專(zhuān)利名稱(chēng)：抗VEGF/PDGFRβ雙特異性抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專(zhuān)利涉及雙特異性單克隆抗體藥物，特別涉及抗腫瘤血管新生的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)的雙特異性單克隆抗體藥物；
背景技術(shù)：
早在一個(gè)多世紀(jì)以前，就有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)腫瘤生長(zhǎng)伴隨著新生血管生成(!^errara 2002)。但直到1939年，才由Ide及其同事首次提出，可能存在著某種腫瘤來(lái)源的血管生長(zhǎng)刺激因子為腫瘤的生長(zhǎng)提供血管供應(yīng)(Ide et al. 1939)。數(shù)年后，由于觀察到血管密度的增高會(huì)先于腫瘤的快速生長(zhǎng)，Algire等人認(rèn)為“腫瘤的快速擴(kuò)散取決于豐富的血管供給”(Algire et al. 1945)。在上個(gè)世紀(jì)六十年代，Greenblatt、Shubik(Greenblatt et al. 1968)和Ehrmann、Knoth (Ehrmann et al. 1968)兩個(gè)研究小組的實(shí)驗(yàn)相繼提供初步證據(jù)，證實(shí)腫瘤的血管生成是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的某些可擴(kuò)散因子介導(dǎo)。1971年，美國(guó)科學(xué)家?？寺?Judah Folkman)在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》中提出， 抗血管生成可能是一種有效的抗癌手段(Folkman 1971)。從七十年代早期開(kāi)始，以這個(gè)前瞻性的假說(shuō)為基礎(chǔ)，福克曼及其研究小組致力于從人體和動(dòng)物的腫瘤中分離某種‘腫瘤血管生成因子‘(Folkman et al. 1971)。1978年，Gullino也提出了抑制血管生成能避免癌癥的觀點(diǎn)(Gullino 1978)。隨后，多種血管源因子(如，表皮生長(zhǎng)因子EGF，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-α、TGF-β，腫瘤生長(zhǎng)因子TNF-α和血管生長(zhǎng)素等)先后被發(fā)現(xiàn)(Folkman et al. 1987)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，也可寫(xiě)作 VEGF-A)是一個(gè)血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)于VEGF基因家族在血管生成調(diào)節(jié)中所扮演的角色，人們已經(jīng)深入研究了十多年之久Perrara 2002)。VEGF家族目前主要包括原型成員(VEGF-A)、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placenta growth factor, P1GF) (Maglione et al. 1991)、 VEGF-B (Olofsson et al. 1996), VEGF-C (Joukov et al. 1996), VEGF-D (Orlandini et al. 1996)。其中VEGF-A是誘導(dǎo)腫瘤血管生成作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子。VEGF 有3個(gè)高親合性的酪氨酸激酶受體(RTKs)，分別為VEGFR-I (Flt-I) (Shibuya et al. 1990 ； de Vries et al. 1992)、VEGFR-2 (KDR、Flk-1) (Yoshiji et al. 1996 ；Ellis et al. 1998 ； Tomisawa et al. 1999)和 VEGFR3 (Flt_4) (Joukov et al. 1996)。KDR 是血管形成的主要調(diào)控分子，具有明顯的化學(xué)趨化和促分裂作用，與血管島、血管形成和造血有關(guān)。腫瘤的生長(zhǎng)有兩個(gè)明顯不同的階段，即從無(wú)血管的緩慢生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是促成上述轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如果沒(méi)有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)不會(huì)超過(guò)1 2mm3。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因，而在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的多步驟過(guò)程中，血管生成均發(fā)揮著重要作用。原位雜交研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF mRNA在多種人類(lèi)腫瘤中都有表達(dá)，包括肺癌(Volmet al. 1997)、乳腺癌(Yoshiji et al. 1996)、胃腸癌(Ellis et al. 1998)、腎癌(Tomisawa et al. 1999)和卵巢癌(Sowter et al. 1997)。多家實(shí)驗(yàn)室使用多種抗VEGF的手段均已實(shí)現(xiàn)了腫瘤生長(zhǎng)的抑制，這些方法包括針對(duì)VEGF或其受體(VEGFRs)的抗體、可溶性受體， VEGFRs酪氨酸激酶的小分子抑制劑以及利用VEGF的突變異二聚體封閉其受體結(jié)合位點(diǎn)寸。1993年，費(fèi)拉拉制備了 VEGF的鼠源性抗體，在體外實(shí)驗(yàn)中，鼠源性抗體可以顯著抑制數(shù)種人類(lèi)癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)。從此，VEGF抗體的臨床應(yīng)用價(jià)值開(kāi)始顯露。