專利名稱：動物源型陽離子抗菌肽的制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物保健品生產(chǎn)及應用研究領(lǐng)域，具體涉及動物源型陽離子抗菌肽的制備方法及其應用。
背景技術(shù)：
隨著對抗菌肽研究的日益深入，其獨特的抗菌作用已引起人們的高度重視，國內(nèi)有關(guān)抗菌肽的專利有3項，內(nèi)容主要涉及抗菌肽抗微生物病原體感染和抗菌肽用于保鮮技術(shù)等；國外僅法國Entomcd公司已獲多項專利申請，并在世界范圍內(nèi)使用這些新肽進行人體疾病的治療?，F(xiàn)在許多抗菌肽已進入II期或III期臨床實驗。以上專利和發(fā)明都是基于植物、昆蟲或者人源型的抗菌肽，由于種屬之間的差別， 這些蛋白對于禽和動物來說安全性和有效性都還沒有得到證實。但可以為我們研究動物源型陽離子抗菌肽提供參考。陽離子抗菌肽作為畜禽體本身固有的先天性非特異性防御體系的重要組成成分， 在農(nóng)業(yè)上的應用主要有2個方面，一是取代或部分取代目前喂養(yǎng)動物所用的抗生素，減少動物養(yǎng)殖中對抗生素的依賴，并減少畜禽產(chǎn)品中藥物殘留。二是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將廣譜抗菌肽基因?qū)雱又参矬w內(nèi)，增加動植物對各種病原菌的抵抗能力。細菌性感染的防治是長期以來困擾人們的一個重要難題，特別是細菌耐藥性的出現(xiàn)，更突出了問題的復雜性和解決問題的迫切性。由于陽離子抗菌肽作用機理獨特，體外未有耐藥菌株產(chǎn)生，且許多陽離子抗菌肽的抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌及陰性菌均有作用，使它極可能成為傳統(tǒng)抗生素的理想替代品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種動物源型陽離子抗菌肽的制備方法，并提供了此種陽離子抗菌肽替代抗生素在畜禽疾病防治中的應用。本發(fā)明的技術(shù)原理為根據(jù)基因工程原理和陽離子抗菌肽抗菌機制進行研制和應用。本發(fā)明的制備方法如下(1)抗菌肽基因設(shè)計與優(yōu)化Jurgen Fink等在對抗菌肽結(jié)構(gòu)類似物的研究中發(fā)現(xiàn)，用人工合成基因方法的雜合抗菌肽，其殺菌活性遠高于母體，抗菌譜也有所增加。因此我們將兩種動物源型抗菌肽的氨基酸殘基片段雜合在一起，，選用基因工程菌偏愛密碼子即高表達基因常用密碼進行氨基酸編碼，再借助DNA分析軟件對其中不合適的部分密碼子串聯(lián)組織進行適當修改調(diào)整、優(yōu)化，最終我們得到優(yōu)化好的抗菌肽gal-sphe的核苷酸和氨基酸序列如下抗菌肽gal-sphe 核苷酸序列(SEQ ID NO. 1) ATGGGTATCTTCCTGCTGTTCCTGGTTCTGCTGGCTGTTCCGCAGGCTGC
TCCGGAATCTGACACCGTTACCTGCCGTCTGCGTCGTGGTTTCTGCGCTC
GTGGTCGTTGCCGTTTCCCGTCTATCCCGATCGGTCGTTGCTCTCGTTTCGTTCAGTGCTGCCGTCGTGTTTGG編碼多肽序列(SEQ ID NO. 2)MGIFLLFLVLLAVPQAAPESDTVTCRLRRGFCARGRCRFPSIPIGRCSRFVQCCRRVff(2)抗菌肽基因的克隆將得到的抗菌肽基因片段(gal-sphe)克隆到已經(jīng)選擇好的載體IMPACT-CN，然后將質(zhì)粒(IMPACT-CN)轉(zhuǎn)化進入基因工程菌(ER2566)，在含有氨芐青霉素和X-gal、IPTG的培養(yǎng)基上培養(yǎng)(37°C，12-16小時)，篩選出含有重組質(zhì)粒 (IMPACT-CN-gal-sphe)的菌落，并將菌落在4°C保存。所述含有氨芐青霉素和X-gal、IPTG的培養(yǎng)基優(yōu)選為含有100 μ g/ml氨芐青霉素和涂布有 20mg/ml X-galUmM/ml IPTG 的培養(yǎng)基(Tryptone (胰蛋白胨):10g/L，Yeast Extract (酵母提取物):5g/L，NaCl (氯化鈉)10g/L，Agar (瓊脂):15g/L)0(3)抗菌肽的表達與純化挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素 100 μ g/ml)，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600達0. 5-0. 7 ；加入終濃度為0. 