專利名稱：功能性納米粒子及其制造方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種用于藥物遞送的新型功能性納米粒子、制備該納米粒子的方法，及其用途。
背景技術(shù)：
雖然目前已提出了治療心臟病的新方法如控制藥物遞送(Engel et al. Proc Natl Acad Sci U S A 103，15546-15551 Q006))及干細胞治療(Orlic et al. Nature 410， 701-705(2001)及Quevedo et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106,14022-14027 (2009)), 但要在沒有副作用的情況下得出療效仍是一項挑戰(zhàn)。已有報告指出可將微球體 (microsphere)(Sy et al. Nat Mater 7,863-868(2008))和類凝膠材料(gel-like materials) (Hsieh et al. J Clin Invest 116，237-248 0006)及Davis et al. Proc Natl Acad Sci U S A 103,8155-8160(2006))用于遞送藥物、延長藥物在梗塞區(qū)域滯留的時間， 并改善心臟功能。這些材料雖然可將藥物送入心臟，但并不適用于控制藥物釋出，因為它們一般留存在梗塞區(qū)域的時間太久，以至于藥物的釋出動力學(xué)特性不佳。此外，目前也不清楚這些植入材料要如何在梗塞區(qū)域長時間留置(一般是指數(shù)周到數(shù)月)而不會以一適當(dāng)速度分角軍(Anderl et al. Journal of Biomedical Materials Research Part A 88A, 704-710 (2009))，這通常最后都會引起發(fā)炎反應(yīng)及/或異物反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于前述現(xiàn)有技術(shù)的限制，本發(fā)明的主要目的之一是提供一種用于藥物遞送的新型功能性納米粒子，特別是一種與類胰島素生長因子(insulin-like growth factor (IGF)-I)共軛結(jié)合的聚乳酸-甘醇酸(poly (D，L-lactide-co-glycolide))納米粒子(下文作PLGA-IGF-I納米粒子，或作PLGA-IGF-lNPs)，可在急性心肌梗塞后提供心臟保護效果。本發(fā)明的另一目的是提供一種制造本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子的簡便方法， 且不會危及IGF-I的功能。本發(fā)明的第三個目的是提供一種治療缺血性疾病或退化性疾病的方法，其中缺血性疾病如缺血性中風(fēng)(ischemic stroke)及周邊動脈阻塞性疾病(peripheral arterial occlusive disease)；而退化性疾病如肌肉骨豁傷病(musculoskeletal disorders)或神經(jīng)疾??；該方法包含對患者投予有效量的本發(fā)明的功能性納米粒子。此外，本發(fā)明還提供將本發(fā)明的功能性納米粒子用于再生醫(yī)學(xué)的用途。為達上述目的，本發(fā)明提供一種用于藥物遞送的新型功能性納米粒子，其包含一種聚合物納米粒子，一聚合物穩(wěn)定劑包覆層，以及一藥物；其中所述聚合物穩(wěn)定劑包覆層是包覆在所述聚合物納米粒子的表面，且所述藥物是與所述聚合物穩(wěn)定劑包覆層靜電吸附力結(jié)合或共軛結(jié)合。在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述聚合物納米粒子的聚合物是選自生物可降解的
