專(zhuān)利名稱(chēng)：Sca-1⁺/CD34^－子宮干細(xì)胞及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞，特別是涉及一種從子宮中提取的干細(xì)胞。本發(fā)明還涉及該子宮干細(xì)胞的分離方法，以及該子宮干細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
隨著人們生活方式的改變，缺血性疾病已經(jīng)成為近年來(lái)全球發(fā)病率最高的疾病之一，而且發(fā)病率一直在不斷上升。缺血性疾病是一種由于血管狹窄或閉塞導(dǎo)致組織灌注不良，最終造成器官功能障礙甚至衰竭的疾病，可累及全身各個(gè)器官，造成嚴(yán)重后果，甚至危及生命，例如急性心肌梗死、缺血性心肌病，腦梗死等。在正常狀態(tài)下，血管新生是機(jī)體對(duì)缺血、缺氧損傷的自身代償性機(jī)制。在心肌缺血早期，毛細(xì)血管密度代償性增加，在阻塞或狹窄的冠狀動(dòng)脈周?chē)纬尚律芤越?cè)支循環(huán)，從而改善局部缺血狀態(tài)。但這種代償往往不足以徹底恢復(fù)組織灌注，糾正缺血的病理生理改變，以致臨床不得不采取外源性干預(yù)措施，以挽救患者的生命。對(duì)于缺血性疾病，藥物治療、介入治療和外科手術(shù)治療是目前國(guó)際上公認(rèn)的三大主要治療干預(yù)措施。藥物治療主要應(yīng)用于缺血性疾病的預(yù)防和早期治療。 而介入及外科手術(shù)治療主要針對(duì)較嚴(yán)重的缺血性疾病，能夠較為徹底的解決主干或較大血管的梗死，然而其對(duì)遠(yuǎn)端微灌注的影響有限，且針對(duì)血管彌漫性狹窄的患者很難達(dá)到理想的治療效果。所以，目前的治療手段并不能徹底恢復(fù)受損組織的灌注，從根本上解決缺血性疾病的病理生理改變，以達(dá)到根治的目的。治療性血管新生是目前國(guó)際公認(rèn)的針對(duì)缺血性疾病的治療新理念，通過(guò)促進(jìn)新生血管的形成，建立有效的側(cè)支供血循環(huán)，從根本上改善組織缺血的狀態(tài)，恢復(fù)器官功能，以達(dá)到標(biāo)本兼治的持續(xù)性臨床療效。細(xì)胞移植是目前臨床及基礎(chǔ)研究界公認(rèn)的針對(duì)缺血性疾病最有希望的治療手段之一，在基礎(chǔ)及臨床研究領(lǐng)域廣受重視。雖然大量的研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞移植對(duì)于缺血性疾病具有一定的治療作用，但受到不同細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞特點(diǎn)及功能的限制，其治療效果并不穩(wěn)定。如何選擇移植靶細(xì)胞，是保證細(xì)胞移植治療效果的關(guān)鍵。以缺血性心臟病為例，早期細(xì)胞移植關(guān)于靶細(xì)胞的選擇多集中在肌原性細(xì)胞，如平滑肌細(xì)胞，希望可以通過(guò)增加壞死區(qū)肌細(xì)胞的數(shù)量來(lái)增加心肌的收縮力，改善心臟的功能。但后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，單純?cè)黾蛹〖?xì)胞的數(shù)量，而不從根本上改善梗死區(qū)組織的灌注狀態(tài)，獲得的治療效果是極其有限的。那么如何通過(guò)細(xì)胞移植的方法，增加梗死區(qū)新生血管的形成，從根本上改善組織的灌注狀態(tài)，恢復(fù)心臟功能呢？這正是目前世界范圍內(nèi)細(xì)胞移植研究界最熱點(diǎn)的研究問(wèn)題。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞系，能夠在一定的條件下分化為血源性細(xì)胞、肌源性細(xì)胞和間充質(zhì)原性細(xì)胞等，也就是說(shuō)干細(xì)胞是最有可能具有在一定條件下形成新生血管潛力的細(xì)胞系。干細(xì)胞按其存在的不同時(shí)期可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。目前胚胎干細(xì)胞已可成功的在體外培養(yǎng)，并在特定的培養(yǎng)條件下定向誘導(dǎo)分化為各種功能細(xì)胞，用于修復(fù)受損病變的組織或器官。然而胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)難度大，成本高，存在潛在的成瘤性風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)受到移植排斥和倫理學(xué)限制，使其很難應(yīng)用于臨床治療。