免疫球蛋白Fc區(qū)。本發(fā)明人還出人意料地發(fā)現(xiàn)，所述源自IFS的部分的長度顯著影響所述融合蛋白與FGF的結合。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含不同長度的源自IFS之部分的融合蛋白。優(yōu)選地，所述源自IFS的部分不包含酸性盒，更優(yōu)選地，其具有與SEQ ID NO 1 第134至162位、145至162位或151至162位對應的氨基酸序列。在一些優(yōu)選實施方案中，其中所述源自IFS的部分具有對應于SEQ ID NO 1第145至162位所示氨基酸序列的融合蛋白具有特別高的FGF親和力，特別有效地抑制FGF誘導的細胞分裂。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了可溶性FGFR-Fc融合蛋白，其包含D1、源自IFS 的部分、D2、D3和免疫球蛋白Fc區(qū)。其中，優(yōu)選地，所述源自IFS的部分不包含酸性盒，更優(yōu)選地，其具有與SEQ ID NO :1第134至162位、145至162位或151至162位對應的氨基酸序列。在又一些實施方案中，本發(fā)明提供了可溶性FGFR-Fc融合蛋白，其包含D1的一部分、源自IFS的部分、D2、D3和免疫球蛋白Fc區(qū)。其中，優(yōu)選地，所述源自IFS的部分不包含酸性盒，更優(yōu)選地，其具有與SEQ ID NO :1第134至162位、145至162位或151至162位對應的氨基酸序列。在再一些實施方案中，本發(fā)明提供了可溶性FGFR-Fc融合蛋白，其由下列組成源自IFS的部分、D2、D3和免疫球蛋白Fc區(qū)。其中，優(yōu)選地，所述源自IFS的部分不包含酸性盒，更優(yōu)選地，其具有與SEQ IDNO :1第134至162位、145至162位或151至162位對應的
氨基酸序列。在又一些實施方案中，本發(fā)明提供了可溶性FGFR-Fc融合蛋白，其自N端至C端依次由下列組成源自IFS的部分、D2、D3和免疫球蛋白Fc區(qū)。其中，優(yōu)選地，所述源自IFS的部分不包含酸性盒，更優(yōu)選地，其具有與SEQ ID NO :1第134至162位、145至162位或 151至162位對應的氨基酸序列。在另一些實施方案中，本發(fā)明提供了 FGFR-Fc融合蛋白，其直接或間接抑制腫瘤細胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白直接抑制腫瘤細胞。更優(yōu)選地，本發(fā)明的FGFR-Fc 融合蛋白抑制腫瘤細胞生長至少10%、20%、30%、40%、50%、80%、90%、95%等。所述腫瘤細胞可以是任何腫瘤細胞，例如白血病、肺癌、肝癌、頭頸癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌等。 特別地，所述抑制通過與腫瘤細胞直接結合來實現(xiàn)。在一些實施方案中，本發(fā)明包括下列項在制備用于治療血管新生所介導或與其相關之疾病的組合物或藥物中的用途，所述項即(i)FGFR-Fc融合蛋白；或者(ii)編碼此融合蛋白的多核苷酸。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明包括下列項在制備用作血管新生抑制劑的藥物中的用途，所述項即(i)FGFR-Fc融合蛋白；或者(ii)編碼此融合蛋白的多核苷酸。在一些實施方案中，本發(fā)明FGFR-Fc融合蛋白可通過在哺乳動物細胞系中表達 SEQ ID NO: 16-22任一項所示的核苷酸序列來產生。特別地，所述哺乳動物細胞系是CHO細胞系。另外，本發(fā)明還提供了如下所述的FGFR-Fc融合蛋白，其中衍生自FGFR胞外區(qū)的部分通過或不通過接頭與免疫球蛋白Fc區(qū)融合。在另一些實施方案中，本發(fā)明包括編碼FGFR-Fc融合蛋白的分離的核酸分子，本發(fā)明還包括這些分子在制備藥物中的用途。所述核酸可以是重組、合成或通過本領域任何可用的方法產生的，所述方法包括使用標準技術的克隆。在又一些實施方案中，本發(fā)明包括含有本發(fā)明的分離核酸分子的載體。所述載體可以是表達載體，所述核酸有效連接到能夠提供所述核酸在宿主細胞中表達的控制序列。 可使用多種載體。例如，合適載體可包括病毒(例如痘病毒、腺病毒、桿狀病毒等)；酵母載體、噬菌體、染色體、人工染色體、質粒、粘粒。在一些實施方案中，本發(fā)明還包括轉染了這些載體的細胞，使得表達FGFR-Fc融合蛋白。適用于本發(fā)明的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。它們包括細菌，例如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞?？