專利名稱：脂肪干細(xì)胞的分離方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新穎有效的脂肪干細(xì)胞的分離方法以及分離的脂肪干細(xì)胞在抗衰老、美容、再生醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類從胚胎發(fā)育、生命誕生到發(fā)育成熟、衰老直至死亡的整個生命過程中，無時不包含有人與生活環(huán)境及其它物質(zhì)的相互作用，不可避免地會發(fā)生組織、器官的損傷和功能衰退。在正常生理過程中，人體每天都有大量細(xì)胞死亡，同時伴有大量細(xì)胞的新生，以維持各種組織、器官機(jī)構(gòu)的完整性和保證功能處于正常狀態(tài)。如果細(xì)胞死亡與新生的平衡失調(diào)， 死亡細(xì)胞增多或新生細(xì)胞減少，就會導(dǎo)致組織器官功能的減退、疾病發(fā)生，甚至死亡。從解剖學(xué)的角度講，人體是由執(zhí)行不同功能的組織和器官構(gòu)成，而不同的組織和器官又由多種執(zhí)行不同功能的細(xì)胞組成。數(shù)量龐大、種類繁多的細(xì)胞的有序排列是人體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。從功能的角度分析，不同的細(xì)胞具有不同的生理功能，它們組成了一個復(fù)雜的細(xì)胞社會，這個社會的成員處于一個不斷更新?lián)Q代的動態(tài)變化過程中，每種類型細(xì)胞的數(shù)量與功能改變都可能影響整體平衡，導(dǎo)致疾病發(fā)生。更深層次的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的生長、分化和功能都受所處微環(huán)境的控制，包括細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和信號分子(激素、細(xì)胞因子)和其它理化因素等。因此，衰老是人體隨著年齡增長、環(huán)境影響而發(fā)生的組織、器官、細(xì)胞的功能退行性變化，表現(xiàn)為機(jī)體的功能活動能力進(jìn)行性下降，對環(huán)境的適應(yīng)能力逐漸降低，體內(nèi)代謝平衡失調(diào)，導(dǎo)致面色蒼老、皮膚松弛、皺紋增多、容易疲勞、腦力和體力勞動能力下降、性功能減退等一系列衰老癥狀。正是由于衰老是全身系統(tǒng)性組織、器官功能退化，因此，抗衰老的策略也應(yīng)考慮從整體水平改善功能，干細(xì)胞用于再生醫(yī)學(xué)愈來愈引起廣泛的關(guān)注。干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下， 它可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞能對多種組織、器官、系統(tǒng)的老化退行性病變進(jìn)行再生性修復(fù)，使其結(jié)構(gòu)和功能正?；?、年輕化，從整體上調(diào)控機(jī)體狀態(tài)，是一種全身性、系統(tǒng)性、 根本性的保健。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，ADSCs在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，在體內(nèi)體外具有多向分化潛能，不同的誘導(dǎo)因子作用下可以向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及胰島細(xì)胞分化，而且可以分泌多種促血管生成因子和抗凋亡因子。脂肪干細(xì)胞來源廣泛、取材容易、對機(jī)體損傷小，體內(nèi)儲備量大，少量組織即可獲取大量干細(xì)胞，適宜自體移植，適宜大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點，逐漸成為近年來的研究熱點之一。然而目前脂肪干細(xì)胞用于抗衰老治療還有很多需要完善的地方，主要在于分離的脂肪干細(xì)胞純度較低，不利于分化誘導(dǎo)，因此造成抗衰老效果不佳。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)適宜于簡便、高效地分離高純度脂肪干細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種簡便和/或高效地分離高純度脂肪干細(xì)胞(群)的方法。本發(fā)明的另一目的是提供分離的高純度脂肪干細(xì)胞的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的脂肪干細(xì)胞群，所述的干細(xì)胞群具有以下特征(a) 95%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶29 ；(b) 86%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73 ；(c) 78%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90 ；和(d) 72%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶105。在另一優(yōu)選例中，所述的干細(xì)胞群還具有以下特征(e)0. 2%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶34 ；和/或(f)0. 以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶45。