專利名稱：可識(shí)別hcv ns5a蛋白的核酸適體、核酸適體的衍生物及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種核酸適體、核酸適體的衍生物及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是一種危害嚴(yán)重的全球性健康問題，全世界已有2億感染者。據(jù)估計(jì)，每年新增感染者數(shù)為300 400萬。我國約有4000萬至5000萬人感染HCV， 僅次于乙型肝炎攜帶者數(shù)量。目前，治療丙型病毒肝炎的標(biāo)準(zhǔn)方法是采用干擾素或者干擾素聯(lián)合利巴韋林治療。在治療感染基因型2型和3型HCV的患者中有75% 90%的HCV根除率，然而，仍有約50%的1型和4型HCV感染的病人不敏感。雖然加入利巴韋林能夠增強(qiáng)持久的抗病毒應(yīng)答水平，但也能帶來嚴(yán)重的副作用(如溶血性貧血)，這些副作用常常導(dǎo)致20%的患者中斷治療。由于HCV基因組有極大的序列差異性，加之組合療法的副作用大和治療價(jià)格昂貴，急需開發(fā)新方法來有效治療不同HCV基因型感染的肝病患者。核酸適體(Aptamer)是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)從人工合成的 DNA/RNA文庫中篩選得到的能高親和性、高特異性結(jié)合生物靶標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA 或ssRNA)。核酸適體的靶標(biāo)包括多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識(shí)別功能與抗體類似，識(shí)別能力與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)，但自身又具有許多顯著優(yōu)點(diǎn)，如分子量小、易保存、無免疫原性、容易合成標(biāo)記、穿透組織能力強(qiáng)、化學(xué)穩(wěn)定性好等，在抗病毒治療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。作為一種嚴(yán)重危害人類健康的病毒，HCV編碼約3100個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白，該蛋白在宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶和病毒蛋白酶作用下，可裂解產(chǎn)生10種HCV蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白Core、El和E2、ρ7蛋白，以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A的功能至今仍不十分明確，近年來的研究表明其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，存在基礎(chǔ)磷酸化與過磷酸化兩種形式(Ρ56和Ρ58)，過磷酸化位點(diǎn)為ser2197， ser2201和/或ser2204，并且含有已知的干擾素敏感性決定區(qū)域(IFN sensitivity determining region, ISDR)。越來越多的研究表明NS5A可能是影響和調(diào)控HCV復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，尤其是磷酸化形式對(duì)HCV的復(fù)制有著重要的影響。Min Gao等(Min Gao, Richard Ε. Nettles, Makonen Belema, et al. Chemical genetics strategy identifies an HCV NS5A inhibitor with a potent clinical effect. Nature, 2010 ；465 :96-100)用化學(xué)遺傳學(xué)方法篩選出了特異性抑制NS5A蛋白的小分子有機(jī)化合物抑制劑BMS-790052，并且該抑制劑能非常有效地抑制HCV的基因組復(fù)制。因此，以HCV NS5A蛋白作為特定靶點(diǎn)篩選與其特異結(jié)合的核酸適體，然后從這些特異識(shí)別靶標(biāo)的核酸適體中，挑選出特異性結(jié)合NS5A 蛋白功能結(jié)構(gòu)域的抑制HCV復(fù)制的核酸適體，具有非常重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值，這將為丙型病毒性肝炎及其他肝病藥物的開發(fā)開辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能有效結(jié)合并封閉 NS5A蛋白的活性位點(diǎn)、進(jìn)而抑制HCV復(fù)制、并具有顯著抗HCV感染能力的核酸適體及其衍生物，并相應(yīng)提供易于制備、成本低廉的該核酸適體的篩選方法和應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種可識(shí)別HCV NS5A蛋白的核酸適體，其為SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 5中任一序列所示的DNA片段。上述技術(shù)方案的核酸適體中，五種不同序列的DNA片段依次如下核酸適體序列1 (以下簡稱NS5A-1)5' -ACGTACACTAGTGGTCCGGGCGGGGCTCATTGTCC-3'；核酸適體序列2 (以下簡稱NS5A-2)5’ -GCGGATTGTCCATTGAACCTTCGTCAACTATGCCG-3’ ；核酸適體序列3 (以下簡稱NS5A-3)5’ -CACGCCAGACCAGCCGTCCTCTCTTTATCCGAGCCTTCATCCGAG-3，；核酸適體序列4 (以下簡稱NS5A-4)5’ -GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3，；核酸適體序列5 (以下簡稱NS5A-5)5’ -CTGGATCGAAAAGTATCCACGTTTGTCTGAAAATAGTGGC-3’。