墒褂玫牟溉閯游锛毎蛋ǖ幌抻谥袊鴤}鼠卵巢 (CHO)細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑素瘤細胞、猴和人細胞系以及其衍生細胞系，等等。在另一個方面中，本發(fā)明提供了抑制血管新生的方法，其包括向有此需要的對象施用本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白。優(yōu)選地，所述方法在哺乳動物中進行。在另一個方面中，本發(fā)明提供了在體外或體內結合FGF的方法，其包括使FGF與本發(fā)明的融合蛋白相接觸。在又一個方面中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療或預防腫瘤的方法，其包括向有此需要的對象施用本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白，優(yōu)選地其中所述腫瘤是實體瘤。在又一個方面中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療或預防眼中血管新生相關疾病的方法，其包括向有此需要的對象施用本發(fā)明的FGFR-Fc融合蛋白，優(yōu)選地所述眼中血管新生相關疾病是年齡相關黃斑變性。本發(fā)明還涉及FGFR-Fc融合蛋白在制備用于抑制血管新生的藥物中的用途。另夕卜，本發(fā)明還涉及FGFR-Fc融合蛋白在制備用于治療或預防血管新生相關疾病的藥物中的用途，優(yōu)選地所述血管新生相關疾病是腫瘤或者眼中血管新生相關疾病本發(fā)明中所述血管新生相關疾病包括但不限于血管新生依賴性癌癥，其包括例如實體瘤、血源性腫瘤(例如白血病)和腫瘤轉移；良性腫瘤，例如血管瘤、聽神經瘤 (acoustic neuroma)、神經纖維瘤(neurofibroma)、沙目艮(trachoma)禾口化月農性肉芽月中 (pyogenic granuloma)；類風濕性關節(jié)炎；銀屑?。患t變(rubeosis)；奧斯勒-韋伯綜合征 (Osler-ffebber Syndrome)；心肌血管新生(myocardial angiogenesis)；動脈粥樣斑塊新血管形成(plaque neovascularization)；毛細血管擴張(telangiectasia)；血友病性關節(jié)(hemophiliac joint)禾口血管纖維瘤(angiofibroma)。在所述方法的一些實施方案中，可一起(同時)或在不同時間(依次地)施用一種或多種FGFR-Fc融合蛋白。另外，所述融合蛋白可與另一類治療癌癥或抑制血管新生的藥物一起施用。在一些實施方案中，本公開的主題方法可單獨使用?；蛘?，可將所述主題方法與其它用于治療或預防增殖性疾病(例如腫瘤)的常規(guī)抗癌治療法組合使用。例如，這些方法可用于預防癌癥、預防癌癥復發(fā)和手術后轉移，以及作為其它癌癥治療的輔助手段。本公開表明，可通過使用目標多肽治療劑來增強常規(guī)癌癥治療(例如，化療、放療、光療、免疫療法和手術)的有效性。在眼中，血管新生與例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產兒視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity)、年齡相關黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶狀體后纖維增生癥(retrolental fibroplasia)有關。本文公開的FGFR-Fc融合蛋白可在眼內施用或通過其它途徑施用。與眼中血管新生有關的其它疾病包括但不限于流行性角膜結膜炎(epidemic keratoconjunctivitis)、維生素 A 缺乏癥(Vitamin A deficiency)、]^、 形眼鏡過戴(contact lens overwear)、特應性角膜炎(atopic keratitis)、上邊緣角膜炎(superior limbic keratitis)、干燥性翼狀胬肉角膜炎(pterygium keratitis sicca)、舍格倫病(Sjogren)、玫瑰痤瘡(acne rosacea)、小水皰病、梅毒(syphilis)、 分支桿菌感染(Mycobacteria infection)、脂質變性(lipid degeneration)、化學燒傷 (chemical bum)、細菌性潰瘍(bacterial ulcer)、真菌性潰瘍(fungal ulcer)、單純皰疫感染(Herpes simplex infection)、帶狀皰疫感染(Herpes zoster infection)、]^ 生云力物感染(protozoan infection)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、莫倫饋蕩(Mooren