專利名稱：重組腺相關(guān)病毒載體及其制備和應(yīng)用的制作方法
重組腺相關(guān)病毒載體及其制備和應(yīng)用本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)與TRAIL目的基因的克隆，及Plkl的RNAi序列設(shè)計。進一步地，本發(fā)明涉及含有Endostatin-TRAIL-ShPlkl的重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法和抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體具有明顯的抗腫瘤作用，且毒副作用小，具有良好的應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的重大疾病之一。目前臨床上主要是采用放射治療及化學(xué)療法。然而，有些惡性腫瘤對放射治療不敏感，且有些患者對化療易產(chǎn)生耐藥性，因此尋找新的有效治療腫瘤的方法是臨床醫(yī)生與患者的急切愿望 。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，基因治療腫瘤成為研究熱點，其中治療基因可以是抑癌基因或誘使腫瘤死亡的基因，也可以是各種細胞因子或免疫原性基因。如將多種抑癌基因或凋亡誘導(dǎo)基因?qū)肽[瘤細胞以抑制腫瘤生長或凋亡。還可以使用反義基因技術(shù)，核酸技術(shù)或RNA干擾技術(shù)來封閉或降解基因或其產(chǎn)物以達到治療目的。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的生成，通過抑制腫瘤新生血管生成，也是治療腫瘤的一種途徑。在內(nèi)源性血管生成抑制因子中，內(nèi)皮抑素最引人注目，在體外它對內(nèi)皮細胞具有明顯的增殖抑制活性。在體內(nèi)，其可特異性地抑制內(nèi)皮細胞增殖和新生血管形成，從而抑制腫瘤生長。但國內(nèi)外均有文獻報道ES需與化療藥物聯(lián)用才有較好的效果(ClinCancer Res，2004，10 (I pt I) :33-42.;中國肺癌雜志，2005，8 (4) :283-290.臨床腫瘤學(xué)雜志，2007，12(10) :728-735.)腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF)超家族的成員之一，它能選擇性地殺死腫瘤細胞，而對大多數(shù)正常細胞卻無殺傷作用(生命科學(xué)，2007，19 :492-495)。TRAIL與受體結(jié)合后，除激活凋亡誘導(dǎo)信號途徑外，還能激活A(yù)kt途徑、核因子KB(NF-KB)、蛋白激酶C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員等。反過來，這些被活化的途徑或因子能調(diào)節(jié)TRAIL的凋亡誘導(dǎo)活性(Int J Mol Med, 2006,18 505-510.)。Polo樣激酶I (polo-like kinase I, PLK1)是一種廣泛存在于真核細胞中的絲/蘇氨酸激酶，在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PLKl在多種腫瘤中表達增高并與某些腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。通過利用反義寡核苷酸、RNA干擾技術(shù)和化學(xué)合成PLKl小分子抑制劑等方法阻斷PLKl的表達或降低其激酶活性，可顯著抑制Plkl基因及其蛋白表達，有效阻止腫瘤細胞的生長和增殖，進而能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖并介導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡(Nature Chemical Biology, 2006, 2 (12) :711-717, World J Gastroenterol, 2005,11(29) :4596-4599)。但RNA干擾技術(shù)存在穩(wěn)定性和脫靶效應(yīng)等問題(Gerie Ther, 2006,13:464 Nucleic Acids Res,2005，33 :452)。腺相關(guān)病毒(adeno associated virus,AAV)是一類微小、無被膜及具有二十面體結(jié)構(gòu)的細小單鏈DNA病毒。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)與AAV相關(guān)的疾病報道，因此被公認為是最安全的病毒載體，成為目前基因治療載體研究的熱點。但由于包裝容量的限制，其多用于單一基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Curr Opin Mol Ther. 2003 ;5 (4) :367-75.)。

發(fā)明內(nèi)容
惡性腫瘤的發(fā)生主要是由于多種因素誘發(fā)機體細胞的基因突變，即基因的缺陷或異常所致。本發(fā)明率先選擇多途徑抑制腫瘤新生血管生成；誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；并結(jié)合RNA干擾PLKl的表達來抑制腫瘤細胞生長來聯(lián)合抗腫瘤。具體而言，本發(fā)明首次將Endostatin、TRAIL、ShPlkl三基因克隆構(gòu)建于同一 AAV載體上，經(jīng)包裝純化后獲得新型重組腺相關(guān)病毒載體。經(jīng)實驗顯示，本發(fā)明的新型重組腺相關(guān)病毒載體具有顯著的抗癌作用。所以，本發(fā)明的第一方面提供了一種重組載體，該載體含有如下三種能在體內(nèi)表達的基因或核苷酸序列Endostatin、TRAIL和ShPlkl。優(yōu)選地，本發(fā)明的載體為病毒載體， 例如腺相關(guān)病毒載體。備選地，本發(fā)明所提供的重組載體中所含有的三種基因或核苷酸序列是通過沿著腺相關(guān)病毒載體的轉(zhuǎn)錄方向依次可操作地連接的。例如通過沿著腺相關(guān)病毒載體的轉(zhuǎn)錄方向依次可操作地連接有Endostatin基因或核苷酸序列、IRES序列、TRAIL基因或核苷酸序列、ShPlkl基因或核苷酸序列。示例性地,本發(fā)明的重組載體是如圖I所示的。