成體干細(xì)胞是存在于各種已分化組織中的未分化細(xì)胞。在多數(shù)情況下可分化為相同組織類(lèi)型的細(xì)胞，但另一方面，其分化又具有一定的可塑性，能打破胚層界限，分化成與其來(lái)源不同的其它類(lèi)型的組織細(xì)胞。目前，已在多種組織中發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞的存在。由于分離和使用成體(自體) 干細(xì)胞不存在倫理學(xué)問(wèn)題，在體外培養(yǎng)時(shí)可以根據(jù)需要大量擴(kuò)增，便于臨床應(yīng)用，且不存在免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，因此，成體干細(xì)胞顯示出更為廣泛的應(yīng)用前景。子宮是一種具有高度增殖活性和強(qiáng)大血管形成能力，且具有周期性更新特點(diǎn)的組織。30多年前就有學(xué)者推測(cè)子宮內(nèi)可能存在干細(xì)胞。2004年，Gargett和Chan等發(fā)表文章首次提出子宮干細(xì)胞存在的概念。近年來(lái)，亦有大量基礎(chǔ)及臨床研究證實(shí)了子宮組織中存在具有自我更新、高度增殖和分化潛能的干細(xì)胞。然而目前的研究仍僅限于通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)、標(biāo)記滯留技術(shù)等方法來(lái)推測(cè)子宮干細(xì)胞的存在，多數(shù)學(xué)者都依靠在造血、神經(jīng)、表皮或其它系統(tǒng)中的干細(xì)胞標(biāo)記去研究子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，所以子宮干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物仍在探索中。分離和鑒定子宮內(nèi)膜干細(xì)胞成了一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的工作。另外，這類(lèi)子宮干細(xì)胞在血管再生及其對(duì)缺血性疾病的治療機(jī)制和效果也未見(jiàn)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的干細(xì)胞一Sca-I+/⑶；34—子宮干細(xì)胞。提供所述^^-1+/⑶34—子宮干細(xì)胞的分離方法，是本發(fā)明的另一發(fā)明目的。本發(fā)明的發(fā)明目的還在于提供所述^^_1+/^034—子宮干細(xì)胞的用途，特別是在缺血性疾病治療方面的用途。首先，本發(fā)明提出了一種Sca-l7CD34—子宮干細(xì)胞，該子宮干細(xì)胞從哺乳動(dòng)物的子宮分離得到，以⑶34 — jca-l+的形式表達(dá)⑶34和ka-Ι，具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)的能力。其次，本發(fā)明提供了一種上述^^-17⑶34一子宮干細(xì)胞的分離方法，該方法使用對(duì)CD34、Sca-I兩種標(biāo)志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行，首先自子宮組織中篩選出對(duì) ⑶34陰性表達(dá)的細(xì)胞，再?gòu)纳鲜觫?4陰性表達(dá)的細(xì)胞中進(jìn)一步篩選出對(duì)ka-Ι陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，即為上述ka-Γ/⑶；34一子宮干細(xì)胞。進(jìn)一步地，所述對(duì)⑶34、Sca-I兩種標(biāo)志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)是⑶34、 Sca-I兩種標(biāo)志蛋白的各自抗體。本發(fā)明提供了一種典子宮干細(xì)胞的分離方法，該方法包括以下順序的步驟
1)獲取消化的子宮組織；
2)應(yīng)用磁珠標(biāo)記的抗CD34抗體，以磁珠篩選法從消化的子宮組織中篩選出CD34一細(xì)
胞；
