專利名稱：α2-3神經(jīng)氨酸酶在誘導(dǎo)移植免疫耐受中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于誘導(dǎo)移植免疫耐受的生物制品領(lǐng)域，涉及一種特異結(jié)構(gòu)的神經(jīng)氨酸酶，S卩α 2-3神經(jīng)氨酸酶。該酶是一種高度特異性的外切糖苷酶，主要催化α 2-3糖苷鍵的水解。該酶預(yù)處理供體骨髓細(xì)胞(dBMCs)，經(jīng)外周靜脈輸注對(duì)異體皮膚存活時(shí)間的延長(zhǎng)有明顯效果，在移植免疫耐受中有很好的誘導(dǎo)作用。
背景技術(shù)：
自1953年Medawar給小鼠胚胎注射同種淋巴細(xì)胞成功誘導(dǎo)了獲得性移植免疫耐受以來(lái)，移植免疫學(xué)家就控制移植后的排斥反應(yīng)、提高移植物質(zhì)成活率進(jìn)行了不斷地探索。 尤其是近年來(lái)，隨著組織配型技術(shù)的成熟、外科手術(shù)方法的改進(jìn)以及大量有效免疫抑制藥物的開發(fā)應(yīng)用，組織器官移植的成功率進(jìn)一步提高，逐漸成為許多終末期疾病的有效治療手段之一。然而，除孿生子間的移植之外，移植手術(shù)方法的提高和完善并未能保證術(shù)后移植器官的長(zhǎng)期有功能存活，原因在于諸如急性排斥、慢性排斥、免疫抑制劑長(zhǎng)期大量應(yīng)用引起的感染及惡性腫瘤、移植物抗宿主反應(yīng)等嚴(yán)重威脅受者的長(zhǎng)期生存。因此，誘導(dǎo)和維持供體特異性免疫耐受被認(rèn)為是最終克服移植物排斥反應(yīng)的根本，也是移植免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。所謂供體特異性免疫耐受特征是指受體對(duì)供體異基因外源組織或器官耐受，但對(duì)非供體異基因抗原如細(xì)菌、病毒等仍保持免疫反應(yīng)性。針對(duì)免疫耐受，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了許多探索，涉及諸多領(lǐng)域(包括肝移植、腎移植、心臟移植、皮膚移植等)。Owen (1945)年首次觀察到天然免疫耐受現(xiàn)象，揭示了生物體存在免疫耐受。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，免疫耐受不但在免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)胸腺時(shí)發(fā)育產(chǎn)生，而且當(dāng)免疫細(xì)胞進(jìn)入外周后也能產(chǎn)生，這表明機(jī)體內(nèi)存在著胸腺外耐受機(jī)制，即不但成年動(dòng)物發(fā)育中的淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生免疫耐受，而且成熟的淋巴細(xì)胞也可以產(chǎn)生耐受。近年來(lái)，嵌合體誘導(dǎo)耐受已經(jīng)成為免疫研究的熱點(diǎn)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)建立嵌合體狀態(tài)能夠誘導(dǎo)穩(wěn)定的移植耐受。而且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)嵌合的程度越高，越有利于移植物存活。目前誘導(dǎo)免疫耐受大多采取多種措施聯(lián)合供體骨髓細(xì)胞輸注，使供體骨髓細(xì)胞在受體內(nèi)長(zhǎng)期存活，產(chǎn)生混合性嵌合狀態(tài)從而誘導(dǎo)免疫耐受。臨床資料顯示，肝臟移植比其他器官移植更易達(dá)到免疫耐受，可能原因是肝臟包含較多的過(guò)客白細(xì)胞。肝臟位于胃腸道與腔靜脈系統(tǒng)之間，是機(jī)體內(nèi)最大的單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，能吞噬處理大量來(lái)自胃腸道和門靜脈的抗原，其獨(dú)特的解剖學(xué)位置和代謝內(nèi)環(huán)境決定其在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，而門靜脈穿刺操作復(fù)雜，又有許多并發(fā)癥發(fā)生的危險(xiǎn)， 使其臨床應(yīng)用受到制約。肝細(xì)胞表面存在無(wú)唾液酸糖蛋白的受體，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)α 2-3 Neu預(yù)處理的骨髓細(xì)胞(bone marrow cells，BMCs)表面則富含無(wú)唾液酸糖蛋白。