專利名稱：一種鮸魚趨化因子cc基因、檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及魚類免疫器官中表達的基因序列，更具體涉及一種從鯢魚脾臟和腎臟 SMART cDNA文庫中篩選出的一個新趨化因子CC基因的核苷酸序列、氨基酸序列及其時空表達圖譜。
背景技術：
趨化因子(Chemokine)即趨化性細胞因子(Chemotactic Cytokine)，是先天免疫系統(tǒng)至關重要的組成部分。趨化因子是結構上相關的多肽，大多數(shù)包含4個保守的半胱氨酸殘基，根據(jù)此4個半胱氨酸殘基的排列形式不同，趨化因子可分為4個亞族CXC、CC、C和
CXgC ο目前，已見報道的魚類趨化因子為CC和CXC兩類。趨化因子發(fā)揮非特異性免疫功能是通過刺激白細胞的趨化性，吸引中性粒細胞、單核/巨噬細胞等炎性細胞移行到炎癥灶，并增強炎性細胞的吞噬殺傷功能，促進炎性細胞釋放炎癥蛋白和炎癥介質(zhì)等。此外，趨化因子在細胞及器官發(fā)育、創(chuàng)傷修復、腫瘤形成及其轉移、移植免疫排斥等方面都起到重要作用。當前海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展面臨病害問題日趨嚴重的困境，尤其是高密度人工養(yǎng)殖經(jīng)常導致急性病害爆發(fā)，造成嚴重損失，藥物防治雖取得一定效果，但長期施藥所致的環(huán)境污染以及諸多耐藥性病原體的產(chǎn)生反過來又極大阻礙了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此提高魚體自身免疫能力是病害防治的趨勢。魚類免疫系統(tǒng)對防止魚體感染中發(fā)揮重要作用，尤其是在較短時間內(nèi)可致魚大量死亡的急性病害暴發(fā)中，特異性免疫機制尚不能在此時間內(nèi)發(fā)揮有效功能，因而魚類只有依靠快速、非特異性的先天免疫應答才能有效地抵抗疾病，其中趨化因子就是魚類先天免疫應答中的重要介質(zhì)。因此，對魚類趨化因子的研究無疑能為提高魚體在高密度人工養(yǎng)殖條件下的抗病力提供堅實的理論與技術支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種新的鯢魚趨化因子CC基因序列及對應氨基酸序列、檢測方法和在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應用。為實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術方案
一種鯢魚趨化因子CC基因，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。 一種鯢魚趨化因子CC基因，它編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述的CC基因是從鯢魚脾臟、腎臟的SMART cDNA質(zhì)粒文庫中篩選到的一個基因，其cDNA核苷酸序列和編碼的蛋白質(zhì)序列如下。該基因cDNA全長為969bp，自104bp 到538bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼142個氨基酸，5’端非編碼區(qū)長103bp，3’端非編碼區(qū)長431bp，包含5個mRNA半衰調(diào)節(jié)基序，多聚腺苷酸加尾信號AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。 在GenBank中進行Blast同源性測定，確定其為鯢魚的趨化因子CC基因。
CC基因的cDNA核苷酸序列如下(SEQ ID NO. 1) ggggcagttcatcgagctctctggagaggaagagacaagaaagaccaaccaagaggttattttatccagtat
ttatctatttaatcatcatcctctcttgaaaATGGTTAACTGTGGAACCCTGTTGAAGAGCGCGCTGGTCGCCATCG TCCTGGTGGTTGTGGTTGGGTCTGGACCAACAGATGAGAAGCTGGCAAAATGCTGTGAGACAGTCAGCAAACACAAG ATAACCGAACCAATCACAGGATACATGATCCAGAAACGTAACGCTCAATGTGTCCGAGCTGTCATTTTTCAGACAGC AACAGGTCTTTACTGCAGTCATCTGACGGCTCCCTGGGTCCGCGCCAAGATTATTGCATTTGAGAAGGCAAAAACTC GAGTCGCTTCTTCGTCTGTGGTTCCCACGTCTCCCGTCTCCCTCCTCTCCATCATCACATCCACTGCCTCTCCTCCT TCTTCCTCCACTCCTGCTCCCTCCTTCTCCGCCACGTCGGAGATGCCAGATGGTGAAACTTTTTCAGGAAGTGACGA GTAGgcctgtggtttctccacctccggccaatgagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagtacaaacta aagatcaaaatagcacttagtatttagtttctttcaatgcctttttgacgatattatttattagtttaagttaatta aacagggcggaagtatacatgtatttattaccaagtgttatgaatgtttacaagttactgtacacaactttaagaac aaagttttttttctatgcatcttaaagtcaacttgaaattgatatttattcatttgaactcaagaaattgtgcaact atgaaaacattggttggaaataaaagacatgaagttgcaaccagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaCC基因編碼的氨基酸序列如下(SEQ ID NO. 2)