在另一優(yōu)選例中，所述的干細(xì)胞群具有以下一個或多個特征(al) 97%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶29 ；(bl) 88%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73 ；(cl) 80%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90 ；(dl) 74%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶105。在另一優(yōu)選例中，所述的干細(xì)胞群還具有以下特征(el) 0. 1 %以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶34 ；和/或(fl)0. 05%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶45。在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞群是用包括以下步驟的方法制備的(1)對獲得的含脂肪干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞組織材料，用洗滌液進(jìn)行洗滌，從而獲得去除血細(xì)胞的混合物；(2)對步驟(1)中的混合物，用膠原酶進(jìn)行消化，從而獲得經(jīng)消化的組織混合物；(3)對上一步驟獲得的經(jīng)消化的細(xì)胞混合物進(jìn)行過濾，去除未消化的組織塊，獲得含脂肪干細(xì)胞的濾液；和(4)對所述濾液進(jìn)行離心，沉淀即為脂肪干細(xì)胞群。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備分離的脂肪干細(xì)胞群的方法，包括步驟(1)對獲得的含脂肪干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞組織材料，用洗滌液進(jìn)行洗滌，從而獲得去除血細(xì)胞的混合物；(2)對步驟(1)中的混合物，用膠原酶進(jìn)行消化，從而獲得經(jīng)消化的組織混合物；(3)對上一步驟獲得的經(jīng)消化的細(xì)胞混合物進(jìn)行過濾，去除未消化的組織塊，獲得含脂肪干細(xì)胞的濾液；和(4)對所述濾液進(jìn)行離心，沉淀即為脂肪干細(xì)胞群。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中所述洗滌液選自下組氯化鈉水溶液，5%葡萄糖鹽水，磷酸緩沖液。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中用膠原酶進(jìn)行30-120分鐘，更佳地40_90分鐘的消化。在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，用孔徑80-120微米(較佳地90-110微米，如100 微米)的濾網(wǎng)進(jìn)行過濾。在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，用25-60微米(較佳地30_50微米，如40微米) 的濾網(wǎng)進(jìn)行過濾。在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，還包括對濾液進(jìn)行脂肪干細(xì)胞數(shù)目計數(shù)，和/或評估細(xì)胞活力。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(5)將所述的干細(xì)胞重懸浮，從而獲得含脂肪干細(xì)胞群的重懸液；(6)將分離獲得的脂肪干細(xì)胞群重懸液接種于培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，步驟(5)中用選自下組的液體對干細(xì)胞群進(jìn)行重懸浮無菌水， 生理鹽水，磷酸緩沖液、或其組合。在另一優(yōu)選例中，用于對干細(xì)胞群進(jìn)行重懸浮的pH為7.0士0.2，較佳地 7. 0 士 0. 1。在本發(fā)明的第三方面，提供一種藥物組合物，所述的組合物含有本發(fā)明第一方面所述的分離的脂肪干細(xì)胞群和藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是用于自體移植的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上可接受的載體包括生理鹽水。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的脂肪干細(xì)胞群的用途，所述脂肪干細(xì)胞群被用于制備(a)用于自體移植的組合物；(b)用于抗衰老的組合物；或(c)用于美容的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的干細(xì)胞群還用于制備用于以下一種或多種功效的組合物增強免疫力、提高睡眠質(zhì)量、提高肺活量、改善視力、改善聽力、延緩衰老、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是用于自體移植的組合物。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備用于自體移植的組合物的方法，所述方法包括步驟將本發(fā)明第一方面所述的脂肪干細(xì)胞群與藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行混合，從而形成用于自體移植的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的自體移植的組合物被用于以下一種或多種用途美容、增強免疫力、提高睡眠質(zhì)量、提高肺活量、改善視力、改善聽力、延緩衰老、或其組合。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再--累述。