作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述核酸適體的衍生物，該衍生物可以為以下a d中的任意一種a)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代后得到的RNA核酸適體；b)將所述核酸適體骨架改造為硫代磷酸酯骨架后得到的核酸適體衍生物；c)將所述核酸適體改造為肽核酸后得到的核酸適體衍生物；d)將所述核酸適體連接上放射性分子(或者其他的肝癌治療藥物)后得到的核酸適體衍生物。需要說明的是，上述各種衍生物應(yīng)當(dāng)具有本發(fā)明所述核酸適體相類似的功能，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的核酸適體的篩選方法，包括以下步驟(1)制備丙型肝炎病毒NS5A蛋白以pJFHl質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增的模板，用第一引物對(duì)NS5A基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用限制性酶Nde I和HindIII雙酶切所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物；用限制性酶Nde I和HindIII雙酶切原核表達(dá)載體 pET28b，回收載體骨架；將所述酶切產(chǎn)物和載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物；將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取得到重組質(zhì)粒 pET28b-NS5A ；再經(jīng)過大量表達(dá)及純化過程，制得帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白；(2)制備對(duì)照蛋白LacZ 用pET200/D/LacZ蛋白的編碼基因與載體上的組氨酸標(biāo)簽的編碼基因融合，表達(dá)帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白；再經(jīng)過大量表達(dá)及純化過程，制得帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白；(3)蛋白的固定取Ni-NTA瓊脂糖微珠，經(jīng)預(yù)處理后分別分散于步驟(1)制得的帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白和步驟( 制得的帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ 蛋白中，經(jīng)孵育、洗滌后分別得到固定有靶標(biāo)蛋白的微珠和固定有對(duì)照蛋白的微珠；(4)隨機(jī)核酸文庫的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)兩端包含20個(gè)核苷酸、中間包括40個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG(N40)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，；其中，N40 表示40個(gè)隨機(jī)核苷酸；(5)核酸適體的篩選A)DNA文庫預(yù)處理將步驟(4)設(shè)計(jì)的隨機(jī)核酸文庫溶于結(jié)合緩沖液中；B)反篩將步驟C3)制得的固定有對(duì)照蛋白的微珠與所述預(yù)處理后的隨機(jī)核酸文庫混合，孵育、洗滌后再進(jìn)行超濾離心；C)正篩將上述超濾離心后的溶液與步驟C3)制得的固定有靶標(biāo)蛋白的微珠混合，經(jīng)過孵育、洗滌后轉(zhuǎn)移微珠，再將轉(zhuǎn)移后的微珠進(jìn)行加熱、冷卻和離心，收集上清，以上清液中的DNA為模板并利用生物素標(biāo)記的第二引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過親和素包被的葡聚糖珠分離生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后使雙鏈DNA變性解鏈，收集生物素標(biāo)記的DNA單鏈，脫鹽后用于下一輪篩選；D)反復(fù)篩選重復(fù)上述步驟B 步驟C，在重復(fù)篩選過程中逐步增加篩選壓力，經(jīng)過多輪反復(fù)篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板通過第三引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得競(jìng)爭能力強(qiáng)、序列長度得到優(yōu)化的核酸適體。上述的核酸適體的篩選方法中，所述步驟(1)中選用的第一引物對(duì)優(yōu)選是指以下序列的引物對(duì)上游引物5，-CGCGCCATATGTCCGGATCCTGGCTCCGCGAC-3，禾口下游引物5，-CTGCAGAAGCTTTCAGCAGCACACGGTGGTATCG-3，。上述的核酸適體的篩選方法中，所述步驟(5)中選用的第二引物對(duì)優(yōu)選是指以下序列的引物對(duì)FITC-5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，禾口Biotin-5，-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，。