3mM的IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)池，誘導蛋白表達；5000Xg，4°C離心10分鐘收集菌體；用裂解緩沖液將菌體重懸，冰浴， 超聲破碎細胞，使蛋白釋放；使用Chitin柱對蛋白進行純化。(4)體外抑菌試驗本課題采用測定體外最小抑菌濃度的方法鑒定所得到的抗菌肽抗菌活性，檢測抗菌肽活性所用的菌種購于中國獸藥監(jiān)察所菌種中心和中國科學院微生物研究所菌種中心，分別為革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus) CMC(^6003，枯草桿菌(Bacillus subtilis)DB430，短小芽孢桿菌(Bacillus pum ilus)CMCC63202，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC28001 ；革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC8099,乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi2B) CMCC50094。采用96孔板法檢測抗菌肽的最小抑菌濃度。最小抑菌濃度見表1。表1本發(fā)明抗菌肽對各菌種的最小抑菌濃度
檢測菌種MIC(mg/L)Staphylococcus aureus CMCC2600364Bacillus subtilis DB43054Bacillus pumilus CMCC6320242Micrococcus luteus CMCC2800147Escherichia coli ATCC809964Salmonella paratyphi2B CMCC5009460本試驗證明陽離子抗菌肽具有廣譜抗菌作用和很高的抗菌活性，可以替代抗生素防治畜禽細菌性感染，為臨床上新型抗菌藥的開發(fā)展示了新途徑。
本發(fā)明的有益效果是(1)鑒于畜禽抗菌肽基因序列及相關(guān)內(nèi)容國內(nèi)外尚未報道，根據(jù)畜禽抗菌肽序列定向修改、設(shè)計生物基因的方法，并借助計算生物學手段優(yōu)化密碼子設(shè)計其編碼序列；(2)選用IMPACT-CN表達載體，克隆后的多肽核苷酸序列(gal-sphe)將與質(zhì)粒載體(IMPACT-CN)中的殼多糖序列形成一種融合基因序列，以利于其后的純化工作。(3)制約抗菌肽推廣應用的瓶頸是抗菌肽從融合表達體系中高效分離純化的技術(shù)，本研究所獲得的融合蛋白(gal-sphe-intein)由于含有一段叫做htein(蛋白質(zhì)的內(nèi)含子)的序列，而能夠在還原的環(huán)境下進行自我裂解，從而將陽離子抗菌多肽釋放出來，與以前的方法相比較，這種方法能夠在重組陽離子多肽的發(fā)酵生產(chǎn)及純化過程中節(jié)省大量的昂貴蛋白酶，此外，本系統(tǒng)采用的質(zhì)粒載體重組蛋白表達成一種可溶性形式，而不是包涵體，從而省去了復性等一系列煩雜的步驟。(4)所表達的陽離子抗菌肽可提高肉雞和仔豬的飼料報酬和養(yǎng)殖利潤。
具體實施例方式實施例一將抗菌肽gal linacin 14N端1-24氨基酸殘基片段 (MGIFLLFLVLLAVPQAAPESDTVT(SEQ ID NO. 3))和抗菌肽Spheniscin_2C端5-38氨基酸殘基片段(CRLRRGFCARGRCRFPSIPIGRCSRFVQCCRRVW(SEQ ID NO. 4))雜合(即將兩個片段連接起來)在一起，得到氨基酸序如下MGIFLLFLVLLAVPQAAPESDTVTCRLRRGFCARGRCRFPSIPIGRCSR FVQCCRRVW。根據(jù)上述氨基酸序列，選用基因工程菌偏愛密碼子即高表達基因常用密碼進行氨基酸編碼，再借助DNA分析軟件對其中不合適的部分密碼子串聯(lián)組織進行適當修改調(diào)整、 優(yōu)化(即選擇表達該蛋白的宿主菌偏好使用的氨基酸密碼子，以提高表達效率)，最終我們得到優(yōu)化好的抗菌肽gal-sphe的核苷酸序列和氨基酸序列如下?？咕膅al-sphe 核苷酸序列(SEQ ID NO. 1)ATGGGTATCTTCCTGCTGTTCCTGGTTCTGCTGGCTGTTCCGCAGGCTGCTCCGGAATCTGACACCGTTACCTGCCGTCTGCGTCGTGGTTTCTGCGCTCGTGGTCGTTGCCGTTTCCCGTCTATCCCGATCGGTCGTTGCTCTCGTTTCGTTCAGTGCTGCCGTCGTGTTTGG編碼多肽序列(SEQ ID NO. 2)MGIFLLFLVLLAVPQAAPESDTVTCRLRRGFCARGRCRFPSIPIGRCSRFVQCCRRVff實施例二抗菌肽基因的克隆將得到的抗菌肽基因片段(gal-sphe)，克隆到已經(jīng)選擇好的載體IMPACT-CN，然后將質(zhì)粒(IMPACT-CN)轉(zhuǎn)化進入基因工程菌(ER2566)，在含有100 μ g/ ml氨芐青霉素和涂布有20mg/ml X-galUmM/ml IPTG的培養(yǎng)基(Tryptone (胰蛋白胨) 10g/L，Yeast Extract (酵母提取物):5g/L，NaCl (氯化鈉):10g/L，Agar 瓊脂 15g/L)上培養(yǎng)(37°C，12-16小時)，篩選出含有重組質(zhì)粒(IMPACT-CN-gal-sphe)的菌落，并將菌落在 4°C保存。