4聚合物或天然材料；又更佳者，是選自PLGA、膠原蛋白、明膠、甲殼素、幾丁質(zhì)、玻尿酸、海藻酸化物(alginate)、白蛋白、纖維蛋白(fibrin)、瓊脂糖(agarose)或纖維素；最佳者，為 PLGA0在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述功能性納米粒子的平均粒徑為從5至500nm ；又更佳者，是從5至300nm ；最佳者，是從50至lOOnm。在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述聚合物穩(wěn)定劑為聚(乙烯)亞胺 (poly (ethylene) imime)、聚離胺酸(polylysine)、或選自由亞精胺(spermidine)、腐胺 (putrescine)及聚乙二醇所組成的組群的聚胺材料；最佳者，為聚(乙烯)亞胺。在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述藥物為用于治療的細胞激素、生長因子、合成蛋白、化合物、DNA 或 RNA ；又更佳者，為 IGF-1、PDGF、VEGF, HGF、G-CSF, FGF、BMP、SHH、骨膜蛋白(periostin)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin)、p38抑制劑、或其組合；最佳者，為IGF-I0在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述功能性納米粒子是通過注射投予；又更佳者，是通過開胸手術(shù)(transthoracic surgery)、心導(dǎo)管(cardiac catheterization)或超音波導(dǎo)引法(echo-guided approach)而藉由直接心肌注射來投予。本發(fā)明還提供一種制備前文所述的功能性納米粒子的方法，包含下列步驟(a)提供一聚合物溶液；(b) 一邊攪拌一邊將一醇溶液或水加入所述聚合物溶液，以得出一納米粒子懸浮液；(c)將所述懸浮液移入一聚合物穩(wěn)定劑溶液，并進行均質(zhì)化；(d)過濾得自步驟(C)的經(jīng)均質(zhì)化的懸浮液，以得出一種經(jīng)聚合物穩(wěn)定劑包覆的聚合物納米粒子；(e)將所述經(jīng)聚合物穩(wěn)定劑包覆的聚合物納米粒子加入一藥物溶液，以得出前述功能性納米粒子。在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述聚合物納米粒子的聚合物是選自生物可降解的聚合物或天然材料；又更佳者，是選自PLGA、膠原蛋白、明膠、甲殼素、幾丁質(zhì)、玻尿酸、海藻酸化物、白蛋白、纖維蛋白、瓊脂糖或纖維素；又更佳者，為PLGA。在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述功能性納米粒子的平均粒徑為從5至500nm ；又更佳者，是從5至300nm ；最佳者，是從50至100nm。在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述聚合物穩(wěn)定劑為聚(乙烯)亞胺、聚離胺酸、或選自由亞精胺、腐胺及聚乙二醇所組成的組群的聚胺材料；最佳者，為聚(乙烯)亞胺。在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述藥物為用于治療的細胞激素、生長因子、或合成蛋白化合物、DNA 或 RNA ；又更佳者，為 IGF-I、PDGF, VEGF, HGF、G-CSF, FGF、BMP、SHH、骨膜蛋白、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、P38抑制劑、或其組合；最佳者，為IGF-1。在本發(fā)明的較佳實施態(tài)樣中，所述醇溶液為乙醇溶液或其對等物。本發(fā)明并提供一種治療缺血性疾病或退化性疾病的方法，所述缺血性疾病如缺血性中風(fēng)及周邊動脈阻塞性疾病，所述退化性疾病如神經(jīng)疾病或肌肉骨骼傷?。黄浒瑢颊咄队栌行Я康娜缜拔乃龅墓δ苄约{米粒子。本發(fā)明并提供所述的功能性納米粒子在制備治療缺血性疾病或退化性疾病的藥物中的應(yīng)用。所述缺血性疾病如缺血性中風(fēng)及周邊動脈阻塞性疾病。所述退化性疾病如神經(jīng)疾病或肌肉骨骼傷病。本發(fā)明進一步提供一種將如前文所述的功能性納米粒子用于再生醫(yī)學(xué)的用途。本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子能通過在活體外(in vitro)活化Akt磷酸化作用來抑制多柔比星(doxorubicin)所引發(fā)的心肌細胞凋亡。而在活體內(nèi)(in vivo)研究中， 使用本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子進行心肌內(nèi)注射(intramyocardial injection)會使 IGF-I的滯留時間(retention)較單獨注射IGF-1時更長，且IGF-1滯留時間會至少持續(xù)到注射后M小時。除此之外，超音波及組織學(xué)研究顯示，在梗塞后將PLGA-IGF-I納米粒子注射到心肌的周邊梗塞區(qū)域能預(yù)防心肌細胞死亡，縮小梗塞區(qū)塊，并改善小鼠的心臟功能。因此，本發(fā)明具有應(yīng)用于缺血性心臟病的臨床治療的潛力。