上述的核酸適體的篩選方法中，所述步驟(5)中選用的第三引物對(duì)優(yōu)選是指以下序列的引物對(duì)5， -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，禾口5’ -GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，。上述的核酸適體的篩選方法中，所述步驟(1)和步驟O)的大量表達(dá)及純化過程優(yōu)選包括以下步驟先用相應(yīng)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌；然后將重組菌接種到LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，再按一定體積比轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中， 37°C振搖培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)至少 12h ；離心收集菌體，在含溶菌酶的結(jié)合緩沖液中超聲破碎，離心，收集裂解上清；將裂解上清上樣于鎳離子偶聯(lián)的瓊脂糖黏附柱，用洗滌緩沖液洗滌去除雜蛋白，用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，得到帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白或帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ 蛋白。作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的核酸適體或者其衍生物在制備丙型肝炎病毒NS5A蛋白檢測(cè)試劑盒或丙型肝炎病毒NS5A蛋白診斷試劑中的應(yīng)用。作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的核酸適體或者其衍生物在制備用于抑制丙型肝炎病毒在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的試劑中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明旨在通過原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白，并利用SELEX技術(shù)篩選出特異性結(jié)合NS5A蛋白的核酸適體，經(jīng)實(shí)驗(yàn)和研究表明，利用本發(fā)明的核酸適體，并借助有效的傳遞載體將其導(dǎo)入被HCV感染的肝細(xì)胞，該核酸適體便能有效結(jié)合并封閉NS5A蛋白的活性位點(diǎn)，進(jìn)而影響NS5A蛋白參與HCV 基因組復(fù)制的生理功能，以達(dá)到抑制HCV復(fù)制的治療效果。本發(fā)明提供的上述核酸適體是包括有多種不同序列組成的單鏈DNA，上述各種序列的核酸適體均能夠起到抑制HCV復(fù)制的顯著效果，具有低成本、高效、特異抑制HCV感染等功能；通過修飾或改造該核酸適體還可得到用于HCV診斷和臨床治療的各種衍生物，以解決目前HCV治療方法存在的成本高、副作用大且對(duì)部分患者無治療效果等問題。總的來說，本發(fā)明的核酸適體易制備、成本低、易保存、具有顯著的抗病毒感染能力，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白的western-blot 表征圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例中帶組氨酸標(biāo)簽的LacZ蛋白的western-blot表征圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例中NS5A核酸適體對(duì)HCV復(fù)制的抑制效果對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，以便于更好地理解本發(fā)明，但并不因此而限定本發(fā)明。如無特別說明，下述實(shí)施例中所用的原材料均購自常規(guī)生化試劑公司，實(shí)施例中的各定量實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例可識(shí)別HCV NS5A蛋白的核酸適體、核酸適體的衍生物及其篩選方法和應(yīng)用。1.相關(guān)蛋白的制備。1. 1帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白(即靶標(biāo)蛋白)的制備。1.1. 1HCVNS5A蛋白的編碼基因的擴(kuò)增以pjnil質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增的模板，用以下引物1和引物2組成的第一引物對(duì)NS5A 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR試劑購自Roche公司、100微升PCR管購自Eppendorf公司)引物1(上游引物)5’ -CGCGCCATATGTCCGGATCCTGGCTCCGCGAC-3，；引物2 (下游引物)5’ -CTGCAGAAGCTTTCAGCAGCACACGGTGGTATCG-3，；上、下游引物的5，端分別引入Nde I酶切位點(diǎn)和HindIII酶切位點(diǎn)；PCR擴(kuò)增條件為:95°C,2min ；95°C，30s，66°C，30s，72°C，1. 5min，35 個(gè)循環(huán)；72°C, 7min ；PCR擴(kuò)增完成后得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。1. 1. 2原核表達(dá)載體的構(gòu)建