實施例三抗菌肽的表達與純化1.細菌培養(yǎng)可直接取一個單菌落，加入IL LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素 100 μ g/ml)，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600達0. 5-0. 7。注可挑取新轉(zhuǎn)化有重組表達質(zhì)粒的單菌落，先接種于IOml液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100yg/ml)，37°C振蕩培養(yǎng)3_4h，后接種于 IL液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100 μ g/ml)，37°C培養(yǎng)至0D600達0. 5。2.誘導蛋白表達加入終濃度為0. 3mM的IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)池，誘導蛋白表達。 設(shè)立陰性對照。取樣10-20 μ 1進行SDS-PAGE電泳，取樣1_2 μ 1進行^festern blot鑒定。3.細胞收集5000Xg，4°C離心10分鐘，棄上清。-20/_80°C貯存。將細胞凍融以利于破碎。以下步驟4-9除有特殊注明以外，均應4°C操作。4.破碎細胞用 50ml 適當?shù)牧呀饩彌_液(IOmM Tris-HCl, pH8. 5,0. 5Μ NaClor Buffer Bi)將菌體重懸，冰浴，超聲破碎細胞，使蛋白釋放。19000 X g離心30分鐘，上清即為澄清的細胞粗提物。5. Chitin 柱的平衡將 24ml chitin beads (15ml 柱床體積)倒入 2. 5 X IOcm 柱中，10個柱床體積的相應緩沖液(同步驟4用液)4°C進行柱平衡。注=Chitin的用量由融合蛋白的總量來決定，每毫升柱床體積能夠結(jié)合3士0. Img蛋白，因此一升培養(yǎng)菌所獲得的 45士 Img融合蛋白大約需要15ml柱床體積的樹脂。6. Chitin柱將澄清的細胞粗提物緩慢加入Chitin柱，流速為0. 5-1. Oml/min。 取少量流過液進行SDS-PAGE電泳，并與細胞粗提物的電泳進行比較，觀察親和柱的蛋白結(jié)合效率。上柱前可將細胞粗提物與Column Buffer按比例1 2_1 5混合稀釋，以提高
蛋白結(jié)合效率。7.洗柱用SOOmL(至少20倍柱床體積)的緩沖液徹底洗柱，由于CBD和 Chitinbeads的結(jié)合力很強，洗柱時可以用較高的流速(如2-3ml/min)和更苛刻的洗柱條件(如高鹽IMNaCl和/或非離子性去污劑)。8.誘導htein的自我裂解活性用3倍柱床體積的Buffer B3 (含30_50MmDTT) 洗柱，用柱帽堵上，4°C放置過夜。用于IPL連接反應的目標蛋白(C末端帶有硫酯鍵)則需用 Buffer B4(含 MESNA)誘導 intein 的裂解。9.目標蛋白的洗脫次日，用3倍柱床體積的Buffer Bl或相應的誘裂解 Bufferf (-DTT)，將目的蛋白洗脫收集。大約收集10管，每管5ml (1/2柱床體積)。實施例四(一 )提高肉雞飼料轉(zhuǎn)化率和養(yǎng)殖利潤的試驗1、試驗動物白羽肉雞3000只，隨機分為3組，每組1000只。2、實驗藥物根據(jù)本專利方法制備的陽離子抗菌肽。3、實驗方法1組為空白對照組，不用任何藥物。2組陽離子抗菌肽組，用法日糧(玉米60. 2 %，麥麩3 %，豆粕30 %，磷酸氫鈣 1. 3%，石粉1.2%，食鹽0.3%，油3%，添加劑1%)中長期(整個飼養(yǎng)周期)添加5mg/kg。
3組用鹽酸林可霉素，用法日糧(玉米60. 2 %，麥麩3 %，豆粕30 %，磷酸氫鈣 1. 3%，石粉1.2%，食鹽0.3%，油3%，添加劑)中長期(整個飼養(yǎng)周期)添加；Mmg/
kg ο屠宰后稱重，計算料肉比和利潤。有明顯效果與鹽酸林可霉素用藥組相比，料肉比低或者相同，利潤高或者相同有效果料肉比比鹽酸林可霉素用藥組高，比空白組低；利潤比鹽酸林可霉素用藥組低，比空白組高。無效料肉比比空白組高，利潤比空白組低。試驗結(jié)果如表2所示表2 料肉比及毛利對比試驗結(jié)果