ulcer)、Terrie 角月莫邊緣j"生變j"生(Terrien' s marginal degeneration)、邊緣j"生角質分離(mariginal keratolysis)、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性狼疫(systemic lupus)、多動脈炎(polyarteritis) > ^iJ (trauma)、韋格納結節(jié)病(ffegeners sarcoidosis)、鞏膜炎(Scleritis)、史-約病(Steven' s Johnson disease)、類天皰瘡放射狀角膜切開 T^ (periphigoid radial keratotomy)禾口角(corneal graph rejection)、· 狀細胞貧血(sickle cell anemia)、結節(jié)病(sarcoid)、彈性假黃瘤(pseudoxanthoma elasticum)、佩吉特病(Pagets disease)、靜脈阻塞(vein occlusion)、動脈阻塞(artery occlusion)、頸動脈阻塞性疾病(carotid obstructive disease)、慢性葡萄膜炎/玻璃體炎(chronic uveitis/vitritis)、分支桿菌感染(mycobacterial infections)、萊姆病(Lyme' s disease)、系統(tǒng)性紅斑狼疫(systemic lupus erythematosis)、早產兒視 NII^I (retinopathy of prematurity) > Sjr^f (Eales disease) > SS^f (Bechetsdisease)、導致視網(wǎng)膜炎(retinitis)或脈絡膜炎(choroiditis)的感染、假定的眼組織胞菜菌病(presumed ocular histoplasmosis)、貝斯特病(Bests disease)、近視(myopia) > 視凹(optic pit)、斯達加特病(Stargarts disease)、睫狀體平坦部炎(pars planitis)、 f# U _ H 月兌胃(chronic retinal detachment)、！^ _占 if 胃☆ IE (hyperviscosity syndromes)、弓形體病(toxoplasmosis)、創(chuàng)傷(trauma)和激光手術后并發(fā)癥(post-laser complication)。其它疾病包括但不限于與紅變(角新生血管(neovasculariation of the angle))有關的疾病以及由纖維血管(fibrovascular)或纖維組織(fibrous tissue)異常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃體視網(wǎng)膜病(vitreoretinopathy)。 施用
本發(fā)明中的融合蛋白可以單獨施用，但優(yōu)選地作為藥物組合物施用，其通常包括根據(jù)施用的計劃方式所選的適合的藥物賦形劑、稀釋劑或載體。融合蛋白可以通過任何適合的方式適用于需要治療的患者。精確的計量將取決于多個因素，包括該融合蛋白精確的性質。一些合適的使用方式包括(但不限于)口服、直腸、鼻部、局部(包括口腔和舌下)、皮下、陰道或胃腸外的(包括皮下、肌肉、靜脈、皮內、鞘內和硬腦膜外)施用。對于靜脈注射和在病痛位置的注射，活性成分將為一種胃腸外接受的水溶液形式，其不含熱源并具有合適的PH值、等張性和穩(wěn)定性。本領域中相關技術人員使用，例如等張賦形劑如氯化鈉注射液、林格氏注射液， 乳酸林格氏注射液，能夠很好的制備適合的溶液。根據(jù)要求，可以加入防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖齊 、抗氧化劑和/或其它一些添加劑?？诜┯玫乃幬锝M合物可以是片劑、膠囊、粉劑或口服液等形式。片劑可以包括固體載體，如明膠或輔劑。液體藥物組合物通常包括液體載體， 如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。也可以包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇類，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。以上所提到的技術和方案的例子以及其它一些根據(jù)本發(fā)明所使用的技術和方案可以在 Remington' s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo, A. (ed)，1980.中找到。