為了降低鼠源性抗體的免疫原性，費(fèi)拉拉將鼠源抗體的骨架換做了人源抗體IgGl的部分，由此誕生了基因泰克公司“重磅炸彈級(jí)”藥物一貝伐單抗(Avastin)。它是一種抗VEGF的人源化抗體(IgGl)，93 %的人源結(jié)構(gòu)域和7 %的鼠源結(jié)合區(qū)域組成，是全世界第一個(gè)被批準(zhǔn)用于抑制血管生長(zhǎng)的單克隆抗體藥物，2004年2月美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)該藥用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌(mCRC)、小細(xì)胞分子肺癌(6BM)和轉(zhuǎn)移性腎癌。阿瓦斯汀區(qū)別于已有抗癌藥物，以VEGF為藥物靶點(diǎn)，加之抗體的特異性結(jié)合能力，使其臨床療效顯著。在人體試驗(yàn)中，即使對(duì)于晚期的癌癥患者，注射阿瓦斯汀也可延長(zhǎng)壽命數(shù)月。2007年ASCO會(huì)議Souglakos報(bào)道Avastin聯(lián)合靶向EGFR的單克隆抗體 Cetuximab (西妥昔單抗)可以安全有效地治療化療失敗的晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。基因泰克公司正在用Avastin對(duì)超過(guò)40種癌癥進(jìn)行適應(yīng)癥研究，希望可以生產(chǎn)出更多的單抗延伸產(chǎn)品。同時(shí)，他們也在研究將全抗體分子IgG切割之后，先將蛋白用原核細(xì)胞表達(dá)，然后再將其通過(guò)基因工程的手段連接為IgG。除了癌癥外，VEGF也是治療包括老年性黃斑變性(AMD)，糖尿病引起的眼底病在內(nèi)的多種眼科疾病關(guān)鍵。為了治療這些疾病，在Avastin的基礎(chǔ)上，基因泰克公司又將其全抗體分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡(jiǎn)化，保留能夠中和VEGF的抗體片段，同時(shí)將給藥途徑由靜脈注射改為玻璃體直接注射，由此成就另一藥物一Avastin的孿生姊妹蘭尼單抗(Lucentis)。 2006年，蘭尼單抗被美國(guó)藥監(jiān)局批準(zhǔn)用于治療老年黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)，很快就成為治療老年性黃斑變性，糖尿病引起的眼底病的首選藥，占領(lǐng)北美市場(chǎng)80%以上的份額。血小板衍生生長(zhǎng)因子及其受體血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)是普遍存在的一種由sis原癌基因編碼的生長(zhǎng)因子，最初從血小板α中分離得到，主要由巨核細(xì)胞合成，在組織損傷修復(fù)，血管生成和細(xì)胞分化過(guò)程中起到非常重要的作用(Heldin 1992)。PDGF分子是一個(gè)糖蛋白二聚體，可分為_(kāi)AA，-BB和-AB三種類(lèi)型。PDGF及其受體 (Platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)在多種人體月中瘤中都有比較高的表達(dá)，如胰腺癌，小細(xì)胞肺癌，胃癌和乳腺癌等。PDGFR是一種位于細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶(Rec印tor tyrosine kinase, RTK)，可分為兩個(gè)亞型PDGFRα和PDGFR0 (Matsui et al. 1989)。PDGFRβ可以特異性的與PDGF-BB或-AB結(jié)合(Herdaran et al. 1991)而被激活。被激活后，兩個(gè)PDGFR之間可以形成二聚體，并通過(guò)自身磷酸化激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)到通路，以實(shí)現(xiàn)其調(diào)控細(xì)胞分化生長(zhǎng)的功能。近年來(lái)，針對(duì)VEGF的靶向型藥物對(duì)治療癌癥以及老年性黃斑變性(AMD)取得了非常顯著的療效O^errara et al. 2007)。但是這種針對(duì)VEGF的靶向治療仍然存在許多不足， 還有很多改進(jìn)的空間。例如有的病人對(duì)該療法具有一種內(nèi)在的耐藥性，另外一些癌癥病人經(jīng)治療后，短期內(nèi)取得了較好的療效，但是這種療效只能維持比較短的時(shí)間，之后腫瘤又重新生長(zhǎng)(Jain et al. 2005, Shojaei et al. 2007, Gaur et al. 2009)。對(duì)于這種對(duì)VEGF靶向治療的抗性，又一種觀點(diǎn)認(rèn)為新生血管周細(xì)胞(pericytes)所分泌的PDGFRi^在其中起到了非常重要的作用(Abramsson et al. 2003，Mancuso et al. 2006,Bergers et al. 2008)?？筕EGF/PDGFR0雙特異性抗體通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的癌細(xì)胞模型和小鼠模型所獲的證據(jù)表明，共同抑制VEGF/VEGFR 和PDGF/PDGFR的功能比單獨(dú)針對(duì)VEGF/VEGFR能更有效的抑制腫瘤組織內(nèi)新生血管的生長(zhǎng)(Bergers et al. 2003，Erber et al. 2004，Pietras et al. 2005，Jo et al. 2006， Shen et al. 2007)。目前，已經(jīng)有一部分小分子受體酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)被證實(shí)能夠用于治療癌癥(Hiles et al. 2008)。這些抑制劑能夠與包括VEGFR和PDGFR在內(nèi)的很多細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)合，抑制其功能，從而達(dá)到治療癌癥的目的 (Fabian et al. 2005)。