空白組鹽酸林可霉素組陽離子抗菌肽組料肉比2.562.031.98毛利2.012.683.154、結(jié)論日糧中按照5mg/kg長期添加陽離子抗菌肽時，可顯著提高飼料報酬和利潤率。( 二)提高仔豬飼料轉(zhuǎn)化率試驗1、試驗動物20 50kg的仔豬160頭，隨機分為2組，每組80只。2、實驗藥物根據(jù)本專利方法制備的陽離子抗菌肽。3、實驗方法1組陽離子抗菌肽組，用法日糧(玉米50%，麥麩22%，黃豆4%，菜籽餅8%，蠶蛹10%，魚粉3.5%，骨粉1.4%，鈣粉0.5%，食鹽0.3%，復合添加劑0.3% )中長期(30 天)添力口 5mg/kg。2組用硫酸粘菌素，用法日糧(玉米50%，麥麩22%，黃豆4%，菜籽餅8%，蠶蛹 10%，魚粉3. 5%，骨粉1. 4%，鈣粉0. 5%，食鹽0. 3%，復合添加劑0. 3% )中長期(30天) 添加 20mg/kg。記錄試驗初體重、試驗末體重、料肉比。試驗結(jié)果如表3所示表3 兩組初體重、末體重及料肉比對比試驗結(jié)果處理對照組 (硫酸粘菌素20mg/kg)陽離子抗菌肽組 (5 mg/kg)始重，kg29.3829.68末重，kg47.2747.83日增重，g639.10648.20日釆食量，kg1.341.31料肉比2.102.06 4、結(jié)論日糧中按照5mg/kg長期添加陽離子抗菌肽時，可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率。
權(quán)利要求
1.一種動物源型陽離子抗菌肽，其為抗菌肽gal-sphe，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所述。
2.權(quán)利要求1所述動物源型陽離子抗菌肽的制備方法，其特征是，(1)抗菌肽基因的克隆將權(quán)利要求1所述的抗菌肽gal-sphe基因克隆到載體 IMPACT-CN，然后將質(zhì)粒IMPACT-CN轉(zhuǎn)化進入基因工程菌ER2566，在含有氨芐青霉素和 X-gal、IPTG的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時間為12-16小時，篩選出含有重組質(zhì)粒 IMPACT-CN-gal-sphe的菌落，并將菌落在4°C保存；(2)挑取單菌落于含有氨芐青霉素100yg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至 0D600達0. 5-0. 7 ；加入終濃度為0. 3mM的IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)3h，誘導蛋白表達；5000 X g， 4°C離心10分鐘收集菌體；用裂解緩沖液將菌體重懸，冰浴，超聲破碎細胞，使蛋白釋放；使用Chitin柱對蛋白進行純化。
3.如權(quán)利要求2所述的動物源型陽離子抗菌肽的制備方法，其特征是，所述含有氨芐青霉素和X-gal、IPTG的培養(yǎng)基為含有100 μ g/ml氨芐青霉素和涂布有20mg/ml X_gal、 ImM/ml IPTG的培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂 15g/L0
4.權(quán)利要求1所述的動物源型陽離子抗菌肽在防治畜禽細菌性感染方面的應用。
5.權(quán)利要求1所述的動物源型陽離子抗菌肽在降低料肉比，提高飼料報酬方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了動物源型陽離子抗菌肽的制備方法及其應用。本發(fā)明將SEQ ID NO.1所述的陽離子抗菌肽基因克隆到載體，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入基因工程菌，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-16小時，篩選出含有重組質(zhì)粒的菌落；挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600達0.5-0.7；加入IPTG，振蕩培養(yǎng)3h，誘導蛋白表達；4℃離心10分鐘收集菌體；用裂解緩沖液將菌體重懸，冰浴，超聲破碎細胞，使蛋白釋放；使用Chitin柱對蛋白進行純化。試驗證明本發(fā)明陽離子抗菌肽具有廣譜抗菌作用和很高的抗菌活性，可以替代抗生素防治畜禽細菌性感染，為臨床上新型抗菌藥的開發(fā)展示了新途徑。
文檔編號A61P31/04GK102229666SQ20111014047
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者劉思當, 汪安國, 王尚明, 高蕾 申請人:山東迅達康獸藥有限公司