圖 1 顯示了(a) PLGA 納米粒子(PLGA NPs)及(b) PLGA-IGF-l 納米粒子 (PLGA-IGF-1 NPs)的穿透式電子顯微鏡影像(比例尺100nm)。圖2顯示了共軛結(jié)合到本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子上的IGF-1量，其是通過 ELISA測得。圖3顯示了(a)本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子(PLGA_IGF_1 NPs)對磷酸化 Akt (p-Akt)、全部Akt及GAPDH(內(nèi)部對照組)的劑量效應(yīng)，以及(b) IGF-I (1 μ g/mL)與(c) 本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子(1 μ g/mL)對Akt磷酸化作用的時間效應(yīng)。圖4顯示了(a)經(jīng)多柔比星處理的心肌細胞(Dox)、以及經(jīng)多柔比星處理的心肌細胞再經(jīng)PLGA納米粒子處理(PLGA NPs+Dox)、或再經(jīng)IGF-I處理(IGF-1+Dox)、或再經(jīng) PLGA-IGF-I納米粒子處理(PLGA-IGF-1 NPs+Dox)后的流式細胞儀結(jié)果，以及(b)上述結(jié)果的正規(guī)化圖形。** :P < 0. 01。*** =P < 0. 001。圖5是在引發(fā)心肌梗塞后將PLGA-IGF-I納米粒子經(jīng)由三個不同方向注射到邊緣區(qū)域的示意圖。圖6顯示了(a)小鼠在注射PLGA納米粒子(PLGA NPs)、IGF-I或PLGA-IGF-1納米粒子(PLGA-IGF-1 NPs)后M小時內(nèi)的IGF-I滯留情形；(b)從在心肌梗塞后1天注射 PBS(MI+PBS)、PLGA 納米粒子(MI+PLGANPs)、IGF-1 (MI+IGF-1)或 PLGA-IGF-I 納米粒子 (MI+PLGA-IGF-1 NPs)的小鼠身上取得的心臟組織的Akt磷酸化情形。Siam是指假手術(shù)組。 *:P<0. 05。***:P< 0.001。η. s.不明顯。圖7顯示在心肌梗塞后1天注射PBS (MI+PBS)、PLGA納米粒子(MI+PLGA NPs)、 IGF-1 (MI+IGF-1)或PLGA-1GF-I納米粒子(MI+PLGA-IGF-l NPs)的小鼠的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。箭頭指出磷酸化Akt (棕色Μ200Χ)。Siam是指假手術(shù)組。圖8顯示了假手術(shù)小鼠及注射PBS (MI+PBS)、PLGA納米粒子(MI+PLGANPs)、 IGF-1 (MI+IGF-1)或PLGA-IGF-1納米粒子(MI+PLGA-IGF-1 NPs)的小鼠的左心室射出率 (EF%)，其是于心肌梗塞后(a)l天或(b)21天藉由超音波所得結(jié)果。*:P<0.05。** :P < 0. 01。圖9顯示了(a)接受測定的梗塞區(qū)塊的橫截面區(qū)域示意圖，以及(b)假手術(shù)小鼠及在心肌梗塞后 21 天注射 PBS(MI+PBS)、PLGA 納米粒子(MI+PLGANPs)、IGF-1 (MI+IGF-1) 或PLGA-IGF-1納米粒子(MI+PLGA-IGF-1 NPs)的小鼠的心臟切片經(jīng)曼森氏三色染色的結(jié)
圖10顯示了假手術(shù)小鼠及在心肌梗塞后21天注射PBS (MI+PBS)、PLGA納米粒子 (MI+PLGA NPs)、IGF-I (MI+IGF-1)或 PLGA-IGF-1 納米粒子(MI+PLGA-IGF-lNPs)的小鼠的梗塞區(qū)塊大小。* :P < 0. 05。