但是這些小分子抑制劑對(duì)人體具有一定的毒性，特別是其與化療相結(jié)合的時(shí)候，毒性更大(Sosman et al. 2007，Roodhart et al. 2008)。相比抑制劑療法，運(yùn)用單一的，具有抗VEGF和PDGF信號(hào)通路雙特異性的人源化抗體作為抗腫瘤藥物，具有更大的優(yōu)勢(shì)和更光明的前景。參考文獻(xiàn)Abramsson A, Lindblom P, Betsholtz C. Endothelial and nonendothelial sources of PDGF-B regulate pericyte recruitment and influence vascular pattern formation in tumors. The Journal of clinical investigation. 2003 ；112 :1142-51.Algire, G. H. , Chalkley, H. W. , Legallais, F. Y. & Park, H. D. Vascular reactions of normal and malignant tissues in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl Cancer Inst.1945,6,73-85.Bergers G, Hanahan D. Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nature reviews. 2008；8 :592-603.Bergers G, Song S, Meyer-Morse N, Bergsland E, Hanahan D.Benefits of targeting both pericytes and endothelial cells in the tumor vasculature with kinase inhibitors. J Clin Invest. 2003 ；111 :1287-95.de Vries, C. et al. The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science. 1992,255,989-991.Ehrmann, R. L. & Knoth, M.Choriocarcinoma. Transfilter stimulation of vasoproliferation in the hamster cheek pouch.Studied by light and electron microscopy. J. Natl. Cancer Inst.1968,41,1329-1341.Ellis, L. M. et al. Vessel counts and vascular endothelial growth factor expression in pancreatic adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 1998, 34, 337-340.Erber R,Thurnher A,Katsen AD,Groth G,Kerger H,Hammes HP,et al. Combined inhibition of VEGF and PDGF signaling enforces tumor vessel regression by interfering with pericyte-mediated endothelial cell survival mechanisms. FASEBJ. 2004 ；18 :338-40.Fabian MA, Biggs WH,3rd, Treiber DK, Atteridge CE, Azimioara MD， Benedetti MG，et al. A small molecule—kinase interaction map for clinical kinase inhibitors. Nat Biotechnol. 2005 ；23 :329-36.Ferrara, N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nature Rev. Cancer. 2002，2，795-803.Ferrara N，Mass RD，Campa C，Kim R. Target ing VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 2007 ；58 :491-504.Folkman J. Tumor angiogenesis :therapeutic implication[J]. N Engl J Med, 1971,285(21) :11821186.Folkman, J. & Klagsbrun, Μ. Angiogenic factors. Science. 1987, 235,442-447.Folkman，J.，Merler，E.，Abernathy, C. &Williams, G. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. J. Exp. Med. 1971，133，275-288·Gaur P，Bose D，Samuel S，Ellis LM. Targeting tumor angiogenesis. Semin Oncol. 2009 ；36 :12-9.Gullino，P. M. Angiogenesis and oncogenesis. J. Natl Cancer Inst. 1978，61， 639-643.Heidaran MA，Pierce JH, Yu JC, Lombardi D， Artrip JE, Fleming TP， Thomason A，Aaronson SA. Role of alpha β receptor heterodimer formation in β platelet-derived growth factor (PDGF) receptor activation by PDGF-AB. J Biol Chem. 1991 ；266 (30) :20232-7.Heldin CH. Structural and functional studies on platelet-derived growth factor. EMBO J. 1992 ；11 (12) :4251-9.Hiles JJ，Kolesar JM. Role of sunitinib and sorafenib in the treatment of metastatic renal cell carcinoma. Am J Health Syst Pharm. 