1. 1. 2. 1用限制性酶Nde I和HindIII雙酶切步驟11. 1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)而獲得酶切產(chǎn)物；1. 1. 2. 2用限制性酶Nde I和HindIII雙酶切原核表達(dá)載體pET28b vector (Invitrogen公司)，回收載體骨架；1. 1. 2. 3將步驟1. 1. 2. 1得到的酶切產(chǎn)物和步驟1. 1. 2. 2得到的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物；1. 1.2. 4將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(鼎國公司)，用含卡那霉素 (Kana)的LB平板(LB培養(yǎng)基購自鼎國公司，下同)篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒依次進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定；測(cè)序結(jié)果表明，上述步驟1. 1.2. 1 ~ 1. 1. 2. 4得到了重組質(zhì)粒pET28b-NS5A ；在 Nde I和BamHl酶切識(shí)別位點(diǎn)之間插入了 NS5A目的序列，且序列準(zhǔn)確無誤。1. 1. 3帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白的原核表達(dá)鑒定 1. 1. 3. 1將以上步驟1. 1. 2得到的重組質(zhì)粒pET28b_NS5A轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen公司)，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克??；1. 1.3. 2挑取陽性克隆于LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖過夜，加入IPTG(終濃度 Immo 1/L)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)IOh ；1. 1. 3. 3在13000rpm條件下離心lmin，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot。Western blot 的一抗為 anti-his (購自 Sigma 公司)；Western blot 的結(jié)果見圖 1， 結(jié)果表明，菌體中含有帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白。1. 1. 4帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白的大量表達(dá)、純化及檢測(cè)1. 1. 4. 1將重組質(zhì)粒pET2m3-NS5A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌；1. 1.4. 2將步驟1. 1.4. 1得到的重組菌接種LB培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，按 1 50的體積比轉(zhuǎn)接到含10 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)約池(使0D600 為0. 6 0. 8)，加入IPTG (終濃度lmmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)12h ；1. 1. 4. 3在3500rp條件下離心收集菌體，在含100 μ g/ml溶菌酶(鼎國公司)的 start buffer (0. 02M磷酸鈉，0. 5M NaCl,pH7. 4)中超聲破碎(頻率120w，每個(gè)循環(huán)內(nèi)超聲 3s停3s，400個(gè)循環(huán)，在冰浴上進(jìn)行)，4°C、IOOOOrpm離心lOmin，收集裂解上清；1. 1.4. 4將裂解上清上樣于Ni-NTA偶聯(lián)的瓊脂糖黏附柱(購自GE公司)，用 washing buffer (0. 02M磷酸鈉，0. 5M NaCl,0. 05M咪唑，pH7. 4)洗滌去除雜蛋白，用 elution buffer (0.02M磷酸鈉，0.5M NaCl，0. 5M咪唑，ρΗ7· 4)洗脫目的蛋白，得到帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白。1. 2帶組氨酸標(biāo)簽的對(duì)照蛋白LacZ的制備1. 2. 1 將 pET200/D/LacZ (質(zhì)粒 pET200/D/LacZ 購自 hvitrogen 公司)蛋白的編碼基因與載體上的組氨酸標(biāo)簽的編碼基因融合，表達(dá)帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白。1. 2. 2帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白的原核表達(dá)鑒定1. 2. 2. 1將重組質(zhì)粒pET200/D/LacZ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克??；1.2.2.2挑取陽性克隆于LB液體培養(yǎng)基，37 °C振搖過夜，加入IPTG (終濃度Immo 1/L)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)IOh ；1. 2. 2. 3在13000rpm條件下離心lmin，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot, Western blot 的一抗為 anti-his (購自 Sigma 公司)，Western blot 的結(jié)果見圖 2， 結(jié)果表明，菌體中含有帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白。