因此，經(jīng)適當(dāng)濃度的α 2_3 Neu預(yù)處理能增強(qiáng)BMCs對(duì)肝臟的親和性。我們通過(guò)濃度0. 2_3U/ml的α 2-3 Neu預(yù)處理供體骨髓細(xì)胞(donor Bone Marrow Cells，dBMCs)，經(jīng)尾靜脈注射，延長(zhǎng)了大鼠同種異體皮存活的時(shí)間。此種α 2-3 Neu在誘導(dǎo)免疫耐受中的應(yīng)用，其創(chuàng)傷小、易于操作而又安全可靠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有的誘導(dǎo)免疫耐受的方法的缺陷，提供一種神經(jīng)氨酸酶在移植免疫耐受中的應(yīng)用，具體而言，涉及神經(jīng)氨酸酶中的一種，即α 2-3神經(jīng)氨酸酶 (α 2-3Neu)。肝臟位于胃腸道與腔靜脈系統(tǒng)之間，其獨(dú)特的解剖學(xué)位置和代謝內(nèi)環(huán)境決定其在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，而門靜脈穿刺需要為暴露門靜脈而行剖腹手術(shù)，操作復(fù)雜，有大出血、血管栓塞、門靜脈血栓、肝動(dòng)脈損傷、膽漏、感染等并發(fā)癥發(fā)生的危險(xiǎn)，還增加皮膚移植等腹外組織器官移植的額外創(chuàng)傷，也使其臨床應(yīng)用受到制約。神經(jīng)氨酸酶多用于流感病毒感染的預(yù)防，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)α 2-3Neu新的臨床用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，濃度為0. 2-3U/ml的α 2-3Neu預(yù)處理不影響靜脈輸注后dBMCs在各個(gè)器官的分布形式，仍以肝臟內(nèi)分布最多，胸腺內(nèi)分布最少；因此經(jīng)適當(dāng)濃度的a2-3NeU 預(yù)處理可使dBMCs靶向分布于受體肝臟內(nèi)，從而增強(qiáng)其對(duì)肝臟的親和性，從而達(dá)到經(jīng)門靜脈注射的效果。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，肝臟對(duì)經(jīng)外周靜脈注入的dBMCs有更強(qiáng)的捕獲能力或者親和性， 且dBMCs與受體細(xì)胞發(fā)生嵌合。在dBMCs輸注后15天后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組受體肝臟內(nèi)可見(jiàn)造血集落形成，且這些集落呈多細(xì)胞系，即異基因細(xì)胞注入受體內(nèi)并沒(méi)有被立即清除，而是通過(guò)一定的方式移行到受體肝臟內(nèi)并形成造血集落。濃度為0. 2-3U/ml的a2-3NeU預(yù)處理組部分受體內(nèi)可檢測(cè)到供體Y染色體的特異片斷，而對(duì)照組沒(méi)有檢測(cè)到。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，在皮膚移植術(shù)前使用時(shí)，dBMCs經(jīng)外周靜脈輸注，聯(lián)合應(yīng)用環(huán)孢素 A (CsA)可延長(zhǎng)術(shù)后移植的同種異體皮片的存活時(shí)間；而dBMCs經(jīng)α 2_3Neu預(yù)處理后經(jīng)外周靜脈輸注，聯(lián)合應(yīng)用CsA可進(jìn)一步延長(zhǎng)移植的同種異體皮片的存活時(shí)間。本發(fā)明為誘導(dǎo)移植免疫耐受提供了新的途徑和手段。


圖1對(duì)照組受體肝臟內(nèi)的造血集落形成(HEX400)
圖2 α 2-3Neu 0. 5U/ml組受體肝臟內(nèi)的造血集落形成(HEX400)； 圖3 α 2-3Neu 1. OU/ml組受體肝臟內(nèi)的造血集落形成(HEX400)； 圖4a 2-3Neu 2. OU/ml組受體肝臟內(nèi)的造血集落形成(HEX 400)； 圖5 Y染色體基因片斷PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中M即Marker為標(biāo)準(zhǔn)品條帶；1 為雌性對(duì)照組，2為雄性對(duì)照組條帶；3為1. OU組條帶；4為1. OU組條帶；5為對(duì)照組；6為 0. 5U 組。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理供體骨髓細(xì)胞在受體全身各主要組織器官的分布