具體實施例方式發(fā)明人設(shè)計了一種納米等級顆粒，其尺寸較作為藥物載體的傳統(tǒng)材料更小、且可與其所負載的藥物以同樣速率分解。本發(fā)明的納米等級顆粒具有以下優(yōu)點首先，由于該納米等級顆粒的表面積/重量比較微米等級顆粒高，故單一顆粒可帶有一種或多種藥物；再者，該納米等級顆粒會有效地擴散到組織中，特別是心臟組織；最后，它們可以穿透更小的毛細血管，而被細胞所吸收(參見 Desai et a 1. Pharm Res 13，1838-1845 (1996)及 Desai et al. Pharm Res 14,1568-1573(1997))。以下實施例是用以進一步理解本發(fā)明的優(yōu)點，而非用于限縮本發(fā)明的申請專利范圍。實施例實施例1 本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子的制備將乳酸(Iactide)對甘醇酸(glycolide)的比例為50/50的PLGA粉末 (50DG0H-040, M. W. 35, 000-65, 000 Da，購自 Bio Invigor Co.)溶解在 5mL 丙酮中，其終濃度為10mg/mL。之后使用蠕動泵將由乙醇/H2O(50/50，％ ν/ν)構(gòu)成的乙醇溶液逐滴加入 PLGA溶液(lmL/min)，并用磁攪拌子于400rpm攪拌，直到出現(xiàn)混濁狀態(tài)。在攪拌5分多鐘后，將懸浮液移入玻璃燒杯內(nèi)的20mL的聚(乙烯)亞胺(分枝型PEI，購自Sigma)中，并低速均質(zhì)化20分鐘。聚合物穩(wěn)定劑是用以增加本發(fā)明的納米粒子的穩(wěn)定度，而PEI的NH3+ 基團會與IGF-I的COOH-基團靜電吸附力結(jié)合(conjugate)。分枝型或線型的PEI都可用于本發(fā)明。同上，1-乙基_3-[3-( 二甲胺基)丙基]碳化二亞胺 (l-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide, EDC)是一種水溶性的交聯(lián)劑，它主要用于活化羧基(carboxyl)與胺基(amines)產(chǎn)生交聯(lián)形成酰胺鍵結(jié)，并以共軛鍵結(jié)方式合成功能性納米微粒，將IGF-I結(jié)合于PLGA納米微粒的表面；將EDC溶液加入混有IGF-I 與有PEI穩(wěn)定劑包覆的PLGA納米微粒溶液中，EDC將活化IGF-I上C00H與PEI穩(wěn)定劑包覆的PLGA表面的NH并以共軛鍵結(jié)的方式將IGF-I攜帶于納米微粒表面。之后將經(jīng)均質(zhì)化的懸浮液以0. 22 μ m濾膜過濾，得出PLGA納米粒子(PLGANPs)， 再以去離子水清洗PLGA納米粒子三次。之后于4°C在PLGA溶液中加入特定濃度的 IGF-I (Pepro Tech)水溶液1小時，其中每十分鐘將該溶液震蕩一次，以得出PLGA-IGF-1納米粒子的溶液。將PLGA-IGF-I納米粒子溶液于14，OOOrpm離心20分鐘，并除去上清液。之后以水清洗PLGA-IGF-I納米粒子(PLGA-IGF-1 NPs)并藉由三次離心來移除剩余的IGF-1。傳統(tǒng)上用于預(yù)防PLGA納米粒子聚集(aggregation)的聚合物穩(wěn)定劑是聚(乙 M S 酉享)(poly (vinyl alcohol), PVA) > Tween 80 R Fluonic 127 (poloxamer 407) (參見 Jain et al. Biomaterials 21,2475-2490(2000)及 Kim et al. Langmuir 21， 8852-8857(2005))。然而，這些穩(wěn)定劑可能會改變PLGA納米粒子的zeta電位、顆粒大小，以及顆粒表面的特性。大多數(shù)的聚合物穩(wěn)定劑并不具有可應(yīng)用于進一步改質(zhì)的官能基，故其于生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用有其限制。而本發(fā)明是以聚(乙烯)亞胺(PEI)作為聚合物穩(wěn)定劑，可預(yù)防IGF-I變性(denature)。