圖1顯示了本發(fā)明方法分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞具有分化為脂肪細(xì)胞的能力。其中，圖IA顯示脂肪來源干細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)劑作用下，脂肪干細(xì)胞能夠生成脂質(zhì)；圖IB顯示陰性對照。圖2顯示了本發(fā)明方法分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞具有分化為骨的能力。其中，圖 2A顯示脂肪來源干細(xì)胞具有成骨分化潛能，脂肪來源干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)劑作用下，經(jīng)茜素紅染色，可見細(xì)胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積；圖2B顯示陰性對照。圖3顯示了用流式細(xì)胞儀法對本發(fā)明方法制備的脂肪干細(xì)胞群進(jìn)行表面抗原標(biāo)記表達(dá)的分析圖。結(jié)果表明，用本發(fā)明方法分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞群的純度很高。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次建立了一種高效地分離高純度脂肪干細(xì)胞方法。使用本發(fā)明方法可以從脂肪組織中有效分離出大量的、純度高、易于培養(yǎng)、增殖速度快、分化能力強的脂肪干細(xì)胞。用所述脂肪干細(xì)胞可進(jìn)行美容或抗衰老等，并具有優(yōu)良的效果。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語如本文所用，術(shù)語“以上”和“以下”包括本數(shù)，例如“95%以上“指彡95%, "0.2% 以下”指彡0.2%。脂肪干細(xì)胞如本文所用，術(shù)語“脂肪干細(xì)胞”、“本發(fā)明脂肪干細(xì)胞”、或“本發(fā)明的干細(xì)胞”可以互換使用，都指分離自脂肪組織的干細(xì)胞。在本發(fā)明中，脂肪組織或脂肪原料沒有特別限制，可以是來源于動物或人的任何部位的脂肪組織，優(yōu)選人的脂肪組織。較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織。脂肪干細(xì)胞(ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。ADSCs能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，它取材容易、體內(nèi)儲備量大、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、 對機(jī)體損傷小、來源廣泛、適宜自體移植。分離方法如本文所用，術(shù)語“分離方法”、“本發(fā)明方發(fā)明方法”、“脂肪干細(xì)胞分離方法”可以互換使用，都指從原始的脂肪組織中獲得分離的脂肪干細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞群的方法和過程。對于獲得的脂肪干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞材料，首先進(jìn)行洗滌，除去血細(xì)胞；脂肪破碎，消化； 去除未消化的組織，獲得含脂肪干細(xì)胞的濾液；離心得到脂肪干細(xì)胞群。得到的脂肪干細(xì)胞群可以用于進(jìn)一步傳代、培養(yǎng)或凍存。干細(xì)胞抗原檢測用本發(fā)明方法制備的脂肪干細(xì)胞具有很高的純度，其基本上不含有其他類型的細(xì)胞或干細(xì)胞。這可通過細(xì)胞表面抗原的檢測加以驗證。脂肪干細(xì)胞具有多種特異性抗原和受體，主要有⑶3、⑶13、D29、⑶34、⑶45、 CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 等。⑶34抗原是一種高度糖基化I型跨膜蛋白，它選擇性的表達(dá)于人類造血干細(xì)胞 (HSC)，祖細(xì)胞(PC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)表面，帶有CD34的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為彡0. 2%，更佳地，彡0. 2%。⑶45存在于所有造血細(xì)胞的表面，包括造血干細(xì)胞和破骨細(xì)胞。帶有⑶45的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為彡0. 1%。⑶29、⑶73、⑶90、⑶105等主要存在于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面。帶有⑶29的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 95%，更佳地> 97%，最佳地