1. 2. 3用重組質(zhì)粒pET200/D/LaCZ代替重組質(zhì)粒pET2m3-NS5A，其它操作與步驟 1. 1中的步驟1. 1. 4相同，得到帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白。2.核酸適體的篩選和制備。2.1蛋白的固定2. 1. 1取鎳離子瓊脂糖微珠OiIAGEN公司)置于5ml離心管中，移走上清，PBS緩沖液(Hyclone公司)洗滌三次；2. 1. 2將步驟2. 1. 1得到的微珠分別和步驟1. 1制得的帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白(即靶標(biāo)蛋白)或步驟1.2制得的帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白(即對(duì)照蛋白)混合均勻，室溫孵育lh，PBS緩沖液離心洗滌三次，得到固定有靶標(biāo)蛋白的微珠和固定有對(duì)照蛋白的微珠；2. 1. 3將步驟2. 1. 2得到的微珠重新分散于Iml PBS緩沖液中，置于4°C備用。
2. 2隨機(jī)核酸文庫的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)兩端包含20個(gè)核苷酸、中間包括40個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下5 ’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG(N40)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3 ’ ；N40代表40個(gè)隨機(jī)核苷酸。2. 3核酸適體的篩選2. 3. IDNA文庫預(yù)處理將隨機(jī)核酸文庫溶于結(jié)合緩沖液中；2. 3. 2反篩將隨機(jī)核酸文庫與步驟2. 1. 2制得的固定有對(duì)照蛋白的微珠混合， 37°C孵育1 2小時(shí)；經(jīng)結(jié)合緩沖液洗滌后，將微珠通過超濾離心；2. 3. 3正篩將反篩過程中超濾離心的溶液加入步驟2. 1. 2制得的固定有靶標(biāo)蛋白的微珠中，37°C孵育1 2小時(shí)；將微珠通過超濾離心洗滌后，用滅菌水將微珠轉(zhuǎn)移到離心管中；將微珠經(jīng)95°C加熱IOmiru冰上冷卻IOmiru高速離心后，收集上清液并以其中的 DNA為模板，用含F(xiàn)ITC或生物素標(biāo)記的第二對(duì)引物(FITC-5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和 Biotin-5，-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增后通過親和素包被的葡聚糖珠分離生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，然后利用0. 2M的氫氧化鈉使雙鏈DNA變性解鏈，收集FITC 標(biāo)記的DNA單鏈，這些DNA單鏈脫鹽后用于下一輪篩選；2. 3. 4反復(fù)篩選為了獲得高親和性和特異性結(jié)合靶標(biāo)蛋白的核酸適體，在篩選的過程中逐步改變反篩和正篩的蛋白量、篩選時(shí)間、篩選溶液中tRNA含量以及正篩洗滌次數(shù)，以增加篩選壓力；經(jīng)過八輪的反復(fù)篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板并通過第三對(duì)引物 (5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和 5，-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；這樣得到的核酸適體較長，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析后，設(shè)計(jì)并合成一系列經(jīng)截短的核酸序列，與熒光染料修飾的全長核酸適體進(jìn)行競(jìng)爭反應(yīng)，挑選競(jìng)爭能力最強(qiáng)的結(jié)合序列用于進(jìn)一步的應(yīng)用。經(jīng)過上述的篩選、優(yōu)化，最終得到截短的核酸適體(NS5A)序列如下NS5A-1 :5，-ACGTACACTAGTGGTCCGGGCGGGGCTCATTGTCC-3，；
NS5A-2 :5， -GCGGATTGTCCATTGAACCTTCGTCAACTATGCCG-3，；NS5A-3 :5’ -CACGCCAGACCAGCCGTCCTCTCTTTATCCGAGCCTTCATCCGAG-3，；NS5A-4 :5’ -GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3，；NS5A-5 5’ -CTGGATCGAAAAGTATCCACGTTTGTCTGAAAATAGTGGC-3 ’。3.核酸適體NS5A (NS5A aptamers)試劑對(duì)HCV感染Huh7. 5細(xì)胞的抑制作用。3. 1細(xì)胞培養(yǎng)Huh7. 5. 5細(xì)胞(被HCV感染的陽性細(xì)胞)培養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(30萬/孔) 中，生長24h后待處理。3. 2核酸適體NS5A及核酸適體文庫(Library)進(jìn)入Huh7. 5. 5細(xì)胞用Lipofectamine 2000(購自 hvitrogen 公司)轉(zhuǎn)染相應(yīng)濃度的 Library 和 NS5A aptamers進(jìn)入Huh7. 5. 5細(xì)胞，培養(yǎng)24h后換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)Mh。