MVNCGTLLKSALVAIVLVVVVESTDEKLASCCETVSNVEITEPITGYMIQKRNAQCVRAVIFQTATGLYCSHL TAPWVRAKIIAFEKAKTRVASSSVVPTSPVSLLSIITSTASPPSSSTPAPSFSATSEMPDGETFSGSDE。本發(fā)明還提供了一種鯢魚趨化因子CC基因的檢測方法，其中，所述的檢測方法至少包括使用一對熒光定量PCR引物，所述的一對熒光定量PCR引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了上述的一種鯢魚趨化因子CC基因在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應用。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種鯢魚趨化因子CC基因在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應用，其中，所述的病原微生物包括鰻弧菌。本發(fā)明通過構建鯢魚脾臟和腎臟組織SMART cDNA全長文庫，EST表達序列標簽分析，PCR擴增測序以及Blast比對，克隆到鯢魚趨化因子CC基因的全長序列；通過對趨化因子CC基因設計有效的表達引物，從而利用熒光定量PCR技術分析該基因的在正常組織中的表達譜，以及經(jīng)過鰻弧菌(Kzlri0 einguilleirum) mkm 72小時中，肝臟、脾臟、腎臟和小腸中的趨化因子CC基因的表達量。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
本發(fā)明基因的獲得不僅為研究魚類趨化因子CC類基因在先天免疫中的作用奠定基礎，而且還能通過基因序列獲得基因多態(tài)圖譜及具生物活性的純化蛋白產(chǎn)物，為進一步研究以趨化因子為主要介質(zhì)的先天免疫與鯢魚機體抗病力間相關性提供理論基礎。


圖1為熒光定量檢測CC類基因在鯢魚組織中的分布表達。圖2-1、2-2、2-3和2_4是本發(fā)明經(jīng)鰻弧菌感染后鯢魚免疫相關器官中的趨化因子 CC基因隨時間變化的表達譜圖，其中圖2-1代表小腸；圖2-2代表腎臟；圖2-3代表肝臟；圖2-4代表脾臟。
具體實施例方式
下面結合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領域通用技術。主要材料、試劑和儀器設備手術刀，眼科剪，鑷子，解剖盤，充氧泵，水箱，1.5ml 離心管，微量移液器、微量移液器槍頭，一次性培養(yǎng)皿，陶瓷研缽。脫氧核糖核苷酸dNTP，熱聚合Taq酶，Trnzol-A+總 RNA提取試劑盒，RealMasterMix (SYBRGreen)試劑，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒以及DH5 α感受態(tài)細胞，SMART cDNA Library Construction Kit，小型離心機(Qspin ，BAYGENE )，渦旋振蕩器(QL-866 型，QILINEBEIER)，核酸蛋白儀(SmartSpace Plus, Bio-Rad),超凈工作臺(SW — CJ一IG型，名牌之星)，恒溫培養(yǎng)箱(PH070A型，上海一恒科學儀器有限公司)，-80°超低溫冰箱(Thermo scientific)，熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI 7300型)pH計(Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、高速冷凍離心機 (Centrifuge 5417R, eppendorf)、電泳儀(DYY-6C型，北京六一)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad GD2000)、PCR 儀(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)、自動測序儀 (ABI 3730 型)。 實驗樣本鯢魚采集于浙江省海洋水產(chǎn)研究所。本發(fā)明實施例所用的常規(guī)藥品氯仿(分析純)，異丙醇(分析純)，氯霉素，氯化鈉(分析純)購自國藥集團，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-口引哚-β -D-半乳糖苷(X-gal)，胰蛋白胨，酵母提取物，瓊脂糖，溴化乙錠，焦碳酸二乙酯 (DEPC)等購自Takara公司，液氮為浙江省舟山億洋氣體有限公司產(chǎn)品，脫氧核糖核苷酸 dNTP,熱聚合 Taq 酶，Trnzol-A+ 總 RNA提取試劑盒，RealMasterMix (SYBRGreen)試劑，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒以及DH5a感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司，SMART cDNA Library Construction