2008 ；65 :123-31.Ide, A. G.，Baker，N. H. &Warren, S. L. Vascularization of theBrown Pearce rabbit epithelioma transplant as seen in thetransparent ear chamber. Am. J. Roentgenol. 1939，42，891-899.Jain RK. Antiangiogenic therapy for cancer :current and emerging concepts. Oncology. 2005 ；19 :7-16.Jo N，Mailhos C， Ju M， Cheung E, Bradley J， Nishijima K， et al. Inhibition of platelet-derived growth factor B signaling enhances the efficacy of anti-vascular endothelial growth factor therapy in multiple models of ocular neovascularization. Am J Pathol. 2006 ；168 :2036-53.Joukov, V. et al. A novel vascular endothelial growth factor，VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases. EMBO J. 1996，15，1751.Mancuso MR，Davis R，Norberg SM, 0' Brien S，Sennino B，Nakahara T，et al. Rapid vascular regrowth in tumors after reversal of VEGF inhibition. J ClinInvest. 2006 ；116 :2610-21.Matsui T, Heidaran M，Miki T，Popescu N, La Rochelle W, Kraus M, Pierce J, Aaronson S.Isolation of a novel receptor cDNA establishes the existence of two PDGF receptor genes. Science. 1989 ；243 (4892) :800-4.Pietras K， Hanahan D.A multitargeted， metronomic and maximum-tolerated dose "chemo-switch"regimen is antiangiogenic,producing objective responses and survival benefit in a mouse model of cancer. J Clin Oncol. 2005 ；23 :939-52.Roodhart JM，Langenberg MH, Witteveen E，Voest EE.The molecular basis of class side effects due to treatment with inhibitors of the VEGF/VEGFR pathway. Curr Clin Pharmacol. 2008 ；3 :132-43.Shen J，Vil MD，Zhang H，Tonra JR，Rong LL，Damoci C，et al.An antibody directed against PDGF receptor β enhances the antitumor and the anti—angiogenic activities of an anti-VEGF receptor 2antibody. Biochem Biophys Res Commun. 2007 ； 357 :1142-7.Shibuya，M. et al. Nucleotide sequence and expression of a novel human receptor-type tyrosine kinase(fit)closely related to the fms family. Oncogene. 1990，8，519-527.Shojaei F,Ferrara N. Antiangiogenic therapy for cancer :an update. Cancer J. 2007 ；13 :345-8.Sosman JA, PuzanovI, Atkins MB. Opportunities and obstacles to combination targeted therapy in renal cell cancer. Clin Cancer Res. 2007 ； 13 764-9.Sowter, H. Μ. et al. Expression and localization of the vascular endothelial growth factor family in ovarian epithelial tumors. Lab. Invest. 1997, 77，607-614.Tomisawa，M. et al. Expression pattern of vascular endothelial growth factor isoform is closely correlated with tumour stage and vascularisation in renal cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 1999, 35,133-137.Yoshij i，H.，Gomez, D. E.，Shibuya, M. & Thorgeirsson，U. P. Expression of vascular endothelial growth factor, its receptor, and other angiogenic factors in human breast cancer. Cancer Res. 1996，56，2013-2016·