3.3核酸適體NS5A抑制HCV復(fù)制的定量分析用TRIZOL法提取步驟3. 2中的細(xì)胞總RNA，然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以 cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)各樣品進(jìn)行相對(duì)定量，數(shù)據(jù)處理和匯總后的結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，不管是用低濃度的IOnM核酸適體處理，還是用高濃度IOOnM核酸適體處理，對(duì)比核酸適體文庫(Library)，各不同序列的本發(fā)明NS5A核酸適體(NS5A-1 NS5A-5aptamer)都能顯著性地抑制HCV基因組的復(fù)制(T-1Test檢測(cè))；并且用高濃度IOOnM 核酸適體處理Huh7. 5. 5細(xì)胞，比用低濃度IOnM核酸適體處理的抑制效果會(huì)更明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得。綜合以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果表明以NS5A蛋白為靶分子的NS5A-1 NS5A-5aptamer 具有非常強(qiáng)的抑制HCV基因復(fù)制的生物學(xué)效果，相應(yīng)的該核酸適體試劑能夠有效阻斷HCV 病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖和擴(kuò)增，這為開發(fā)制備用于治療丙型病毒肝炎及肝癌的藥物奠定了良好的基礎(chǔ)，對(duì)于HCV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制機(jī)制研究和抗HCV新方法的建立等領(lǐng)域具有重要的科學(xué)實(shí)用價(jià)值，具有廣闊的醫(yī)學(xué)應(yīng)用及市場(chǎng)前景。利用上述的可識(shí)別HCVNS5A蛋白的核酸適體分別制備以下四種衍生物a)將本實(shí)施例的各核酸適體進(jìn)行核苷酸取代后得到的RNA核酸適體；b)將本實(shí)施例的各核酸適體骨架改造為硫代磷酸酯骨架后得到的核酸適體衍生物；c)將本實(shí)施例的各核酸適體改造為肽核酸后得到的核酸適體衍生物；d)將本實(shí)施例的各核酸適體連接上放射性分子后得到的核酸適體衍生物。很明顯，通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，上述核酸適體的衍生物具有與上述核酸適體相類似的功能和效果。
權(quán)利要求
1.一種可識(shí)別HCV NS5A蛋白的核酸適體，其為SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 5中任一序列所示的DNA片段。
2.一種如權(quán)利要求1所述核酸適體的衍生物，該衍生物為以下a d中的任意一種a)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代后得到的RNA核酸適體；b)將所述核酸適體骨架改造為硫代磷酸酯骨架后得到的核酸適體衍生物；c)將所述核酸適體改造為肽核酸后得到的核酸適體衍生物；d)將所述核酸適體連接上放射性分子后得到的核酸適體衍生物。
3.—種如權(quán)利要求1所述的核酸適體的篩選方法，包括以下步驟(1)制備丙型肝炎病毒NS5A蛋白以pJFHl質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增的模板，用第一引物對(duì)NS5A基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用限制性酶Nde I和HindIII雙酶切所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物；用限制性酶Nde I和HindIII雙酶切原核表達(dá)載體 pET28b，回收載體骨架；將所述酶切產(chǎn)物和載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物；將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取得到重組質(zhì)粒 pET28b-NS5A ；再經(jīng)過大量表達(dá)及純化過程，制得帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白；(2)制備對(duì)照蛋白LacZ用pET200/D/LacZ蛋白的編碼基因與載體上的組氨酸標(biāo)簽的編碼基因融合，表達(dá)帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白；再經(jīng)過大量表達(dá)及純化過程，制得帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白；(3)蛋白的固定取Ni-NTA瓊脂糖微珠，經(jīng)預(yù)處理后分別分散于步驟(1)制得的帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白和步驟( 制得的帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白中，經(jīng)孵育、洗滌后分別得到固定有靶標(biāo)蛋白的微珠和固定有對(duì)照蛋白的微珠；(4)隨機(jī)核酸文庫的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)兩端包含20個(gè)核苷酸、中間包括40個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG(N40)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3‘；其中，N40 