示例性地,本發(fā)明的Endostatin基因或核苷酸序列的序列是Endostatin基因的序列通過以從人胎盤組織提取的總RNA為模板，以SEQ ID NO :1和2為引物進行RT-PCR擴增獲得的目的Endostatin (612bp)基因或核苷酸序列。示例性地，本發(fā)明的TRAIL基因或核苷酸序列是通過以TRAIL (SolubleTRAIL，95-281AA)基因為模板，以SEQ ID NO :5和6為引物進行PCR擴增獲得的目的TRAIL(I14-281 AA，507bp)。示例性地，本發(fā)明的ShPlkl基因或核苷酸序列是以PGPHl載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，商品名pGPHl Plasmid.)模板，以SEQ ID NO :7和8為引物通過PCR擴增，獲得的ShPlkl (392bp)的目的片段。應(yīng)當理解，本發(fā)明在的上述或在實施例中所述的導(dǎo)入至載體中的目的序列僅僅是示例性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明白，可以對本發(fā)明的導(dǎo)入的目的序列進行適當?shù)男揎棧疤崾切揎椇蟮哪康男蛄斜３指髯缘纳飳W(xué)活性。在本發(fā)明的教導(dǎo)下，這種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如通過保守性突變可將Endostatin基因或核苷酸序列和/或TRAIL基因或核苷酸序列進行修飾。對于本發(fā)明的ShPlkl基因或核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)干擾RNA的設(shè)計原理可對其序列進行適當?shù)母淖兓蛐揎?，只要修飾或改變后的ShPlkl基因或核苷酸序列能抑制Plkl基因及其蛋白表達?？傊?，發(fā)明人認為，不應(yīng)當將本發(fā)明的導(dǎo)入的目的基因或核苷酸序列限制為實施例中所例舉的那些。本發(fā)明另一方面提供了制備本發(fā)明的重組載體的方法，具體包括以下步驟(I) pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 質(zhì)粒的制備具體地，先從人胎盤提取RNA，進行Endostatin基因克隆，獲得目的基因大小為612bp，同樣從人胎盤的RNA，克隆TRAIL基因，獲得507bp大小的目的基因；再用PCR法從P1424 質(zhì)粒擴增獲得 392bp ShPlkl (1424)片段。將 pAAV_IRES_hrGFP 質(zhì)粒改造，在 PolyA的下游的Cpo I的位點處插入ShRNA序列元件，獲得pAAV-IRES-hrGFP-ShRNA質(zhì)粒，分別依次將 TRAIL 與 Endostatin 插入 pAAV-IRES-hrGFP-ShRNA，獲得 pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl。(2)rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 的制備同常規(guī)，本發(fā)明制備方法還包括包裝和純化該重組腺相關(guān)病毒載體的步驟將pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 及輔助質(zhì)粒 pAAV-RC 和 pHelper 三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，例如用磷酸鈣共沉淀法；經(jīng)肝素一瓊脂糖親和層析方法純化，制得高純度高滴度重組腺相關(guān)病毒載體 rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl。根據(jù)本發(fā)明，所述的包裝細胞可以是現(xiàn)有技術(shù)中常用的包裝細胞，例如人胚腎細胞HEK293或者金黃地鼠胚胎腎細胞BHK-21等。對于本發(fā)明所述的三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，優(yōu)選采用磷酸鈣共沉淀法。

根據(jù)本發(fā)明制備的rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl用于腫瘤細胞株及腫瘤模型鼠顯示出明顯的抗腫瘤效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所述的腺相關(guān)病毒優(yōu)選用AAV2型。本發(fā)明的再一方面提供了本發(fā)明的病毒載體的醫(yī)藥用途，例如在制備對抗癌癥的藥物或試劑中的作用。


從下面給出的說明，并結(jié)合本發(fā)明的附圖，本申請的內(nèi)容將變得更清楚、明了。圖I :質(zhì)粒 pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 的結(jié)構(gòu)不意圖。圖 2 :純化的 rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 的 SDS-PAGE 凝膠電泳圖，其中其外殼蛋白分子量為VP1，VP2，VP3 ；M為低分子量蛋白標記物。圖3 :用地高辛標記的IRES基因做探針，點雜交檢測純化后rAAV-Endostatin-TRAIL-ShPlkl 的滴度。其中Al-6 0. 5ng 的質(zhì)粒 pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 作 I : 2 的系列稀釋；B1-6 :5μ I 的 rAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 作 I : 2 的系列稀釋。圖4 rAAV-Endostatin-IRES-Trail-ShPlkl 轉(zhuǎn)染 A549 及人血管內(nèi)皮細胞 96 小時后細胞形態(tài)。Al，A2，A3分別為A549細胞未加病毒處理組、50 μ L(25M0I)病毒處理組和100yL(50M0I)病毒處理組。81，82，83分別為八549細胞未加病毒處理組、5(^1^病毒處理組和100 μ L病毒處理組；C1，C2，C3分別為血管內(nèi)皮細胞未加病毒處理組、50 μ L病毒處理組和100 μ L病毒處理組；以及D1，D2，D3分別為血管內(nèi)皮細胞未加病毒處理組、50 μ L病毒處理組和100 μ L病毒處理組。