3)再次應(yīng)用磁珠標(biāo)記的抗SCa-I抗體，以磁珠篩選法從2)中CD34—細(xì)胞中分離出 Sca-I+細(xì)胞，得到ka-l+/CD34 —子宮干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了上述分離得到的&&-1+/^034—子宮干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其方法是在分離得到的ka-l7CD34 一子宮干細(xì)胞中加入1%甲基纖維素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清、 4. 5 XlO4M硫代甘油、25 μ g/mL抗壞血酸、2mM谷氨酰胺、200 μ g/mL飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白，在濕度彡95%，溫度37°C，(X)2濃度5%的環(huán)境下培養(yǎng)。本發(fā)明也提供了一種Sca-I+/⑶34 —子宮干細(xì)胞的分化方法，是將分離得到的ka-l7CD34—子宮干細(xì)胞加入到分化培養(yǎng)基中，對(duì)臍帶血內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)，其中，所述分化培養(yǎng)基的組成為IMDM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和25%內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)基。本發(fā)明分離、培養(yǎng)、分化獲取一子宮干細(xì)胞具有血管再生能力，可以應(yīng)用于制備預(yù)防或治療缺血性疾病的藥物。本發(fā)明首先開(kāi)展了對(duì)子宮干細(xì)胞分離、鑒定、培養(yǎng)和分化方法的研究，首次從子宮內(nèi)膜組織分離出具有ka-l+/CD34—表面標(biāo)記物的細(xì)胞，并鑒定其是具有干細(xì)胞各種特性的子宮干細(xì)胞。體外細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)證明，Sca-I+/⑶；34—表面標(biāo)記物的子宮干細(xì)胞能夠分化成具有分泌多種促血管生成的細(xì)胞因子，與ka-1— /⑶34—細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的細(xì)胞提取物相比，能夠誘導(dǎo)更多的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞遷移(/7<0. 05)并形成血管結(jié)構(gòu)； 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將ka-l7CD34 一子宮干細(xì)胞移植于小鼠缺血后腿及冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后的心梗組織，與生理鹽水對(duì)照組及骨髓MSC組相比，缺血區(qū)的后腿組織再灌注、肌肉缺失及心肌功能情況明顯改善OX0. 05)。所以，本發(fā)明首次證實(shí)了 Sca-I+/⑶34一子宮干細(xì)胞的血管再生能力及其對(duì)缺血性疾病的治療效果，為缺血性疾病患者帶來(lái)了希望。


圖1是富集的ka-Γ/⑶；34—子宮干細(xì)胞的流式鑒定結(jié)果圖。圖2是ka-l7CD34—子宮干細(xì)胞與—/CD34 ―、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)相比誘導(dǎo)人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的遷移結(jié)果圖。圖3是^^-1+/⑶34一子宮干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)誘導(dǎo)人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)的能力比較圖。圖4是^^-1+/⑶34一子宮干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分別種植在小鼠缺血后腿組織對(duì)再灌注和肌肉缺失的效果比較結(jié)果圖。圖5是^^-1+/⑶34—子宮干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分別種植在心肌梗死區(qū)組織對(duì)心臟功能影響效果評(píng)價(jià)比較圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 =Sca-I+/⑶34—子宮干細(xì)胞的分離。1)異氟醚麻醉8-10周齡小鼠，氣管插管，呼吸機(jī)維持呼吸，2-3%異氟醚維持麻醉。2)已麻醉小鼠仰臥位，正中開(kāi)胸，撕開(kāi)心包，切開(kāi)右心房，從主動(dòng)脈內(nèi)持續(xù)以生理壓力灌注0. 9%生理鹽水，沖洗組織，直至從右心房中流出干凈(無(wú)血液污染)的生理鹽水。3)開(kāi)腹，取出子宮，并將其充分切碎。4)用0. 25%胰蛋白酶、2mg/ml膠原酶、0. 01%DNA酶，37°C消化1小時(shí)，以盡量減少