融合蛋白質的克隆和表達質粒構建FGF受體片段通過PCR從相應受體的cDNA模板擴增獲得，IgGlFc片段通過PCR方法從人源IgGl的cDNA擴增獲得。在設計PCR引物時，在不同的片段間引入連接序列，使不同片段最后可以通過重疊PCR相連接，形成不同融合蛋白的閱讀框，同時在cDNA的兩端分別加上BspE I、Pst I內切酶的位點。不同融合蛋白的cDNA經過BspE I、Pst I酶切后可以克隆到表達質粒?？寺『蟮馁|粒經過內切酶消化、電泳鑒定，最后經過DNA測序確定。
融合蛋白質的表達與純化本發(fā)明的融合蛋白可通過本領域常用的技術表達和純化。用Qiagen的質粒提純試劑盒(MAX)提純相應融合蛋白質粒的DNA，用紫外分光光度法確定質粒DNA的濃度，用 FUGENE 6脂質體(Roche)將質粒轉染CHO細胞。轉染的具體方法按照產品說明。根據(jù)蛋白表達量的要求不同，本研究采用兩種表達方法進行蛋白表達第一種是瞬時表達法，通常在轉染48-72小時后收獲含有融合蛋白的培養(yǎng)液上清，用人IgG ELISA確定融合蛋白的相對含量，從而快速有效得到融合蛋白；第二種方法是建立穩(wěn)定細胞系，采用重組蛋白藥物表達生產常用的DHFR缺陷型CHO細胞表達系統(tǒng)，基本過程包括細胞的轉染、穩(wěn)轉細胞選擇、克隆篩選、加壓擴增、培養(yǎng)基和工藝優(yōu)化等，最終實現(xiàn)CHO工程細胞株在無血清培養(yǎng)基中大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。收集培養(yǎng)產物，用Protein A親和層析柱純化融合蛋白。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠法(SDS-PAGE)分析純化的蛋白質，然后合并含有所需表達產物的洗脫物，用孔徑0. 22 μ m濾膜過濾后，用Lowry法等多種方法進行蛋白定量。本研究的CHO細胞培養(yǎng)體積將達到10升生物反應器規(guī)模，純化獲得的融合蛋白能夠滿足動物試驗的蛋白需要，也為將來進一步工藝放大打下基礎
在蛋白水平驗證融合蛋白對FGF的中和作用在獲得CHO表達的融合蛋白質后，本研究將在蛋白水平上對融合蛋白與FGF的結合能力進行評估。本研究使用結合實驗和親和力實驗進行驗證，結合實驗的步驟包括先在96孔ELISA板上包被FGF-2后，用BSA封閉包被孔，加入相同濃度的各種融合蛋白，洗滌后再加入抗人IgGFc-HRP 二抗，顯色、終止后于酶標板上讀取450nm波長的吸光度，根據(jù)信號的強弱，篩選與FGF-2具有結合能力的融合蛋白。親和力實驗是為了確定融合蛋白在溶液體系中與FGF-2的親和力，首先在96孔ELISA板上分別包被FGF-2捕獲抗體，用BSA封閉包被孔，然后加入事先配制好且孵育過的融合蛋白與FGF-2的混合液和梯度稀釋的標準品，孵育后再加入HRP標記的檢測抗體(利用能特異性地檢測游離VEGF或FGF-2抗體2)， 顯色、終止后于酶標板上讀取450nm波長的吸光度，從而檢測出融合蛋白與FGF-2的混合液中游離的FGF-2的相對濃度確定。通過以上實驗，篩選得到對FGF-2具有阻斷作用的融合蛋白。
在細胞水平上驗證融合蛋白對FGF的中和作用在蛋白水平確定融合蛋白對FGF-2的結合能力后，本研究將從細胞水平進一步驗證其對血管新生的抑制作用。本研究用人臍帶靜脈血管內皮細胞(HUVEC)分裂試驗和 HUEVC細胞遷移試驗檢驗融合蛋白抑制血管內皮細胞分裂、遷移的能力。HUVEC細胞分裂試驗能檢驗融合蛋白抑制HUVEC細胞分裂的能力，實驗時，首先在96孔板中每孔接種3000 個HUVEC細胞于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別加入FGF-2，以及不同濃度的融合蛋白和 FGF-2的混合液，繼續(xù)培養(yǎng)3 4天后，加入10% CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)2小時后于酶標板上讀取 450nm波長的吸光度?？筛鶕?jù)吸光度的差異評估其抑制FGF-2誘導的血管內皮細胞分裂的能力，并可得出融合蛋白對FGF-2抑制的半數(shù)有效濃度。HUVEC細胞遷移試驗能檢驗融合蛋白抑制HUVEC細胞遷移的能力，實驗時，首先在上室接種50000個HUVEC細胞和不同濃度的融合蛋白，在下室加入600 μ L含有FGF-2的培養(yǎng)液，于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 24小時后，擦除上室膜正面細胞，固定、染色膜背面細胞，PBS洗滌后于倒置顯微鏡觀察并計數(shù)，通過計數(shù)位于膜背面的HUVEC細胞數(shù)即可知HUVEC細胞受FGF-2刺激而遷移的情況， 而在培養(yǎng)液加入不同濃度的融合蛋白即可檢驗融合蛋白抑制血管內皮細胞遷移的能力。通過以上實驗，可驗證本研究構建的新型融合蛋白抑制FGF-2誘導的血管內皮細胞分裂和遷移的能力，同時為進一步的動物試驗打下基礎。