圖5 :rAAV-Endostatin-IRES-TraiI-ShPlkl 的體外有效性實驗 圖6 :采用RT-PCR檢測基因的表達。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實施例中所采用的分子生物學(xué)技術(shù)可參見J.薩母布魯克等編的《分子克隆實驗指南》;所使用的工具酶均購自New England Biolab公司，具體的反應(yīng)條件和使用的方法均參考商品說明書；所使用的膠回收試劑盒購自安比奧生物技術(shù)公司，使用方法參考商品說明書。實施例I.構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒載體rMV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl質(zhì)粒。I) · Endostatin 基因的克隆用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)從人胎盤組織提取總RNA (生物技術(shù)通訊，2002，5 (13) =346-348)，進行 RT-PCR擴增，獲得Endostatin (612bp)目的基因，同時在其上游具有EcoR I酶切位點，下游具有XhoI酶切位點。PCR擴增Endostatin基因所用引物如下上游引物:5，-ggaattc atgcacagccaccgcgacttcc-3’ (SEQ ID NO:I)；下游引物5，-CCgctcgag ttacttggaggcagtcatg-3，(SEQ ID NO :2)。PCR擴增Endostatin基因體系如下
權(quán)利要求
1.重組載體，該載體含有如下三種能在體內(nèi)表達的基因或核苷酸序列Endostatin、TRAIL 和 ShPlkl。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載體，其為病毒載體，例如腺相關(guān)病毒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的載體，其中含有的三種基因或核苷酸序列是通過沿著腺相關(guān)病毒載體的轉(zhuǎn)錄方向依次可操作地連接的，例如通過沿著腺相關(guān)病毒載體的轉(zhuǎn)錄方向依次可操作地連接有Endostatin基因或核苷酸序列、IRES序列、TRAIL基因或核苷酸序列、ShPlkl基因或核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其是如圖I所示的重組腺病毒載體。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項所述的重組載體，其中Endostatin基因或核苷酸序列的序列是Endostatin基因的序列通過以從人胎盤組織提取的總RNA為模板，以SEQ ID NO : I和2為引物進行RT-PCR擴增獲得的目的Endostatin (612bp)基因或核苷酸序列；和/或 TRAIL基因或核苷酸序列是通過以TRAIL(Soluble TRAIL,95-281AA)基因為模板，以SEQ ID NO :5和6為引物進行PCR擴增獲得的目的TRAIL(114-281AA，507bp);和/或 ShPlkl基因或核苷酸序列是以PGPHl載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，商品名pGPHl Plasmid.)模板，以SEQ ID NO 7和8為引物通過PCR擴增，獲得的ShPlkl (392bp)的目的片段。
6.制備權(quán)利要求1-5中任一項的的重組載體的方法，包括以下步驟 (a)用基因工程方法構(gòu)建質(zhì)粒pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl，其包含沿著腺相關(guān)病毒載體的轉(zhuǎn)錄方向依次可操作地連接的Endostatin基因或核苷酸序列、IRES序列、TRAIL基因或核苷酸序列、ShPlkl基因或核苷酸序列； (b)將(a)中構(gòu)建的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞； (c)收獲(b)中的細胞并獲得目的病毒載體。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的輔助質(zhì)?？梢詾閜AAV-RC和pHelper;和/或所述包裝細胞為包裝細胞是人胚腎細胞HEK293或者金黃地鼠胚胎腎細胞BHK-21，優(yōu)選人胚腎細胞HEK293 ;和/或所述轉(zhuǎn)染方法可以是電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽離子物質(zhì)或病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，優(yōu)選磷酸鈣共沉淀法。
8.權(quán)利要求1-5中任一項的的重組載體在制備腫瘤治療藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1-5中任一項的的重組載體用于抑制腫瘤生長的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9或10的用途，其中的腫瘤包括肝癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、腎癌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及本發(fā)明涉及重組腺相關(guān)病毒載體及其制備和應(yīng)用。進一步地，本發(fā)明涉及含有Endostatin-TRAIL-ShPlk1的重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法和抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體具有明顯的抗腫瘤作用，且毒副作用小，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K48/00GK102839194SQ20111016911
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者唐升斌, 程笠人, 肖艷桃, 田晶, 譚孟群 申請人:深圳市湘雅生物醫(yī)藥研究院