IGF-I帶有負電，且可藉由靜電力與功能性PLGA納米粒子上帶有正電的胺基基團結(jié)合，故不需要其它的化學(xué)物質(zhì)。在穿透式電子顯微鏡(Hitachi 7500)下觀察到的 PLGA 納米粒子(PLGA NPs)及 PLGA-1GF-I 納米粒子(PLGA-IGF-1 NPs) 表面形態(tài)如圖1的(a)、(b)所示，而PLGA納米粒子及PLGA-IGF-I納米粒子的平均直徑分別為66. 2 士 15. 3nm及74. 4士 11. 3nm。PLGA納米粒子及PLGA-IGF-I納米粒子的表面型態(tài)并無顯著差異。此外，PLGA納米粒子及本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子的表面電位亦通過zeta電位進行測定(Zetasizer 3000HS Advanced)，兩者之間并無顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例2 本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子的IGF-1濃度使用人類專一性IGF-1ELISA 試劑盒(Diagnostic Systems Laboratories, Webster,TX)來檢驗結(jié)合到本發(fā)明的PLGA-IGF-1納米粒子表面的IGF-I最大量。首先，將 5mg/mL的PLGA納米粒子與不同濃度的IGF-I共同培養(yǎng)，其中IGF-I濃度范圍是從3 μ g/mL 到300yg/mL。培養(yǎng)后，將未結(jié)合的IGF-I離心移除，并依制造商的說明進行ELISA。圖2 所示的結(jié)果指出，與本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子靜電吸附力結(jié)合或共軛結(jié)合的IGF-I最大量為1 μ g/mL。實施例3 本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子在活體外延長心肌細胞的Akt磷酸化作用在本說明書中所使用的心肌細胞是取自1至3天大的Sprague-Dawley大鼠。所有動物實驗程序都經(jīng)國立成功大學(xué)動物實驗管理小組(IACUC)核可。首先，從Sprague-Dawley大鼠身上分離出新生心肌細胞(neonatal cardiomyocyte),以 lmg/mL 溶于 HBSS(GIBI0/BRL)的胰蛋白酶(trypsin, Sigma)于 4°C 消化作用3小時，再以0. 8mg/mL溶于HBSS緩沖液的膠原蛋白酶(Type II，Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, N. J. , USA)于 37°C進行消化作用。所分離的細胞是包含纖維母細胞(fibroblast)及心肌細胞(cardiomyocyte)，其于IOOOrpm離心收集，并在培養(yǎng)皿中進行預(yù)先平板培養(yǎng)(pre-plate)兩次，每次30分鐘，以使纖維母細胞貼附。在移除纖維母細胞后，將未貼附的細胞(即心肌細胞)植入覆有明膠(J. T. Baker)的培養(yǎng)皿為了研究在PLGA-IGF-I納米粒子當(dāng)中的IGF-1的劑量效應(yīng)，分別將濃度范圍從 3 μ g/mL到300 μ g/mL的IGF-I溶液與固定濃度的PLGA納米粒子(5mg/ml)共同培養(yǎng)，以得出具有不同IGF-I濃度的PLGA-IGF-I納米粒子，并將之用于處理前述經(jīng)分離的新生心肌細胞。在處理過后，收集經(jīng)處理的細胞的蛋白萃取物，并將之與磷酸化Akt抗體 (anti-phospho-Akt antiboby, 1 1000 # # ) ^ ^ Akt # (anti-total Akt antibody, 1 1000稀釋)(兩者均購自Cell Signaling)于4 °C培養(yǎng)隔夜，再分別與 1 25000及1 50000稀釋的對應(yīng)二級抗體共同培養(yǎng)。之后使用加強型化學(xué)冷光偵測試劑盒(enhanced chemoi 1 luminescence detection kit, Millipore)來偵測信號。