1、受體為WiStar大鼠，雌性；BMCs供體為SD大鼠，雄性。將受體Wistar大鼠按所輸注dBMCs的Neu預(yù)處理濃度分組；
2、無(wú)菌條件下取SD大鼠股、脛骨，用冷PBS液沖洗骨髓腔，收集dBMCs；
3、按照設(shè)定的α2-3 Neu和α 2_6Neu濃度范圍，預(yù)處理dBMCs ；
4、取上述Neu預(yù)處理后的dBMCs懸液，放射性物質(zhì)做標(biāo)記；5、給受體Wistar大鼠尾靜脈注射新標(biāo)記的dBMCs懸液，注射5小時(shí)后，取受體心、肝、 脾、雙肺、雙腎、胸腺、股骨(單側(cè))，放免測(cè)量?jī)x檢測(cè)各組織器官的放射性活度。結(jié)論經(jīng)適當(dāng)濃度的Neu預(yù)處理的dBMCs對(duì)肝臟有極強(qiáng)的親和性，也即dBMCs經(jīng) Neu預(yù)處理后能偏向性分布于受體肝臟內(nèi)；而且在肝臟中BMCs的分布，經(jīng)過(guò)α 2-3Neu預(yù)處理的明顯比經(jīng)過(guò)α 2-6Neu預(yù)處理的百分率高，可見(jiàn)α 2-3Neu預(yù)處理的dBMCs對(duì)肝臟有更強(qiáng)的親和性，即增加肝臟耐受，而肝臟在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。實(shí)施例2神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理供體骨髓細(xì)胞對(duì)造血集落及嵌合體形成的影響
1、受體為Wistar大鼠，雌性；BMCs供體為SD大鼠，雄性。將受體Wistar大鼠按所輸注dBMCs的α 2-3 Neu預(yù)處理濃度分組；
2、同實(shí)例1中所述，dBMCs懸液的制備；
3、按照設(shè)定的α2-3 Neu濃度范圍，預(yù)處理dBMCs ；
4、尾靜脈注射新制備的骨髓細(xì)胞，然后單籠飼養(yǎng)；
5、于尾靜脈注射15天后，取外周血提取DNA，再取Wistar大鼠心、肝、脾、肺、腎、胸腺， 取材，HE染色；
6、按照說(shuō)明書進(jìn)行全血基因組DNA提?。?br> 7、HE染色，組織學(xué)檢測(cè)；
8、設(shè)計(jì)合成大鼠Y染色體引物，PCR擴(kuò)增上述提取的受體全血DNA，電泳分析。結(jié)論形成的造血集落呈多細(xì)胞系，表明dBMCs經(jīng)外周靜脈輸注可遷移至受體肝臟內(nèi)，并且可形成造血集落(圖1-4)。雄性組擴(kuò)增出特異性片段，而雌性無(wú)此特異性擴(kuò)增條帶。實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增出與雄性組相同的條帶，說(shuō)明形成了嵌合狀態(tài)，即形成免疫耐受。(見(jiàn)圖5)。實(shí)例3神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理供體骨髓細(xì)胞延長(zhǎng)大鼠同種異體皮的存活時(shí)間
1、受體為Wistar大鼠，雌性；供體為SD大鼠，雄性。將受體大鼠分為空白對(duì)照組，只進(jìn)行異體皮移植；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，尾靜脈輸注未處理的dBMCs，聯(lián)合應(yīng)用CsA ；實(shí)驗(yàn)組，尾靜脈輸注α 2-3 Neu處理的dBMCs，聯(lián)合應(yīng)用CsA ；
2、取SD大鼠股、脛骨，收集dBMCs。切取大鼠背部全層皮膚，制備皮片備用；
3、α2-3 Neu 預(yù)處理 dBMCs ；
4、受體大鼠尾靜脈注射上述細(xì)胞懸液，于受體背部建立皮膚缺損，移植與所輸注dBMCs 同一供體的大鼠中厚皮片，其中空白對(duì)照組異體皮片來(lái)自α 2-3 Neu-dBMCs組異體皮片的相應(yīng)供體；
5、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組分別于術(shù)后第2、第5天給予CsA；