表示 40個(gè)隨機(jī)核苷酸；(5)核酸適體的篩選A)DNA文庫預(yù)處理將步驟(4)設(shè)計(jì)的隨機(jī)核酸文庫溶于結(jié)合緩沖液中；B)反篩將步驟C3)制得的固定有對(duì)照蛋白的微珠與所述預(yù)處理后的隨機(jī)核酸文庫混合，孵育、洗滌后再進(jìn)行超濾離心；C)正篩將上述超濾離心后的溶液與步驟C3)制得的固定有靶標(biāo)蛋白的微珠混合，經(jīng)過孵育、洗滌后轉(zhuǎn)移微珠，再將轉(zhuǎn)移后的微珠進(jìn)行加熱、冷卻和離心，收集上清，以上清液中的DNA為模板并利用生物素標(biāo)記的第二引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過親和素包被的葡聚糖珠分離生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后使雙鏈DNA變性解鏈，收集生物素標(biāo)記的DNA 單鏈，脫鹽后用于下一輪篩選；D)反復(fù)篩選重復(fù)上述步驟B 步驟C，在重復(fù)篩選過程中逐步增加篩選壓力，經(jīng)過多輪反復(fù)篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板通過第三引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得競(jìng)爭能力強(qiáng)、序列長度得到優(yōu)化的核酸適體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸適體的篩選方法，其特征在于所述步驟(1)中選用的第一引物對(duì)是指以下序列的引物對(duì)5’ -CGCGCCATATGTCCGGATCCTGGCTCCGCGAC-3，禾口5' -CTGCAGAAGCTTTCAGCAGCACACGGTGGTATCG-3，；所述步驟(5)中選用的第二引物對(duì)是指以下序列的引物對(duì) FITC-5， -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，禾口 Biotin-5， -GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，； 所述步驟(5)中選用的第三引物對(duì)是指以下序列的引物對(duì) 5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和 5’ -GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的核酸適體的篩選方法，其特征在于，所述步驟(1)和步驟 (2)的大量表達(dá)及純化過程包括以下步驟先用相應(yīng)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌；然后將重組菌接種到LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，再按一定體積比轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C 振搖培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)至少12h ；離心收集菌體，在含溶菌酶的結(jié)合緩沖液中超聲破碎，離心，收集裂解上清；將裂解上清上樣于鎳離子偶聯(lián)的瓊脂糖黏附柱，用洗滌緩沖液洗滌去除雜蛋白，用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，得到帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白或帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白。
6.一種如權(quán)利要求1所述的核酸適體或者如權(quán)利要求2所述的衍生物在制備丙型肝炎病毒NS5A蛋白檢測(cè)試劑盒或丙型肝炎病毒NS5A蛋白診斷試劑中的應(yīng)用。
7.—種如權(quán)利要求1所述的核酸適體或者如權(quán)利要求2所述的衍生物在制備用于抑制丙型肝炎病毒在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可識(shí)別HCV NS5A蛋白的核酸適體，其為SEQ ID NO1～SEQ ID NO5中任一序列所示的DNA片段，其衍生物為包括核苷酸取代后的RNA核酸適體、骨架改造后的衍生物、改造為肽核酸后的衍生物以及連接上放射性分子后的衍生物。該核酸適體的篩選方法包括先制備帶組氨酸標(biāo)簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白，再制備帶組氨酸標(biāo)簽的pET200/D/LacZ蛋白；然后對(duì)蛋白進(jìn)行固定，并設(shè)計(jì)隨機(jī)核酸文庫；最后進(jìn)行核酸適體的篩選，篩選過程具體又包括DNA文庫預(yù)處理、反篩、正篩及反復(fù)篩選等步驟，最后獲得競(jìng)爭能力強(qiáng)、序列長度得到優(yōu)化的核酸適體。本發(fā)明的核酸適體及其衍生物可用于制備丙型肝炎病毒NS5A蛋白的檢測(cè)試劑盒或診斷試劑，還可用于制備抑制丙型肝炎病毒在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的試劑。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102229933SQ20111014860
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉念禮, 劉斌, 徐麗, 方曉紅, 朱海珍, 楊大榮, 雷少華 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)