Kit購自Clontech公司，質(zhì)粒文庫測序由華大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本發(fā)明實施例所用主要儀器包括小型離心機(Qspin ，BAYGENE),渦旋振蕩器 (QL-866 型，QILINEBEIER),核酸蛋白儀(SmartSpace Plus, Bio-Rad),超凈工作臺 (SW-CJ-1G型，名牌之星)，恒溫培養(yǎng)箱(PH070A型，上海一恒科學儀器有限公司)，-80°C 超低溫冰箱(Thermo scientific)，熒光定量 PCR 系統(tǒng)(ABI 7300 型)pH 計(Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、高速冷凍離心機(Centrifuge 5417R, eppendorf)、電泳儀(DYY-6C型，北京六一)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad GD2000)、PCR 儀(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)、自動測序儀(ABI 3730 型)。實施例中未注明具體條件的實驗方法，是按照常規(guī)條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例11、利用Trnzol-A+總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取鯢魚脾臟、腎臟總RNA 取健康的鯢魚(體重約750g)在充氧水箱養(yǎng)殖14日后，腹腔注射Iml的鰻弧菌 (1. 2X108 cfu/ml)。刺激24h后，解剖魚體取出脾臟和腎臟，液氮速凍后放入-80°C冰箱備用。分別取備用脾臟和腎臟組織約IOOmg用液氮研磨后加入Iml的Trnzol-A+試劑勻漿 (TIANGEN)，按照該試劑盒操作手冊所示實驗方法提取總RNA。將兩個組織所得的總RNA合并于一個1. 5ml的離心管中，取2μ 1分別用分光光度計和電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。2、SMART cDNA 文庫構 建
SMART cDNA 的合成步驟詳見 SMART cDNA Library Construction Kit 試劑盒操作手冊。取鯢魚脾腎組織mRNA lug，按該試劑用戶手冊所表示文庫構建實驗方法合成第一鏈 cDNA 加入3，-CDS引物和SMART II寡核苷酸各1 μ 1，72°C孵育2min后，冰上急冷2min， 然后在終體積為10μ 1的反應體系中，加入5Χ第一鏈反應緩沖液(250mmol/L Tris-Hcl, PH8.3; 375mmol/L Kcl ； 30mmol/L MgC12)2μ 1，DTT (20mmol/L)1 μ 1，dNTP (lOmmol/L) 1 μ 1和Powerscript逆轉錄酶1 μ 1，42°C保溫Ih合成第一鏈cDNA。取2 μ 1第一鏈cDNA 加入 dNTP 2 μ 1, SMART cDNA Library Construction Kit 試劑盒中對應的 PCR 引物 4 μ 1， 禾口 2μ1 50 X Advantage 2 cDNA Polymerase Mix 于 100 μ 1 的反應體系中進行如下 PCR 循環(huán)95°C預變性Imin后，以95°C 5s, 65°C 5s, 68°C 6min反應26個循環(huán)。反應結束后，取 5μ 1電泳檢測。取50 μ 1上述雙鏈cDNA，加入蛋白酶K (20ug/y 1)2μ 1，45°C溫育20min， 滅活DNA聚合酶，用100 μ 1等體積苯酚/氯仿/異戊醇(1 1 1 )，氯仿/異戊醇(1:1)各抽提1次，上清夜經(jīng)醋酸鈉，糖原，酒精共沉淀后，80%的酒精漂洗，風干后溶解于79 μ 1滅菌雙蒸水中，加入SfiI酶(20υ/μ 1)10μ 1，IOXsfiI緩沖液10 μ 1及1μ 1100XBSA，總體積 100 μ 1，50°C酶切2h。酶切產(chǎn)物用CHROMA SPIN-400柱進行分級分離，收集1_16管，每管1 滴。分別取3 μ 1于1. 1%的瓊脂糖凝膠上150V電泳lOmin，收集前3管，混合后加入醋酸鈉，糖原和酒精共沉淀，沉淀的cDNA用滅菌雙蒸水溶解。合成的SMART cDNA連接入pDNR-LIB載體中，并轉化入DH5 α感受態(tài)細胞中。涂平板(內(nèi)含氯霉素、異丙基硫代- β -D-半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)，37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。3.質(zhì)粒文庫隨機篩選及測序
通過藍白斑鑒定后隨機篩選含cDNA插入片段的陽性重組子，將挑取的每個單克隆子分別接種到Iml氯霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37°C搖菌2個小時，菌液PCR確認陽性克隆子， 剔除假陽性克隆子。將經(jīng)過菌液PCR鑒定的陽性克隆子寄送華大基因公司測序，測序在ABI 3730測序儀上進行。結果如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示。將測序所得序列在GenBank中進行Blast同源性測定，鑒定出鯢魚的趨化因子CC 基因。該基因cDNA全長為969bp，自104bp到538bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼142個氨基酸，5’端非編碼區(qū)長103bp，3’端非編碼區(qū)長431bp，包含5個mRNA半衰調(diào)節(jié)基序，多聚腺苷酸加尾信號AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。4.正常器官中趨化因子CC基因分布及攻毒后免疫相關器官中趨化因子CC基因的表達譜