細(xì)胞表面標(biāo)志物的破壞。5)從上述消化的組織中，應(yīng)用磁珠標(biāo)記的抗⑶34抗體(stemcell公司，加拿大)， 以磁珠篩選法篩選出CD34—細(xì)胞。步驟為收集消化液，用200目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞到圓底聚苯乙烯管內(nèi)，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞數(shù)控制在IO7-IO8之間，然后按照分選試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。6)再次應(yīng)用磁珠標(biāo)記的抗ka-Ι抗體(stemcell公司，加拿大)，以磁珠篩選法從上步篩選出的細(xì)胞中分離出ka-Γ細(xì)胞，分離步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，得到ka-l7CD34 — 子宮干細(xì)胞。7)用培養(yǎng)基清洗篩選出的細(xì)胞后，鋪盤(pán)培養(yǎng)。8)用流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定篩選后^^-1+/⑶34—子宮干細(xì)胞的純度，結(jié)果顯示，提取的ka-Γ/⑶；34—子宮干細(xì)胞純度可以達(dá)到96. 3% (結(jié)果見(jiàn)圖1)。實(shí)施例2 =Sca-I+/⑶34 —子宮干細(xì)胞的培養(yǎng)。將實(shí)施例1篩選出的細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)盤(pán)中，加入1%甲基纖維素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、 10%胎牛血清、4. 5 X IO4M硫代甘油、25 μ g/mL抗壞血酸、2mM谷氨酰胺、200 μ g/mL飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白，培養(yǎng)環(huán)境保持在濕度> 95%，溫度37 °C，CO2濃度5%。實(shí)施例3 =Sca-I+/⑶34 —子宮干細(xì)胞的分化。分化培養(yǎng)基組成IMDM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和25%內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)基。Sca-I+/⑶34—子宮干細(xì)胞、Sca-I— /⑶34—細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的細(xì)胞提取物分別加入到基質(zhì)膠中，對(duì)人臍帶血內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和平滑肌細(xì)胞(SMC)分別進(jìn)行培養(yǎng)，并用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照組，以形成新生血管的長(zhǎng)度來(lái)評(píng)價(jià)HUVECs形成血管結(jié)構(gòu)的能力。結(jié)果顯示，Sca-I+/⑶34—子宮干細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)的能力較ka-Ι 一 /⑶34—和骨髓MSC為強(qiáng)，具體見(jiàn)圖2、圖3。圖2A-B說(shuō)明的是ka-Γ/⑶；34一子宮干細(xì)胞誘導(dǎo)人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移結(jié)果。圖2A顯示的是HUVEC遷移的染色結(jié)果。計(jì)數(shù)細(xì)胞從圖2B可知，與^^-廠/⑶34 一對(duì)照細(xì)胞和骨髓MSC相比，Sca-l7CD34—子宮干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)更多的內(nèi)皮細(xì)胞遷移，細(xì)胞數(shù)目有顯著性差異0X0. 01或/7<0.05)。圖2C-D說(shuō)明的是^^-1+/0)34—子宮干細(xì)胞誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞(SMC)遷移結(jié)果。