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明提供抗VEGF-PDGFR雙特異性抗體，其運(yùn)用基因工程等技術(shù)手段，將識(shí)別 VEGF和識(shí)別PDGFR β的抗體片段構(gòu)建在同一抗體分子中，能夠特異性的與這兩者結(jié)合，其抑制腫瘤組織血管新生的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用抗VEGF抗體。技術(shù)方案抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體，其特征在于該抗體由抗VEGF單克隆抗體為基礎(chǔ)，并在其FC段末端連接抗PDGFR β單鏈抗體構(gòu)成。FC段末端通過(guò)(GGGGQ 3連接抗PDGFR β單鏈抗體?？筕EGF 單克隆抗體由 Anti-VEGF A Fab VH-CH、Anti-VEGF A Fab VL-CL 禾口 Fc 組成；其中 Anti-VEGF A Fab VH-CH 的氨基酸序列表為 SEQ NO. 3、Anti-VEGF A Fab VL-CL 的氨基酸序列表為SEQ NO. 4、Fc的氨基酸序列表SEQN0. 5。所述的抗PDGFR β 單鏈抗體由 Anti-PDGFR β scFv VL 和 Anti-PDGFR β scFv VH 通過(guò)(GGGGS)3連接而成組成；其中Anti-PDGFR^ scFv VL的氨基酸序列表為SEQ NO. 1、 Anti-PDGFR β scFv VH 的氨基酸序列表為 SEQ NO. 2。抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。有益效果1、本專(zhuān)利涉及的雙特異性抗體是運(yùn)用基因工程等技術(shù)手段，將識(shí)別VEGF和識(shí)別 PDGFRii的抗體片段構(gòu)建在同一抗體分子中，能夠特異性的與這兩者結(jié)合，其抑制腫瘤組織血管新生的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用抗VEGF抗體，并且具有很好看腫瘤活性。 2、本專(zhuān)利涉及的雙特異性抗體可以特異性結(jié)合VEGF-A和PDGFR β分子，抑制其刺激新生血管生長(zhǎng)的生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)表明，該雙特異性抗體單獨(dú)結(jié)合VEGF-A或PDGFR β的能力與抗VEGF-A或抗PDGFRβ單克隆抗體近似，并且其具有很強(qiáng)的同時(shí)與這兩種抗原結(jié)合的能力。實(shí)驗(yàn)表明，同時(shí)抑制VEGF-A和PDGFR β比單獨(dú)抑制兩者中的一種能夠更好的抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)，因此使用該雙特異性抗體即能有效的抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)，又能避免同時(shí)使用兩種單克隆抗體時(shí)用藥量的增加，給患者帶來(lái)的不可預(yù)知的風(fēng)險(xiǎn)。


圖1.抗VEGF-PDGFRii雙特異性抗體結(jié)構(gòu)示意圖。該抗體由抗VEGF單克隆抗體為基礎(chǔ)，并在其FC段末端連接抗PDGFRii單鏈抗體(scFv)構(gòu)成；圖2.抗VEGF-PDGFRii雙特異性抗體重鏈表達(dá)載體；圖3.抗VEGF Fab輕鏈表達(dá)載體；圖4.抗VEGF_PDGFR0雙特異性抗體(bsAb)同時(shí)結(jié)合hVEGF-A和PDGFR β測(cè)試 (Biacore)。第一步，流動(dòng)相中的bsAb與固定相中的hVEGF-A結(jié)合；第二步，hVEGF-A-bsAb 復(fù)合物與流動(dòng)相中的PDGFR β結(jié)合0nM PDGFR β (藍(lán)線)，500nM PDGFR β (紅線)。圖5.抗VEGF-PDGFR β雙特異性抗體抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和人腦血管周細(xì)胞(HBVP)生長(zhǎng)體外試驗(yàn)A.在2nM VEGF-A存在的條件下，HUVECs中分別加入 anti-VEGF mAb (bevacizumab)，anti-VEGF scFv 和 anti-VEGF-PDGFR β bsAb,培養(yǎng) 48 小時(shí)；B.在 0. 4nM PDGFR β 存在的條件下，HBVP 中分別加入 anti-PDGFR β mAb, anti-PDGFR β scFv 和 anti-VEGF-PDGFR β bsAb。(η = 4)；圖6. HUVECs和HBVP共培養(yǎng)，測(cè)試抗VEGF-PDGFR β bsAb對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，及內(nèi)皮細(xì)胞-周細(xì)胞結(jié)合的抑制作用A. Bevacizumab，Bevacizumab+anti PDGFR β 和anti-VEGF-PDGFR β bsAb (同為25nM)對(duì)新生血管生長(zhǎng)的抑制效果；B.不同濃度的 Bevacizumab和anti-VEGF-PDGFR β bsAb對(duì)新生血管生長(zhǎng)的抑制效果。圖7.重組雙特異性單克隆抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與生產(chǎn)流程圖。構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，在96孔板中培養(yǎng)，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。篩選得到的細(xì)胞株逐級(jí)放大培養(yǎng)，最后在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1抗VEGF-PDGFRbeta雙特異性抗體的制備方法1.