6、于術(shù)后5天打開敷料，每天換藥、照相并記錄皮片存活情況。結(jié)論術(shù)后皮片全部存活，空白對(duì)照組存活時(shí)間7-10天左右；聯(lián)合短期應(yīng)用CsA 后，dBMCs經(jīng)外周靜脈輸注可延長(zhǎng)移植的皮片的存活時(shí)間，大概存活9-13天；聯(lián)合短期應(yīng)用 CsA后，dBMCs經(jīng)α 2-3 Neu預(yù)處理可進(jìn)一步延長(zhǎng)移植的同種異體皮片的存活時(shí)間，大概存活12-16天，說(shuō)明形成了免疫耐受，排斥反應(yīng)進(jìn)一步降低，同時(shí)皮片的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)， 可知α 2-3 Neu在移植免疫耐受中有很好的誘導(dǎo)作用。
權(quán)利要求
1.α 2-3神經(jīng)氨酸酶在制備誘導(dǎo)移植免疫耐受的生物制品中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的α2-3神經(jīng)氨酸酶的應(yīng)用，其特征在于經(jīng)濃度為0.2-3U/ml 的α 2-3神經(jīng)氨酸酶對(duì)供體骨髓細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，獲得表面富含無(wú)唾液酸糖蛋白的供體骨髓細(xì)胞，而肝細(xì)胞表面存在無(wú)唾液酸糖蛋白的受體，增強(qiáng)供體骨髓細(xì)胞對(duì)受體肝臟的親和性。
3.如權(quán)利要求2所述ci2-3神經(jīng)氨酸酶的應(yīng)用，其特征在于經(jīng)濃度為0.2-3U/ml的 α 2-3神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理獲得的表面富含無(wú)唾液酸糖蛋白的供體骨髓細(xì)胞，經(jīng)外周靜脈輸注，其供體骨髓細(xì)胞偏向性分布于受體肝臟內(nèi)，且形成造血細(xì)胞集落。
4.如權(quán)利要求3所述α2-3神經(jīng)氨酸酶的應(yīng)用，其特征在于表面富含無(wú)唾液酸糖蛋白的供體骨髓細(xì)胞輸注15天后，經(jīng)濃度為0. 2-3U/ml的α 2-3神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理組部分受體內(nèi)可檢測(cè)到供體Y染色體特有的性別決定基因序列，且形成免疫耐受的嵌合狀態(tài)。
5.如權(quán)利要求1所述α2-3神經(jīng)氨酸酶的應(yīng)用，其特征在于在皮膚移植術(shù)前使用，經(jīng)濃度為0. 2-3U/ml的α 2-3神經(jīng)氨酸酶對(duì)供體骨髓細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，獲得表面富含無(wú)唾液酸糖蛋白的供體骨髓細(xì)胞，經(jīng)外周靜脈輸注經(jīng)α 2-3神經(jīng)氨酸酶所述預(yù)處理的供體骨髓細(xì)胞時(shí)，聯(lián)合使用環(huán)孢素A (CsA),以延長(zhǎng)移植的同種異體皮片成活時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種α2-3神經(jīng)氨酸酶在誘導(dǎo)移植免疫耐受中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種神經(jīng)氨酸酶，即α2-3神經(jīng)氨酸酶(α2-3Neuraminidase，縮寫為α2-3Neu)，它選自幾類神經(jīng)氨酸酶中的一種，是一種高度特異性的外切糖苷酶，主要催化α2-3糖苷鍵的水解。適當(dāng)濃度的α2-3Neu預(yù)處理可明顯增強(qiáng)供體骨髓細(xì)胞(donorBoneMarrowCells，dBMCs)與肝臟的親和性，使經(jīng)外周靜脈輸注的dBMCs靶向性分布于受體肝臟內(nèi)，并且可以形成造血細(xì)胞集落。受體輸注適當(dāng)濃度的α2-3Neu預(yù)處理組dBMCs后15天，較多的受體內(nèi)可檢測(cè)到供體Y染色體特有的性別決定基因(SRY)序列，說(shuō)明α2-3Neu預(yù)處理更易誘導(dǎo)嵌合狀態(tài)形成。α2-3Neu預(yù)處理dBMCs聯(lián)合短期應(yīng)用環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)可明顯延長(zhǎng)移植的供體皮片成活時(shí)間。此α2-3Neu在移植免疫耐受中有很好的誘導(dǎo)作用。
文檔編號(hào)A61K38/47GK102218135SQ20111015140
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者周靈, 彭代智, 李芳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院