圖3中(a)說明了單獨使用IGF-I或使用IGF-1濃度不同的PLGA-IGF-l納米粒子處理心肌細胞30分鐘后的結(jié)果，其中單獨使用IGF-I及使用IGF-I濃度不同的 PLGA-IGF-I納米粒子會增加Akt磷酸化作用。圖3中(b)及(c)則進一步說明單獨使用 IGF-I (lyg/y L)可維持Akt磷酸化高達8小時，而共軛結(jié)合了相同濃度的IGF-I (1 μ g/ μ L)的PLGA-IGF-I納米粒子則可有效地將Akt磷酸化作用延長至高達M小時。也就是說，PLGA-IGF-I納米粒子處理組可將Akt磷酸化作用的時間延長到比單獨使用IGF-I處理組更久。實施例4 IGF-I及本發(fā)明的PLGA_IGF_1納米粒子在活體外預(yù)防心肌細胞凋亡如實施例3分離并培養(yǎng)心肌細胞。將心肌細胞以5X IO5個細胞/cm2的密度植入培養(yǎng)皿隔夜，并在無血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)M小時，再以IGF-1、PLGA納米粒子或 PLGA-IGF-I納米粒子處理1小時。陰性對照組則不以IGF-I或納米粒子進行處理。經(jīng)前述處理后，加入ΙμΜ多柔比星(Doxirubicin, Sigma)再處理M小時，以引發(fā)心肌細胞凋亡。 離心收集經(jīng)多柔比星處理的細胞，并于37°C在包含20 μ M RNase(Sigma)的0. Triton X-100溶液中培養(yǎng)30分鐘，然后用0. lmg/mL碘化丙啶(propidium iodide, Sigma)染色10 分鐘。之后，用FACSCalibur對細胞進行流式細胞分析。圖4中(a)顯示以流式細胞儀測定凋亡的結(jié)果，而圖4中(b)顯示流式細胞儀數(shù)據(jù)的正規(guī)化圖形。相對于對照組(CM+Dox)及PLGA NPs+Dox組，IGF-1+Dox及 PLGA-IGF-lNPs+Dox組的心肌細胞凋亡明顯減少。易言之，IGF-I處理或PLGA-IGF-I納米粒子處理會保護心肌細胞免于凋亡。實施例5 本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子在活體內(nèi)延長IGF-1的心肌滯留時間使用體重大約25g的雄性FVB小鼠進行下列心肌梗塞實驗。首先，用hletil-50 及2% Rompun將小鼠麻醉，施行氣管內(nèi)管插管(tracheal intubation)及左側(cè)開胸術(shù)(left thoracotomy)，使小鼠的心臟暴露出來。之后施行心包切開術(shù)(pericardiotomy)，找出左冠狀動脈，并以6-0縫線(6-0 prolene)進行縫合，使之與在左心房心耳下方大約2_3mm處的位置接合(Iigate)，以引發(fā)心肌梗塞(myocardial infarction, MI)。在假手術(shù)組，則只進行縫合但不接合左冠狀動脈。在接合冠狀動脈后，立即將總量為20 μ L的PLGA納米粒子、 PLGA-IGF-I納米粒子(包含Iyg之IGF-1)、或IGF-I (Iyg)經(jīng)由三個方向(每個方向為等量)注射到心肌的梗塞邊緣區(qū)域，如圖5所示。注射了 PLGA納米粒子的小鼠作為陰性對照組。注射后，將小鼠的胸腔關(guān)閉，并使動物在加熱墊上復(fù)原。所有步驟都是以盲性隨機方式進行。每組至少有5只動物進行分析。使用RIPA緩沖液(含有0. 1% SDSUOmM Tris-Cl (pH6. 8) U20mM NaCl、1 % NP-40、 脫氧膽酸鹽(deoxycholate)及1 100稀釋的蛋白酶抑制劑混合物(Sigma))而由注
射區(qū)域的心臟組織制備得出蛋白樣本。依照制造商的說明，對每個蛋白樣本進行抗-人類 IGF-I ELISA(Diagnostic Systems Laboratories, Webster)的三重復(fù)試驗，以測定 IGF-1 滯留在心臟中的時間。如圖6中(a)所示，IGF-I組及PLGA-IGF-I納米粒子組的IGF-I濃度在五分鐘內(nèi)幾乎是相同的；然而，在注射后2、8及M小時，PLGA-IGF-I納米粒子組的心臟IGF-I濃度要比其它組來得高。易言之，PLGA-IGF-I納米粒子可在注射后將IGF-I在心臟中的滯留時間延長至高達M小時。實施例6 本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子在活體內(nèi)引發(fā)心肌Akt磷酸化作用如實施例3所述施行西方墨點法(Western blot)，以檢驗注射后一天從注射區(qū)域