抗VEGF-PDGFRbeta雙特異性抗體(bsAb)核苷酸序列設(shè)計(jì)和合成根據(jù)該bsAb 重鏈 VHvegf-CHI腳-CH2VEGF-CH3VEGF-(GGGGS) 3-VHPDGFKbeta-(GGGGS)3-VLPDGFEbeta的氨基酸序列和連接形式設(shè)計(jì)重鏈核苷酸序列，并在該序列5’端加入Me I 酶切位點(diǎn)，KOZAK序列及前導(dǎo)序列，在其3’端加入)(h0 I酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)3個(gè)3’端含 EcoRI酶切位點(diǎn)的寡核苷酸引物，分別合成重鏈VHvkf-CHIvkf, CH2VEeF-CH3VE(;F-(GGGGS)3和 VHPDeFKbeta-(GGGGS) 3-VLPDeFKbeta片斷，應(yīng)用 PCR直接連接法(SDL PCR)合成全長(zhǎng) 2118bp 的 bsAb 重鏈基因。根據(jù)人抗VEGF-A IgGl輕鏈氨基酸序列，設(shè)計(jì)5，端含Not I酶切位點(diǎn)，KOZAK序列及前導(dǎo)序列，3’端含hi I酶切位點(diǎn)的PCR引物，應(yīng)用PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)639bp的人抗VEGF-A 輕鏈基因。2.抗 VEGF-PDGFRbeta bsAb 表達(dá)載體的構(gòu)建將該bsAb重鏈基因用Me I和Xho I雙酶切，將輕鏈基因用Not I,Psi I雙酶切后，用T4連接酶將重鏈基因連接到經(jīng)Mc I和B10 I處理的真核表達(dá)載體中；將輕鏈基因連接到經(jīng)Not I和hi I處理的真核表達(dá)載體中。這兩個(gè)表達(dá)載體(包含phoA啟動(dòng)子)接著被轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)大腸桿菌菌株。轉(zhuǎn)化后的BL21菌株選取陽(yáng)性克隆，在含50ug/mL的LB培養(yǎng)基QmL)中于37°C過(guò)夜培養(yǎng)。之后菌株轉(zhuǎn)入2L含50ug/mL的CRAP培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)M小時(shí)。菌液3000轉(zhuǎn)常溫離心棄上清，所得的大腸桿菌用Qiagen公司的質(zhì)粒提取試劑盒裂解并提取質(zhì)粒，獲得含重鏈和輕鏈的表達(dá)載體。純化后的兩個(gè)表達(dá)載體用電穿孔法同時(shí)轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中，在新霉素(neo)存在的條件下懸浮培養(yǎng)。重組抗體用親和層析法(Protein Α)和分子篩層析分離提純分子量為 200kDa左右的完整雙特異性抗體分子。提純后的各個(gè)組分通過(guò)SDS-PAGE法鑒定。實(shí)施例2抗原抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)抗原抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)均使用Biacore T 100系統(tǒng)(GE Healthcare)高密度的 VEGF-A (1000RU)通過(guò)共價(jià)結(jié)合固定于CM4芯片上，bsAb稀釋至IOOnM并注入系統(tǒng)，使其以 10uL/min的流速流過(guò)固定于芯片上的VEGF-A表面，共5分鐘。PDGFR β (500ηΜ)隨后以 30uL/min的流速注入，共10分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的結(jié)合曲線由Biacore Evaluation Software vl. 1. 1自動(dòng)生成。共結(jié)合實(shí)驗(yàn)得到的曲線與該雙特異性抗體分別與VEGF-A或PDGFRii結(jié)合生成的曲線基本一致，說(shuō)明該抗體能夠同時(shí)特異性結(jié)合VEGF-A和PDGFRii。見(jiàn)圖4.抗 VEGF-PDGFR β雙特異性抗體(bsAb)同時(shí)結(jié)合hVEGF-A和PDGFR0測(cè)試(Biacore)。第一步，流動(dòng)相中的bsAb與固定相中的hVEGF-A結(jié)合；第二步，hVEGF-A-bsAb復(fù)合物與流動(dòng)相中的 PDGFR β 結(jié)合0nM PDGFR β (藍(lán)線)，500nM PDGFR β (紅線)。實(shí)施例3
抗體抑制血管實(shí)驗(yàn)比較HUVECs細(xì)胞接入96孔板，密度為每孔1000個(gè)細(xì)胞左右，于EGM-2MV培養(yǎng)基中37°C 培養(yǎng)48小時(shí)，之后細(xì)胞于含1乘胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒納的無(wú)血清培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)。M 小時(shí)后移除原培養(yǎng)基，換含有2. 6nM hVEGF-A及不同濃度(0. 0005nM-500nM)的抗VEGF-A 全抗(bevazimumab)，抗VEGF-A Fab或bsAb，37°C培養(yǎng)M小時(shí)。之后細(xì)胞中加入IuCi/孔的3H-胸苷，37°C培養(yǎng)M小時(shí)。HBVPs細(xì)胞接入96孔板中，密度為每孔500個(gè)細(xì)胞左右。細(xì)胞于含血清及PGS的培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)48小時(shí)，之后換無(wú)血清培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)M小時(shí)。加入0. 4nM PDGFR β 以刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)加入不同濃度梯度QOOOnM-O. 02ηΜ)的抗PDGFR β全抗體，抗PDGFR β scFv或bsAb，繼續(xù)37°C培養(yǎng)24小時(shí)。每孔加入IuCi 3H-胸苷，培養(yǎng)6小時(shí)。細(xì)胞DNA中插入的3H-胸苷量用I^ackard Top count測(cè)量，數(shù)據(jù)分析由GraphPad Prism software完成。