腫瘤模型驗證融合蛋白抑制腫瘤生長的能力當?shù)鞍姿胶图毎降脑囼炞C明本研究的新型融合蛋白對FGF-2信號具有阻斷作用后，本研究將在動物腫瘤模型上檢驗其抗腫瘤能力。本研究將采用血管新生和腫瘤藥物研究中常用的模型驗證融合蛋白抗血管新生和抗腫瘤效果，例如LLC小鼠肺癌、U87膠質細胞瘤、B16黑色素瘤等。在動物試驗中，除了常規(guī)的對照組外，還包括同類藥物對照，如 VEGF-Trap,FP-1039,以期得到抗腫瘤能力的比較性數(shù)據(jù)。實驗時，100 μ L適當數(shù)量的腫瘤細胞皮下注入C57小鼠的背部后方一側，每周兩次用游標卡尺測量腫瘤的體積，腫瘤長到約200立方毫米時，皮下注射不同濃度的融合蛋白，2 3周后處死小鼠，用游標卡尺測量腫瘤的體積，根據(jù)腫瘤的大小驗證融合蛋白的抗腫瘤效果。此外，使用免疫組化等方法分析各種腫瘤組織，探討血管新生的調控機理。
實施例
實施例1 =FGFRl-Fc融合蛋白重組表達質粒的構建
FGF受體片段通過PCR從FGF受體的cDNA模板擴增獲得，IgGlFc片段通過PCR方法從人源IgGl的cDNA擴增獲得。使用商業(yè)化的cDNA(PCR Ready First Strand cDNA，來源于成年人結腸癌組織，BioChain公司)作為FGFRl片段的模板。使用人血RNA抽提試劑盒 (QIAGEN公司)從健康人血液中抽提總RNA。按逆轉錄試劑盒(Promega公司)的使用說明， 用M-MLV逆轉錄酶(Promega公司)進行RT-PCR，將RNA逆轉錄為cDNA作為擴增IgGl Fc片段的模板。RT-PCR根據(jù)逆轉錄試劑盒的使用說明進行，具體步驟為將Oligo dT、dNTP、總 RNA以及DEPC H2O混勻，于70°C反應10分鐘后置冰上5分鐘，再加入RNA酶抑制劑、M-MLV 逆轉錄酶和反應緩沖液，42°C反應1小時，然后于70°C反應15分鐘，獲得cDNA可作為模板使用。以成年人結腸癌組織cDNA為模板通過PCR擴增各個不同的FGFRl片段(引物見下表1)，以人血cDNA為模板通過PCR擴增IgGl Fc片段(引物見下表1和2)。PCR的反應條件是98°C預變性5分鐘，98°C變性30秒，然后于56°C退火45秒，并于72°C延伸2分鐘， 共進行30次循環(huán)，最后再延伸10分鐘。在設計PCR引物時，在FGFRl片段和IgGl Fc片段間引入20個或以上的互補堿基序列作為連接序列，使FGFRl片段和IgGl Fc片段隨后可以通過重疊PCR相連接，形成不同融合蛋白的閱讀框，同時在PCR產物兩端分別加上BspE I 和Pst I限制性內切酶的位點。隨后，進行重疊PCR，擴增得到各個FGFRl-Fc融合蛋白片段。重疊PCR的反應分為兩輪，第一輪含有需連接的片段而不含有引物，條件為98°C預變性5分鐘，98°C變性30秒， 然后于56°C退火45秒，并于72°C延伸5分鐘，共進行6次循環(huán)，最后再于72°C延伸10分鐘后加入兩端引物進行第二輪PCR，反應條件為98°C預變性5分鐘，98°C變性30秒，然后于 56°C退火45秒，并于72°C延伸2分鐘，共進行30次循環(huán)，最后再于72°C延伸10分鐘，從而拼接形成不同融合蛋白的閱讀框，同時在cDNA的兩端分別加上BspE I和Pst I限制性內切酶的位點。擴增完成后，使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司)純化PCR擴增的片段，不同融合蛋白的cDNA和真核表達質粒pSV2-dhfr (ATCC)分別用BspE I、Pst I酶切，然后使用90V的電壓進行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick膠提取試劑盒(QIAGEN公司) 回收目的片段后使用連接酶(NEB公司)于16°C連接1小時，將連接反應混合物轉化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細菌，轉化條件為42°C反應90秒后再置冰上3分鐘，加入無菌無抗的LB 培養(yǎng)液于37°C、250轉/分鐘搖床中培養(yǎng)1小時后涂布于含有氨芐青霉素的LB平板中，于 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液于37°C、250轉/ 分鐘搖床中培養(yǎng)過夜后使用堿裂解法抽取質粒，經限制性內切酶酶切后使用90V電壓進行瓊脂糖凝膠電泳，取酶切鑒定正確的重組質粒進行DNA測序確定。根據(jù)以上步驟，分別構建了 FGFRl-Fc融合蛋白的表達質粒19#、13#、22#、23#、26#、29#和8#。各個融合蛋白中 FGFRl-Fc的蛋白質序列和編碼其的核苷酸序列在表3中顯示。融合蛋白的結構示意圖見圖
Io
權利要求