7彡 99%。帶有⑶73的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 80%，更佳地> 85%，最佳地彡 88%。帶有⑶90的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 75%，更佳地> 78%，最佳地彡 80%。帶有⑶105的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為彡70%，更佳地彡72%，最佳地彡75%。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法檢測脂肪干細(xì)胞的純度和分化程度，如流式細(xì)胞儀法。檢測時，加入不同的與有針對性的特異抗體，抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，也可以是具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈; 遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No. 4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。加入抗體與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合一定時間，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行自動分析和分選。成脂誘導(dǎo)及檢測由于脂肪干細(xì)胞具有多向分化能力，在一定的條件下對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，能夠得到特定功能的已分化的細(xì)胞。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。一種通用的誘導(dǎo)方法是向培養(yǎng)液中加入地塞米松。誘導(dǎo)成脂的條件主要有3種，包括地塞米松加1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)，地塞米松加胰島素，或地塞米松加茚甲新(indomethacin，消炎痛)、1_甲基-3-異丁基黃嘌呤及胰島素。其中最重要的就是地塞米松，低濃度的地塞米松是無血清或低血清培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的必需成分之一，能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外快速增殖；較高濃度的地塞米松則可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法和染料(如Oil Red、蘇丹紅5B和溶劑紅 27等)對脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂進(jìn)行檢測。最常用的染料是Oil Red(O)，即油紅0。油紅0 的結(jié)構(gòu)為1-[2，5_ 二甲基-4-(2，5-二甲基苯偶氮)苯偶氮]_2萘酚，是一種紅色粉末，油溶性偶氮染料，易溶于苯、乙醇和丙酮。成脂肪誘導(dǎo)的過程中，細(xì)胞在胞漿中不斷有油滴的累積，并不斷的增加變大，最后整個細(xì)胞的胞漿中都是油滴。油紅0作為生物染色劑，易與油脂結(jié)合，但與細(xì)胞本身的結(jié)構(gòu)著色力差。在顯微鏡下可以清楚地進(jìn)行成脂染色觀察。成骨誘導(dǎo)及檢測由于脂肪干細(xì)胞具有多向分化能力，在一定的條件下對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，能夠得到成骨細(xì)胞。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。經(jīng)典的化學(xué)成骨誘導(dǎo)液配方為=DMEM培養(yǎng)液，甘油磷酸鈉，維生素C和地塞米松。成骨誘導(dǎo)的過程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來，即“鈣結(jié)節(jié)”。鑒定鈣結(jié)節(jié)的染料常用“茜素紅”。茜素紅溶液包括茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅 S，茜素胭脂紅，1,2- 二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2- 二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。茜素紅為橙黃色或黃棕色粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈹和鈣的顯色反應(yīng)。茜素紅染色的原理就是茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色。自體移植組合物和施用方式本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物可用于自體移植。本發(fā)明的藥物組合物可用于抗衰老等多種用途。本發(fā)明的藥物組合物包括有效量的本發(fā)明的脂肪干細(xì)胞以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋。對于含細(xì)胞的組合物，優(yōu)選形式為液態(tài)劑型。組合物可制成單元或多元劑型。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥或施用，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。使用本發(fā)明的自體移植組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明脂肪干細(xì)胞施用于人，其中該安全有效量通常為IO5-IO8細(xì)胞/人/次，更佳地為IO6-IO7細(xì)胞/人/次。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、對象的健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括(1)提供了一種分離和培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法，使用本發(fā)明方法分離的脂肪干細(xì)胞純度高、易于培養(yǎng)、增殖速度快、分化能力強。