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗VEGF-PDGFR β bsAb對(duì)VEGF或PDGFR β介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。而且該bsAb對(duì)VEGF介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)，或者PDGFR β 介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與分別使用bevacizumab或anti-PDGFR β單抗效果相近。見(jiàn)圖5.抗VEGF-PDGFR β雙特異性抗體抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和人腦血管周細(xì)胞(HBVP)生長(zhǎng)體外試驗(yàn)A.在2nM VEGF-A存在的條件下，HUVECs中分別加入anti_VEGF mAb (bevacizumab)，anti-VEGF scFv 禾口 anti-VEGF-PDGFR β bsAb,培養(yǎng) 48 小時(shí)；B.在 0. 4nM PDGFRβ 存在的條件下，HBVP 中分別加入 anti-PDGFRβ mAb，anti-PDGFRβ scFv 和 anti-VEGF-PDGFRβ bsAb。(η = 4)HUVECs細(xì)胞附著于Cytodex 3微載體上過(guò)夜培養(yǎng)，之后接種人間質(zhì)干細(xì)胞，并將微載體置于含纖維蛋白膠(fibrin gel)的12孔板中QOO個(gè)微載體/孔)。加入含 2ng/mL人HGF的EGM-2培養(yǎng)基，每?jī)商旄鼡Q新鮮培養(yǎng)基。從第8天開(kāi)始，加入不同濃度的 bevacizumab, anti-PDGFR β 單抗或抗 VEGF-PDGFR β bsAb。培養(yǎng) 7 天后，細(xì)胞用 4% 的 PFA 于4°C固定過(guò)夜。HUVECs細(xì)胞用抗PECAM抗體及相應(yīng)的偶聯(lián)有熒光集團(tuán)的二抗染色；周質(zhì)細(xì)胞用anti-α SMA-Cy3染色。實(shí)驗(yàn)顯示，同時(shí)加入bevacizumab和anti-PDGFR β單抗對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞出芽生長(zhǎng)(模擬血管新生)有顯著的抑制作用；另外加入抗VEGF-PDGFR β bsAb 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞出芽生長(zhǎng)的抑制作用與同時(shí)使用兩種單抗效果近似。圖6. HUVECs和人間質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，測(cè)試抗VEGF-PDGFR β bsAb對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，及內(nèi)皮細(xì)胞_周細(xì)胞結(jié)合的抑制作用A. Bevacizumab，Bevacizumab+anti PDGFR β 和 anti-VEGF-PDGFR PbsAb (同為25nM)對(duì)新生血管生長(zhǎng)的抑制效果；B.不同濃度的Bevacizumab和anti-VEGF-PDGFR β bsAb對(duì)新生血管生長(zhǎng)的抑制效果。實(shí)施例4抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體對(duì)人鼻咽癌CNE裸小鼠異種移植腫瘤生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)取生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織剪切成1. 5mm3左右，在無(wú)菌條件下，接種于裸小鼠右側(cè)皮下。小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑，待腫瘤生長(zhǎng)至100-200mm3后動(dòng)物隨機(jī)分組。 使用測(cè)量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察被試動(dòng)物抗腫瘤的效果。腫瘤直徑的測(cè)量次數(shù)為每2天1 次，每次測(cè)量同時(shí)還需稱(chēng)量鼠重。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體，每天 1次，陰性組同時(shí)給等量生理鹽水。腫瘤體積計(jì)算公式
TV = 0. 52XaXb2其中a、b分別表示長(zhǎng)寬。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積?？鼓[瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率T/c(% )，計(jì)算公式如下T/C(% ) = Tetv/CetvX 100%Tetv 治療組RTV ；Cetv 陰性對(duì)照組RTV表3.抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體對(duì)人鼻咽癌CNE裸鼠異種移植腫瘤生長(zhǎng)的抑
制作用