9得出的蛋白萃取物。圖6中(b)指出，PLGA-IGF-I納米粒子能夠延長IGF-I在注射區(qū)域中的滯留時間，使心肌中的Akt磷酸化，而在MI+PLGA-IGF-1 NPs組中，磷酸化Akt的量遠高于其它組別。此外并使用免疫組織化學(xué)染色來測量梗塞區(qū)域。首先，取出小鼠心臟，并于4°C 以4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定隔夜，再儲存于70 %乙醇備用。在收集樣本之后，以石蠟包埋固定后的心臟樣本并將之制成組織學(xué)切片。之后，將心臟切片脫蠟 (de-paraffinized)、再水合、并以沸騰的IOmM檸檬酸鈉緩沖液(pH6. 0)預(yù)處理10分鐘。將經(jīng)預(yù)處理之切片于室溫在3% H2O2中培養(yǎng)10分鐘，并以PBS-T清洗三次。之后以溶于PBS-T 的BSA(含有5% FBS及5%山羊血清)于室溫對心臟切片進行封阻(block) 1小時。封阻后，以下列初級抗體于4°C對切片進行探測(probe)隔夜抗-人類rhIGF_l、活性胱冬肽酶-3 (cleaved caspase-3)、與抗-磷酸化 Akt (Cell Signaling)。以 PBS-T 清洗三次，每次5分鐘，以移除初級抗體。使用對應(yīng)的二級抗體于室溫培養(yǎng)30分鐘，之后以PBS-T清洗三次。如圖7所示，箭頭指出的是染色結(jié)果為陽性的磷酸化Akt(棕色M200X)。實施例7 本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子的心臟保護效果所有測試都是以盲性隨機方式進行?？偣彩褂?7只體重大約25g的雄性FVB 小鼠來研究本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子的心臟保護效果，其中每組有至少10只動物 (假手術(shù)組的 η = 10，MI+PBS 組的 η = 13，MI+NPs 組的 η = 12，MI+IGF-1 組的 η = 10， MI+PLGA-IGF-1 NPs 組的 η = 12)。在心肌梗塞后1天或21天，利用活體內(nèi)微影像系統(tǒng)(Vevo 770，Visualsonics, Toronto, Canada)做超音波并進行分析。測量左心室乳突肌的舒張末期內(nèi)徑 (End-diastolic dimension，EDD,單位為 mm)、收縮末期內(nèi)徑(end-systolic dimension， ESD，單位為mm)及射出率(ejection fraction，EF)，之后以下列公式計算得出左心室的短縮分率(left ventricular fractional shortening)，其以 EF%表不
fEDD - ESDI= --1 χ 100
EDD由表1所示結(jié)果可知，本發(fā)明的PLGA-IGF-I納米粒子的EDD及ESD上升的程度要比IGF-I組及PLGA納米粒子組來得低，近于假手術(shù)對照組。也就是說，以本發(fā)明的 PLGA-IGF-I納米粒子進行治療可預(yù)防心肌梗塞后的心室擴大(myocardial dilation)情形。表1心肌梗塞后1天或21天的舒張末期內(nèi)徑及收縮末期內(nèi)徑
權(quán)利要求
1.一種用于藥物遞送的功能性納米粒子，該功能性納米粒子包含一種聚合物納米粒子，一聚合物穩(wěn)定劑包覆層，以及一藥物；其中所述聚合物穩(wěn)定劑包覆層是包覆在所述聚合物納米粒子的表面，且所述藥物是與該聚合物穩(wěn)定劑包覆層靜電吸附力結(jié)合或共軛結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的功能性納米粒子，其中，所述聚合物納米粒子的聚合物是選自生物可降解的聚合物或天然材料。
3.如權(quán)利要求2所述的功能性納米粒子，其中，所述聚合物納米粒子的聚合物是選自 PLGA、膠原蛋白、明膠、甲殼素、幾丁質(zhì)、玻尿酸、海藻酸化物、白蛋白、纖維蛋白、瓊脂糖或纖會佳·ο
4.如權(quán)利要求1所述的功能性納米粒子，其平均粒徑為從5至500nm。