(2)本發(fā)明方法分離的脂肪干細(xì)胞可以有效誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞以及骨細(xì)胞。(3)本發(fā)明方法分離的脂肪干細(xì)胞可以提高機(jī)體免疫力，提高睡眠質(zhì)量，提高各種身體體能，具有良好的抗衰老的效果。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。試劑和耗材1無菌手術(shù)器械及耗材(1) 100 μ m 濾網(wǎng)(2) 40 μ m 濾網(wǎng)(3) 5Oml 離心管(4) 250ml、125ml 儲液瓶(δ) TlOml、T25ml 移液管2無菌試劑(1) UltraMEM(無血清培養(yǎng)基)+2% ULtroser G serum substitute (血清替代品)(2) I型膠原酶(現(xiàn)配現(xiàn)用)0. 膠原酶I配制方法稱取0. Ig膠原酶I粉末溶解于IOOml未加任何因子的培養(yǎng)基中，用之前37°C預(yù)熱。(3)氯化鈉注射液(4)0. 125% Trypsin-O. 01% EDTA 溶液。實施例1脂肪干細(xì)胞的分離1.接收脂肪組織
用75%的酒精擦拭無菌的接收脂肪組織的采集瓶外壁；無菌針管從人體吸取深層脂肪組織，Ih內(nèi)將其移至接收容器內(nèi)。2.分裝脂肪組織每一 125ml儲液瓶分裝脂肪組織50ml，IOml移液管于脂肪采集瓶吸取下層紅色液體，棄掉，將剩余的上層脂肪混勻后進(jìn)行分裝。3.洗滌脂肪組織向125ml儲液瓶中加入50ml氯化鈉注射液，擰緊蓋子，劇烈晃動3分鐘以充分洗滌脂肪組織并除去血細(xì)胞，接著靜止3-5分鐘，使不同相分離，吸去下層水相；重復(fù)以上操作三次，直到下層液較為清澈。4.膠原酶I消化加入等量新配制的預(yù)熱(提前半小時于37°C的氣浴搖床預(yù)熱)膠原酶I溶液，封口膜封口，劇烈晃動培養(yǎng)瓶5-10秒，置于振動氣浴鍋中，370C，70rpm,消化30-60分鐘，每隔15分鐘劇烈晃動培養(yǎng)瓶5-10秒，直到脂肪組織看起來較為平滑。5收集沉淀消化完畢，2000rpm離心lOmin，棄去上層消化后的脂肪，收集兩管的底層沉淀至一個新離心管，加 DMEM 至 50ml，IOOOrpm 離心 8min 洗滌一次；5.過濾并計數(shù)加DMEM至50ml，混勻，100 μ m濾器過濾去除為消化的組織塊，加 DMEM至50ml，吸取Iml計數(shù)細(xì)胞量及活力；6.上述方法分離的細(xì)胞得率5xl05-lxl06個/ml脂肪，離心后加20ml培養(yǎng)基充分混勻。7.細(xì)胞種植根據(jù)計數(shù)細(xì)胞的量調(diào)整接種密度接種至T175培養(yǎng)瓶(接種密度2-4X104/cm2)，置 37°C>5% CO2 培養(yǎng)。實施例2原代細(xì)胞培養(yǎng)、收獲和傳代1.原代細(xì)胞培養(yǎng)將培養(yǎng)瓶平放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱。培養(yǎng)條件37士0. 5°C，二氧碳體積分?jǐn)?shù)為5士0.2%。原代培養(yǎng)第24小時，進(jìn)行全量換液。此后每隔3天全量換液，放置二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。2.原代細(xì)胞收獲7天左右，原代培養(yǎng)的細(xì)胞克隆團(tuán)的面積百分比到達(dá)70% -80%時，消化收獲。 在培養(yǎng)瓶中加入消化酶(消化酶為0. 125% Trypsin 0. 01 % EDTA溶液，使用前室溫 (20-250C )放置15-25min,每75cm2加入2ml消化酶溶液)，消化時間為1. 5-2. 5min,加入培養(yǎng)基2-3ml反復(fù)吹打瓶底至細(xì)胞大部分脫落，移入50ml離心管中，原培養(yǎng)瓶中加入4_5ml 氯化鈉注射液沖洗瓶壁，加入離心管中定容至50ml，移液管吹打懸浮后，100 μ m無菌濾網(wǎng)過濾，過濾液收集到50ml離心管中，lOOOrpm，IOmin離心洗滌。3.原代細(xì)胞傳代觀察單個離心管內(nèi)余下細(xì)胞沉淀量，適當(dāng)合并數(shù)個離心管中細(xì)胞沉淀至1個離心管中，加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸浮細(xì)胞，定容至30ml，吹打混勻，取樣計數(shù)。計數(shù)后 lOOOrpm，IOmin二次離心。去除上清液，在離心管中加入培養(yǎng)基適量，輕輕吹打重懸浮細(xì)胞， 定容后接種至新的培養(yǎng)容器中，傳代細(xì)胞密度為5000-6000個/cm2，即(3. 75-4. 5) X IO5個細(xì)胞/T75，按照4. 5 X IO5個細(xì)胞/T75進(jìn)行傳代。在培養(yǎng)容器上標(biāo)示細(xì)胞代數(shù)與培養(yǎng)時間等信息。將培養(yǎng)容器放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱開始培養(yǎng)。培養(yǎng)條件二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱。條件37士0.5°C，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5士0.2%。培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)85%-90%。