組別劑量起始體重(g)起始終末體重(g)終末瘤重(g)抑瘤率(mg/kg)動(dòng)物數(shù)動(dòng)物數(shù)陰性對(duì)照一23.081222.67121.102一順鉑1021.43820.3370.29073.68%恩度2.522.57822.1780.60545.10%抗622.13822.1480.49455.17%VEGF/PDGFΚβ雙特異性抗體卨抗323.75824.0080.42761.25%VEGF/PDGFΙφ雙特異性抗體中抗1.523.40823.7080.54650.45%VEGF/PDGFΙφ雙特異性抗體低結(jié)果見(jiàn)表3順鉬組10mg/kg，對(duì)人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率為73. 68%, 但對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重具有顯著性的影響；恩度組2. 5mg/kg，對(duì)人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率為45. 10% ；抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體高、中、低劑量組對(duì)人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率為55. 17%，61. 25%，50. 45%，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重?zé)o顯著性影響?？筕EGF/PDGFR β雙特異性抗體對(duì)人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體:3mg/kg組對(duì)人鼻咽癌CNE移植瘤的生長(zhǎng)有最好的抑制作用；與陽(yáng)性對(duì)照順鉬組相比，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重沒(méi)有影響，未見(jiàn)明顯的毒副反應(yīng)。實(shí)施例5抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體對(duì)人甲狀腺癌SW-579裸小鼠異種移植腫瘤生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)取生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織剪切成1. 5mm3左右，在無(wú)菌條件下，接種于裸小鼠右側(cè)皮下。小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑，待腫瘤生長(zhǎng)至100-200mm3后動(dòng)物隨機(jī)分組。 使用測(cè)量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察被試動(dòng)物抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤直徑的測(cè)量次數(shù)為每2天1 次，每次測(cè)量同時(shí)還需稱(chēng)量鼠重。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射抗VEGF/PDGFR β雙特異性抗體，每天1次，陰性組同時(shí)給等量生理鹽水。腫瘤體積計(jì)算公式TV = 0. 52XaXb2其中a、b分別表示長(zhǎng)寬。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積?？鼓[瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率T/c(% )，計(jì)算公式如下T/C(% ) = Tetv/CetvX 100%Tetv 治療組RTV ；Cetv 陰性對(duì)照組RTV表4.抗VEGF/PDGFRi3雙特異性抗體對(duì)人甲狀腺癌SW-579裸鼠異種移植腫瘤生
長(zhǎng)的抑制作用
權(quán)利要求
1.抗VEGF/PDGFRi3雙特異性抗體，其特征在于該抗體由抗VEGF單克隆抗體為基礎(chǔ)，并在其FC段末端連接抗PDGFR β單鏈抗體構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗VEGF/PDGFRi3雙特異性抗體，其特征在于FC段末端通過(guò) (GGGGS)3連接抗PDGFR^單鏈抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗VEGF/PDGFRi3雙特異性抗體，其特征在于抗VEGF單克隆抗體由 Anti-VEGF A Fab VH-CH、Anti-VEGF A Fab VL-CL 和 Fc 組成；其中 Anti-VEGF A Fab VH-CH的氨基酸序列表為SEQ NO. 3、Anti-VEGF A Fab VL-CL的氨基酸序列表為SEQ NO. 4、Fc的氨基酸序列表SEQ NO. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗VEGF/PDGFRi3雙特異性抗體，其特征在于所述的抗 PDGFR β 單鏈抗體由 Anti-PDGFR β scFv VL 和 Anti-PDGFR β scFv VH 通過(guò)(GGGGS) 3 連接而成組成；其中Anti-PDGFR β scFv VL的氨基酸序列表為SEQ NO. l、Anti_PDGFR β scFv VH的氨基酸序列表為SEQ NO. 2。
5.抗VEGF/PDGFRi3雙特異性抗體在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙特異性單克隆抗體藥物，特別涉及抗腫瘤血管新生的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)的雙特異性單克隆抗體藥物；抗VEGF/PDGFRβ雙特異性抗體，其特征在于該抗體由抗VEGF單克隆抗體為基礎(chǔ)，并在其FC段末端連接抗PDGFRβ單鏈抗體構(gòu)成。本發(fā)明涉及的雙特異性抗體是運(yùn)用基因工程等技術(shù)手段，將識(shí)別VEGF和識(shí)別PDGFRβ的抗體片段構(gòu)建在同一抗體分子中，能夠特異性的與這兩者結(jié)合，其抑制腫瘤組織血管新生的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用抗VEGF抗體，并且具有很好看腫瘤活性。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102250246SQ20111015432
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者葉亞?wèn)|, 朱文華, 滕凌, 潘鸝, 路易斯易格那羅, 霍世元 申請(qǐng)人:常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司