5.如權(quán)利要求1所述的功能性納米粒子，其中，所述聚合物穩(wěn)定劑為聚(乙烯)亞胺、 聚離胺酸、或選自由亞精胺、腐胺及聚乙二醇所組成的組群的聚胺材料。
6.如權(quán)利要求1所述的功能性納米粒子，其中，所述藥物為細胞激素、生長因子、合成蛋白、化合物、DNA或RNA。
7.如權(quán)利要求6所述的功能性納米粒子，其中，所述藥物為IGF-1、PDGF,VEGF, HGF、 6-〇5 、？6 、810\5冊、骨膜蛋白、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、？38抑制劑、或其組合。
8.如權(quán)利要求1所述的功能性納米粒子，其是通過注射投予。
9.一種制備如權(quán)利要求1所述的功能性納米粒子的方法，其包含下列步驟(a)提供一聚合物溶液；(b)一邊攪拌一邊將一醇溶液或水加入所述聚合物溶液，以得出一納米粒子懸浮液；(c)將該懸浮液移入一聚合物穩(wěn)定劑溶液，并進行均質(zhì)化；(d)過濾得自步驟(c)的經(jīng)均質(zhì)化的懸浮液，以得出一種經(jīng)聚合物穩(wěn)定劑包覆的聚合物納米粒子；(e)將所述經(jīng)聚合物穩(wěn)定劑包覆的聚合物納米粒子加入一藥物溶液，以得出所述功能性納米粒子。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述聚合物納米粒子的聚合物是選自生物可降解的聚合物或天然材料。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述聚合物納米粒子的聚合物是選自PLGA、膠原蛋白、明膠、甲殼素、幾丁質(zhì)、玻尿酸、海藻酸化物、白蛋白、纖維蛋白、瓊脂糖或纖維素。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述功能性納米粒子的平均粒徑為500nm以下。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述聚合物穩(wěn)定劑為聚(乙烯)亞胺、聚離胺酸、 或選自由亞精胺、腐胺及聚乙二醇所組成的組群的聚胺材料。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述藥物為細胞激素、生長因子、合成蛋白、化合物、DNA 或 RNA。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述藥物為IGF-I、PDGF、VEGF、HGF、G-CSF、FGF、 BMP、SHH、骨膜蛋白、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、p38抑制劑、或其組合。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述醇溶液為乙醇溶液。
17.權(quán)利要求1所述的功能性納米粒子在制備治療缺血性疾病或退化性疾病的藥物中的應(yīng)用。
18.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述缺血性疾病包含缺血性中風(fēng)及周邊動脈阻塞性疾病。
19.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述退化性疾病包含神經(jīng)疾病及肌肉骨骼傷病。
20.一種如權(quán)利要求1所述的功能性納米粒子用于再生醫(yī)學(xué)的用途。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種用于藥物遞送的新型功能性納米粒子，該功能性納米粒子包含一種聚合物納米粒子，一聚合物穩(wěn)定劑包覆層，以及一藥物；其中所述聚合物穩(wěn)定劑包覆層是包覆在所述聚合物納米粒子的表面，且所述藥物是與所述聚合物穩(wěn)定劑包覆層靜電吸附力結(jié)合或共軛結(jié)合。本發(fā)明還關(guān)于一種制備這種納米粒子的方法；并提供一種治療缺血性或退化性疾病的方法，包含對患者投予有效量的這種功能性納米粒子。
文檔編號A61P9/10GK102335135SQ201110142728
公開日2012年2月1日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者張明曜, 謝清河 申請人:謝清河