1.一種分離的可溶性成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的融合蛋白，其包含源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列(IFS)的部分、FGFR第二 Ig樣結構域(D2)、FGFR第三Ig樣結構域(D3)和免疫球蛋白Fc區(qū)。
2.權利要求1的融合蛋白，其在體內和/或在體外結合成纖維細胞生長因子(FGF)，優(yōu)選結合TOF2。
3.前述任一項權利要求的融合蛋白，其中所述源自IFS的部分包含或不包含酸性盒 (AB)，優(yōu)選地所述IFS部分不包含酸性盒。
4.前述任一項權利要求的融合蛋白，其中所述源自IFS的部分具有與SEQID N0:1第 134至162位、145至162位或151至162位對應的氨基酸序列。
5.前述任一項權利要求的融合蛋白，其還包含F(xiàn)GFR第一Ig樣結構域(Dl)或其一部分。
6.權利要求5的融合蛋白，其中所述FGFR第一Ig樣結構域或其一部分具有SEQ ID NO :1第40至118位的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :1第40至118位的序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；或者SEQ ID NO :1第77至118位的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :1第77至118位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
7.前述任一項權利要求的融合蛋白，其中所述D2結構域具有SEQ ID NO :1第163至247位的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 1第163至247位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80 %、90 %、93 %、95 %、 97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；和/或所述D3結構域具有SEQ ID NO :1第270至359位的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 1第270至359位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80 %、90 %、93 %、95 %、 97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
8.前述任一項權利要求的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū)是人IgG優(yōu)選人IgGl 的Fc區(qū)，優(yōu)選地其具有SEQ ID NO :7的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :7的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；或者SEQ ID NO :8的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO :8的核苷酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
9.前述任一項權利要求的融合蛋白，其所包含的部分、結構域和/或區(qū)域之間直接連接和/或通過接頭連接。
10.前述任一項權利要求的融合蛋白，其包含衍生自FGFR胞外區(qū)的部分和免疫球蛋白 Fc區(qū)，其中所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分(1)具有 SEQ ID NO :9 第 358-580 位、SEQ ID NO 10 第 304-5 位、SEQ ID NO: 11 第 278-500 位、SEQ ID NO 12 第 246-468 位、SEQ IDNO 13 第 235-457 位、SEQ ID NO 14 H 2四-451位和SEQ ID NO 15第224-446位任一項中所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO 16第 1074-1740 位、SEQ ID NO 17 第 912-1578 位、SEQ ID NO 18 第 834-1500 位、SEQID NO: 19 第 738-1404 位、SEQ ID NO 20 第 705-1371 位、SEQ ID NO 21 第 687-1353 位和 SEQ ID NO 22第672-1338位任一項中所示核苷酸序列編碼；(2 )包含與SEQ ID NO 