圖2C顯示的是SMC遷移細(xì)胞的染色結(jié)果。計(jì)數(shù)細(xì)胞從圖2D可知，與ka-Ι — /⑶34 —細(xì)胞和骨髓MSC誘導(dǎo)能力比較，ka-Γ/⑶34 —子宮干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)更多的平滑肌細(xì)胞遷移0X0. 01或/7<0. 05)，即Sca-I+/⑶；34—子宮干細(xì)胞具有更大的誘導(dǎo)血管形成的能力。圖3顯示的是^^-1+/⑶；34一子宮干細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)的的長(zhǎng)度圖， ka-l7CD34—子宮干細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)的的長(zhǎng)度與生理鹽水及骨髓MSC對(duì)照組相比，有顯著性差異0X0. 01或/7<0. 05)。所以說(shuō)，Sca-17CD34—子宮干細(xì)胞的分化趨勢(shì)及分化功能均與血管的形成密切相關(guān)，子宮干細(xì)胞的這種分化趨勢(shì)，最終決定了其具有強(qiáng)大的新生血管形成能力。
實(shí)施例4 Sca-I+/⑶；34—子宮干細(xì)胞體內(nèi)血管再生能力的鑒定。1)異氟醚持續(xù)吸入麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，固定仰臥位。脫毛和消毒后，分別分離左、右腿股動(dòng)脈，雙側(cè)股動(dòng)脈分別在分支以上用手術(shù)線結(jié)扎。2)小鼠后肢缺血模型建立M小時(shí)后，分別將^^-1+/⑶；34—子宮干細(xì)胞和骨髓MSC 種植在股動(dòng)脈結(jié)扎后的缺血后腿組織中，對(duì)側(cè)下肢缺血部位注射單純培養(yǎng)基作為對(duì)照。3)股動(dòng)脈結(jié)扎前和移植后1小時(shí)、1天、4天、7天、14天、21天對(duì)缺血區(qū)組織的再灌注情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。缺血區(qū)組織的再灌注評(píng)價(jià)采用激光多普勒血流灌注成像分析儀測(cè)量 (PeriScan PIM 3 Systems，瑞典)。4)結(jié)果計(jì)算缺血區(qū)和非缺血區(qū)血流比例比較。
結(jié)果見(jiàn)圖4，ka-Γ/⑶；34—子宮干細(xì)胞移植組的組織再灌注情況明顯好于骨髓MSC 組，并且在細(xì)胞移植21天后對(duì)兩組動(dòng)物缺血區(qū)肌肉缺失的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，Sca-I+/⑶；34一子宮干細(xì)胞組的肌肉缺失要顯著少于骨髓MSC組(/7<0. 05)和生理鹽水對(duì)照組(/7<0. 01)，說(shuō)明子宮干細(xì)胞確實(shí)能夠形成大量有功能的血管，并能夠在一定程度上恢復(fù)組織灌注，減少組織損傷。實(shí)施例5 =Sca-I+/⑶34 —子宮干細(xì)胞對(duì)缺血性心臟疾病的治療效果。1)實(shí)驗(yàn)小鼠氣管插管二％異氟醚持續(xù)吸入麻醉。實(shí)驗(yàn)鼠左側(cè)開(kāi)胸，用7-0普理靈線結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，至30%左心室壁梗死。2)分別將ka-Γ/⑶；34—子宮干細(xì)胞和骨髓MSC細(xì)胞種植在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后的心肌梗死區(qū)組織內(nèi)，用單純培養(yǎng)基注射作為對(duì)照。3)分別在細(xì)胞移植后0天、7天、14天和35天應(yīng)用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)小鼠心臟功能。在細(xì)胞移植后35天，壓力容積導(dǎo)管測(cè)定儀進(jìn)一步評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)小鼠的心臟功能。結(jié)果見(jiàn)圖5，其中圖5A-B應(yīng)用超聲心動(dòng)圖來(lái)評(píng)價(jià)心臟功能(縮短分?jǐn)?shù)FS)，可以看出在細(xì)胞移植后的0天、7天、14天和35天，Sca-I+/⑶；34—子宮干細(xì)胞移植組小鼠的心臟功能較骨髓MSC細(xì)胞移植組明顯提高。