為檢測趨化因子CC基因在正常魚體各器官中的分布情況，分別取3條健康的鯢魚肝臟、脾臟、腎臟、小腸、胃、心臟，鰭條、鰾、腦、肌肉十個器官各約lOOmg，并使用Trnzol-A+總RNA提取試劑盒(TIANGEN)抽提總RNA，利用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈，作為后續(xù)熒光定量PCR的模板。為檢測趨化因子CC基因在免疫魚體中的表達情況， 腹腔注射Iml活的鰻弧菌(3X 107Cfu/ml)鯢魚7條，另取4條健康的鯢魚作為對照。取攻毒后0h、6h、12h、24h、36h、48h、和72h共7個時間點的腎臟、脾臟、肝臟及小腸各約lOOmg， 使用Trnzol-A+總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取總RNA，利用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒并合成cDNA第一鏈。根據(jù)鯢魚趨化因子CC基因序列設計一對特異引物(上游引物 CC-RT-F (SEQ ID NO. 3) :CCTGGTGGTTGTGGTTGGGT ；下游引物 CC-RT-R (SEQ ID NO. 4) GAGGCAGTGGATGTGATGATGG)，對目的基因的cDNA進行擴增；根據(jù)β -actin基因作 為內(nèi)參基因，設計一對特異引物(上游引物 actin-RT-F(SEQ ID NO. 5) :GTGATGAAGCCCAGAGCA 下游引物 actin-RT-R(SEQ ID NO. 6) :CGACCAGAGGCATACAGG)，擴增片段約為 277 bp。在 ABI 7300實時熒光定量PCR系統(tǒng)上進行反應，熒光定量反應程序模板設置為ddCt (Relative Quantitation) Study,反應循環(huán)參數(shù)設置為95度20s ；95度5s，60度30s，共40個循環(huán)， 利用2_ΔΔσ法計算相對表達量。發(fā)明人運用實時熒光定量PCR技術檢測了 CC基因在鯢魚的鰾、腦、鰭條、胃、心臟、 小腸、腎臟、肝臟、肌肉、脾臟中的轉錄本水平，結果表明如圖1所示，在正常鯢魚組織中趨化因子CC基因均有不同程度的表達，其中較強的表達于肌肉和鰾，中等程度表達于腦、鰭條、腎臟及脾臟，在心臟、小腸、胃及肝臟中表達較弱。另外如圖2-1、2-2、2-3和2-4所示， 經(jīng)鰻弧菌攻毒后，免疫相關器官肝臟、腎臟、脾臟及小腸的趨化因子CC基因表達量較正常水平明顯升高，在攻毒后0h-36h表達量呈上升趨勢，這提示該基因在鯢魚抵抗病原微生物入侵中具有重要功能，隨后表達量表現(xiàn)出下降趨勢，并在72h時恢復到接近正常水平。盡管發(fā)明人已經(jīng)對本發(fā)明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉，應當理解，對于本領域一個熟練的技術人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術語用于對本發(fā)明技術方案的闡述和理解，并不能構成對本發(fā)明的限制。
權利要求
1.一種鯢魚趨化因子CC基因，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.一種鯢魚趨化因子CC基因，它編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.—種鯢魚趨化因子CC基因的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法至少包括使用一對熒光定量PCR引物，所述的一對熒光定量PCR引物由上游引物和下游引物組成，其中， 所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。
4.如權利要求1或2所述的一種鯢魚趨化因子CC基因在制備鯢魚抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的病原微生物包括鰻弧菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及魚類免疫器官中表達的基因序列領域，具體是一種鮸魚趨化因子CC基因、檢測方法和應用。本發(fā)明基因的獲得不僅為研究魚類趨化因子CC類基因在先天免疫中的作用奠定基礎，而且還能通過基因序列獲得基因多態(tài)圖譜及具生物活性的純化蛋白產(chǎn)物，為進一步研究以趨化因子為主要介質(zhì)的先天免疫與鮸魚機體抗病力間相關性提供理論基礎；此外，本發(fā)明的基因還可以用于抗病相關性研究，該基因在鮸魚抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。
文檔編號A61K48/00GK102250916SQ201110143248
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月31日 優(yōu)先權日2011年5月31日
發(fā)明者孫悅娜, 徐田軍, 王日昕, 石戈, 程遠志 申請人:浙江海洋學院