4.原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)5天后，細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)可以達(dá)到2-3倍；培養(yǎng)12天后，細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)可以達(dá)到5-10倍。實施例3脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)1.將培養(yǎng)的干細(xì)胞以1.5X IO5每孔的密度接種在六孔板中，進(jìn)行成脂誘導(dǎo)實驗。 具體方法是向基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)中加入終濃度分別為lymol/L地塞米松、10 μ mol/L胰島素、200 μ mol/L吲哚美辛和0. 5mmol/L的異丁基甲基黃嘌呤，配制成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣本為成脂分化實驗陰性對照組。每周換2次液，直到進(jìn)行成脂染色觀察為止，以上組均做平行實驗(η = 3)。2.油紅0染色先小心輕緩倒去培養(yǎng)液，用D-hanks輕緩漂洗，加10 %中性甲醛固定細(xì)胞膜 30min。加入0.5%油紅0(六孔板加1.5ml)，染色1 Omin-Ih左右。3.脫色，75%酒精/60%異丙醇漂洗，除去多余的染料。4.復(fù)染，淡蘇木染色lmin，PBS漂洗。5.甘油明膠封片，顯微鏡觀察每組樣本隨機(jī)選取5-10個視野進(jìn)行拍照觀察以考察共培養(yǎng)方法的成脂誘導(dǎo)分化效果。脂肪呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，間質(zhì)無色。6.結(jié)果圖1表明用本發(fā)明方法分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)劑的作用下，具有分化為脂肪細(xì)胞的能力。圖IA可以看到成脂分化后的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量密集在一起的小脂滴。 圖IB為正常培養(yǎng)基的陰性對照，沒有脂滴的生成，表明脂肪干細(xì)胞不能自發(fā)生成脂質(zhì)。上述結(jié)果提示，用本發(fā)明方法獲得的干細(xì)胞是脂肪干細(xì)胞。實施例4脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)1.成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)至第二代的細(xì)胞，胰酶消化后，以lxl05ml密度接種傳代，基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)Id 后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基DMEM/10% FBS，0. 1 μ mo/L地塞米松，50 μ mo/L維生素C，IOmmol/β — 甘油磷酸鈉，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；每3d更換培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)2周。2.茜素紅染色細(xì)胞以PBS洗滌2次，4%甲醛固定，茜素紅染色lOmin，沖洗，干燥，封片。3.結(jié)論每組樣本隨機(jī)選取5-10個視野進(jìn)行拍照觀察以考察成骨誘導(dǎo)分化效果。利用沉積的鈣于茜素紅可以發(fā)生顯色反應(yīng)，誘導(dǎo)成骨的細(xì)胞經(jīng)茜素紅染色，可見細(xì)胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。圖2表明用本發(fā)明方法分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)劑的作用下，具有分化為骨細(xì)胞的能力。圖2A可以看到成骨分化后的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量鈣化基質(zhì)。圖2B為正常培養(yǎng)基的陰性對照，沒有鈣化基質(zhì)的生成，表明脂肪干細(xì)胞不能自發(fā)生成骨。
上述結(jié)果提示，用本發(fā)明方法獲得的干細(xì)胞是脂肪干細(xì)胞。實施例5脂肪干細(xì)胞的流式檢測通過酶消化法將細(xì)胞收集到離心管中，細(xì)胞懸液調(diào)整密度為IXlO5mL-1, 800rpm(120g)，離心5min，棄掉上清，用4°C的冷D-Hanks沖洗重懸細(xì)胞，再次將細(xì)胞懸液以 800r/min，離心5min，之后棄去上清。然后用D-Hanks將細(xì)胞重懸至lmL，加入抗體5_10 μ 1， 避光，冰上放置30min。用D-Hanks沖洗，離心，棄上清，重復(fù)該沖洗過程2_3次，確保將未結(jié)合抗體除凈最后，加入約200至300 μ L的D-Hanks制成懸液，用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果如圖3和表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種分離的脂肪干細(xì)胞群，其特征在于，所述的干細(xì)胞群具有以下特征(a)95%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶29 ；(b)86%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73 ；(c)78%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90 ；和(d)72%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶105。