圖5C-D應(yīng)用壓力容積導(dǎo)管測(cè)定儀來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心臟功能，發(fā)現(xiàn)ka-l7CD34 —子宮干細(xì)胞移植組動(dòng)物的射血分?jǐn)?shù)高于其他兩組 (/7<0. 05)?？傊?，實(shí)驗(yàn)組小鼠的心臟功能明顯高于對(duì)照組。所以，子宮干細(xì)胞通過(guò)新生血管形成，改善了缺血區(qū)心肌的灌注，在一定程度上恢復(fù)了心臟功能，對(duì)缺血性心臟病有較為明顯的治療作用。同時(shí)也進(jìn)一步證明了子宮干細(xì)胞的增生、分化功能和新生血管形成的能力。在體內(nèi)水平證實(shí)了子宮干細(xì)胞對(duì)缺血性疾病的治療作用。
權(quán)利要求
1.一種Sca-r/CD34 —子宮干細(xì)胞，該子宮干細(xì)胞從哺乳動(dòng)物的子宮分離得到，以 CD34 —、Sca-Γ 的形式表達(dá) CD34 和 。
2.—種ka-Γ/⑶；34—子宮干細(xì)胞的分離方法，該方法使用對(duì)⑶34、Sca-I兩種標(biāo)志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ka-l7CD34—子宮干細(xì)胞的分離方法，其特征是對(duì)CD34、 Sca-I兩種標(biāo)志蛋白具有特異親和性的物質(zhì)是CD34、Sca-I兩種標(biāo)志蛋白的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ka-l7CD34—子宮干細(xì)胞的分離方法，其特征是包括以下順序的步驟1)獲取消化的子宮組織；2)應(yīng)用磁珠標(biāo)記的抗CD34抗體，以磁珠篩選法從消化的子宮組織中篩選出CD34一細(xì)胞；3)再次應(yīng)用磁珠標(biāo)記的抗SCa-I抗體，以磁珠篩選法從2)中CD34—細(xì)胞中分離出 Sca-I+細(xì)胞，得到ka-l+/CD34 —子宮干細(xì)胞。
5.一種ka-Γ/⑶34—子宮干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是在分離得到的ka-Γ/⑶34 — 子宮干細(xì)胞中加入1%甲基纖維素培養(yǎng)基、10%胎牛血清、4. 5 XlO4M硫代甘油、25 μ g/mL抗壞血酸、2mM谷氨酰胺、200 μ g/mL飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白，在濕度彡95%，溫度37°C，0)2濃度5%的環(huán)境下培養(yǎng)。
6.一種ka-Γ/⑶34—子宮干細(xì)胞的分化方法，其特征是將分離得到的ka-Γ/⑶34 — 子宮干細(xì)胞加入到分化培養(yǎng)基中，其中，所述的分化培養(yǎng)基組成為IMDM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和25%內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求1的Sca-17CD34—子宮干細(xì)胞在制備預(yù)防或治療缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
Sca-1+/CD34－子宮干細(xì)胞，從哺乳動(dòng)物的子宮分離得到，以CD34－、Sca-1+的形式表達(dá)CD34和Sca-1，其分離方法是應(yīng)用磁珠標(biāo)記的抗CD34抗體從消化的子宮組織中篩選出CD34－細(xì)胞；再應(yīng)用磁珠標(biāo)記的抗SCa-1抗體從CD34－細(xì)胞中分離出Sca-1+細(xì)胞，得到Sca-1+/CD34－子宮干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Sca-1+/CD34－子宮干細(xì)胞具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)的能力，能夠形成大量有功能的血管，并能夠在一定程度上恢復(fù)組織灌注，減少組織損傷；體內(nèi)水平證實(shí)Sca-1+/CD34－子宮干細(xì)胞對(duì)缺血性疾病有治療效果，可以用于制備預(yù)防或治療缺血性疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K35/48GK102229911SQ20111015475
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者劉志貞, 孫卓, 李仁科, 解軍 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)