9 第 358-580 位、SEQ ID NO 10 第 304-526 位、SEQ ID NO 11 第 278-500 位、SEQ ID NO 12 第 246-468 位、SEQ IDNO :13 第 235-457 位、SEQ ID N0:14 第 229-451位和SEQ ID NO :15第224-446位任一項中所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性；或者(3)包含由與SEQ ID NO 16 H 1074-1740 位、SEQ ID NO 17 H 912-1578 位、SEQ ID NO 18 第 834-1500 位、SEQ ID NO 19 第 738-1404 位、SEQ ID NO 20 第 705-1371 位、SEQ ID NO 21第687-1353位和SEQID NO 22第672-1338位任一項中所示核苷酸序列有至少 70%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、 95%、97%、98%或 99% 同一性。
11.前述任一項權利要求的Fc融合蛋白，所述蛋白(1)包含SEQID NO :9-15任一項所示氨基酸序列或由其組成，或由SEQ ID NO 16-22 任一項所示核苷酸序列的核酸分子編碼；(2)包含與SEQID NO :9-15任一項所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性；或者(3)包含由與SEQID NO :16-22任一項所示核苷酸序列有至少70%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列或由其組成，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99% 同一性。
12.前述任一項權利要求的融合蛋白，其在體外和/或體內結合FGF，優(yōu)選結合FGF2。
13.編碼前述任一項項融合蛋白的分離的核酸分子。
14.權利要求13的核酸分子，其包含SEQID NO 16-22任一項所示核苷酸序列。
15.包含權利要求13或14的核酸分子的載體。
16.用權利要求15的載體轉染的細胞，優(yōu)選CHO細胞。
17.一種藥物組合物，其包含權利要求1-12任一項的融合蛋白、權利要求13或14的核酸分子、權利要求15的載體或者權利要求16的細胞，以及可藥用載體。
18.—種生產抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通過在原核細胞或真核細胞尤其是哺乳動物細胞系中表達權利要求1-12中任一項的融合蛋白來進行，優(yōu)選地所述哺乳動物細胞系是CHO細胞系。
19.權利要求1-12任一項的融合蛋白、權利要求13或14的核酸分子、權利要求15的載體、權利要求16的細胞和/或權利要求17的藥物組合物在制備用于在哺乳動物中抑制血管新生的藥物中的用途。
20.權利要求1-12任一項的融合蛋白、權利要求13或14的核酸分子、權利要求15的載體、權利要求16的細胞和/或權利要求17的藥物組合物在制備用于治療或預防腫瘤的藥物中的用途，例如所述腫瘤是實體瘤，優(yōu)選地其中治療或預防腫瘤是通過抑制血管新生和/或直接抑制腫瘤細胞實現(xiàn)的。
21.—種在對象中抑制血管新生的方法，其包括向有此需要的對象施用有效量的權利要求1-12任一項的融合蛋白、權利要求13或14的核酸分子、權利要求15的載體、權利要求16的細胞和/或權利要求17的藥物組合物。
22.—種在對象中治療或預防腫瘤的方法，其包括向有此需要的對象施用有效量的權利要求1-12任一項的融合蛋白、權利要求13或14的核酸分子、權利要求15的載體、權利要求16的細胞和/或權利要求17的藥物組合物，例如所述腫瘤是實體瘤，優(yōu)選地其中治療或預防腫瘤是通過抑制血管新生和/或直接抑制腫瘤細胞實現(xiàn)的。
23.一種在體外或在體內結合FGF的方法，其包括使FGF與權利要求1_12中任一項的融合蛋白相接觸。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及疾病的治療，尤其是與FGF過度表達相關的疾病的治療。具體地，本發(fā)明涉及FGFR-Fc融合蛋白及其在治療與血管新生調控相關的疾病中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及分離的可溶性FGFR-Fc融合蛋白及其在制備用于治療與血管新生調控相關的疾病的藥物中的應用。
文檔編號A61P35/00GK102219860SQ201110132218
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權日2011年5月20日
發(fā)明者房健民, 李棟 申請人:煙臺榮昌生物工程有限公司