2.如權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞群，其特征在于，所述的干細(xì)胞群還具有以下特征(e)0.2%以下的細(xì)胞具有表面抗原CD34 ；和/或(f)0.以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶45。
3.如權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞群，其特征在于，所述的干細(xì)胞群具有以下一個或多個特征(al) 97%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶29 ； (bl) 88%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73 ； (cl) 80%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90 ； (dl) 74%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶105。
4.如權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞群，其特征在于，所述的干細(xì)胞群還具有以下特征 (el) 0. 1 %以下的細(xì)胞具有表面抗原CD34 ；和/或(fl)0. 05%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶45。
5.如權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞群是用包括以下步驟的方法制備的(1)對獲得的含脂肪干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞組織材料，用洗滌液進(jìn)行洗滌，從而獲得去除了血細(xì)胞的混合物；(2)對步驟(1)中的混合物，用膠原酶進(jìn)行消化，從而獲得經(jīng)消化的組織混合物；(3)對上一步驟獲得的經(jīng)消化的組織混合物進(jìn)行過濾，去除未消化的組織塊，獲得含脂肪干細(xì)胞的濾液；和(4)對所述濾液進(jìn)行離心，沉淀即為脂肪干細(xì)胞群。
6.一種制備分離的脂肪干細(xì)胞群的方法，其特征在于，包括步驟(1)對獲得的含脂肪干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞組織材料，用洗滌液進(jìn)行洗滌，從而獲得去除了血細(xì)胞的混合物；(2)對步驟(1)中的混合物，用膠原酶進(jìn)行消化，從而獲得經(jīng)消化的組織混合物；(3)對上一步驟獲得的經(jīng)消化的組織混合物進(jìn)行過濾，去除未消化的組織塊，獲得含脂肪干細(xì)胞的濾液；和(4)對所述濾液進(jìn)行離心，沉淀即為脂肪干細(xì)胞群。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟(5)將所述的干細(xì)胞重懸浮，從而獲得含脂肪干細(xì)胞群的重懸液；和(6)將分離獲得的脂肪干細(xì)胞群重懸液接種于培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
8.—種藥物組合物，其特征在于，所述的組合物含有權(quán)利要求1所述的分離的脂肪干細(xì)胞群和藥學(xué)上可接受的載體。
9.一種權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞群的用途，其特征在于，(a)用于制備自體移植的組合物；(b)用于抗衰老的組合物；或(c)用于美容的組合物。
10. 一種制備用于自體移植的組合物的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟將權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞群與藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行混合，從而形成用于自體移植的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種脂肪干細(xì)胞分離方法和用途。本發(fā)明方法包括(1)對獲得的含脂肪干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞組織材料，用洗滌液進(jìn)行洗滌；(2)用膠原酶進(jìn)行消化，從而獲得經(jīng)消化的組織混合物；(3)進(jìn)行過濾，獲得含脂肪干細(xì)胞的濾液；和(4)對所述濾液進(jìn)行離心，沉淀即為脂肪干細(xì)胞群。本發(fā)明方法可有效分離脂肪干細(xì)胞，且得到的脂肪干細(xì)胞純度高，增殖速度快。本發(fā)明方法分離的脂肪干細(xì)胞可應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和抗衰老治療等用途。
文檔編號A61L27/38GK102485885SQ20111015450
公開日2012年6月6日 申請日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者張麗, 張炳強, 曹衛(wèi), 李戍, 焦陽 申請人:臻景生物技術(shù)(上海)有限公司, 臻景生物技術(shù)(無錫)有限公司