專利名稱：Her2-neu抗原陽性腫瘤治療性疫苗的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種Her2-neu抗原陽性腫瘤治療性疫苗的制備及應(yīng)用，所述的融合蛋白包括熱休克蛋白與Her2-neu腫瘤抗原。
背景技術(shù)：
HER2/neu是人類腫瘤常發(fā)生改變的一個癌基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是表皮生長因子受體(Epidermal growth-factor receptor, EGFR)家族的第二位成員。表皮生長因子受體家族，也稱為!ER或ErbB2家族，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞生長、分化及存活的重要調(diào)節(jié)因子。人HER2/neu基因定位于17號染色體短臂，表達(dá)產(chǎn)物為分子量185KDa的單鏈跨膜 糖蛋白，即Pl85。pl85含有1255個氨基酸殘基，細(xì)胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶活性，是一種酪氨酸激酶受體。人HER2/neu蛋白由三部分組成細(xì)胞外區(qū)(extracellular domain,EO))、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)(intracellular domain, IQ))。HER2/neu的EQ)包括4個亞結(jié)構(gòu)域,亞結(jié)構(gòu)域I和III是配體結(jié)合域，介導(dǎo)受體配體結(jié)合；亞結(jié)構(gòu)域II和IV，富含半胱氨酸，在形成受體二聚體過程中起著重要作用。HER2/neu胞內(nèi)信號途徑主要有2條，分別為絲裂原活化蛋白激酶(Ras-mitogen activated protein kinase, Ras/MAPK)、憐酸肌醇 3 激酶 / 蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinasee/protein kinase B，PI3K/AKT)。一般認(rèn)為，HER2/neu 的ECD與配體結(jié)合后，引發(fā)受體變構(gòu)，導(dǎo)致其與相同的或其他EGFR家族成員形成同、異二聚體，隨后受配體被內(nèi)吞并激活蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK),可使細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PTK活性顯著增加最終使癌細(xì)胞核內(nèi)早期反應(yīng)基因如原癌基因fos和jun等轉(zhuǎn)錄水平增加，促進(jìn)有絲分裂等，從而能夠促進(jìn)腫瘤形成、進(jìn)展。而且，HER2/neu的過度表達(dá)能引起HER2/neu同二聚體的激活而無需配體的結(jié)合，從而引起不受控制的細(xì)胞生長和癌基因的轉(zhuǎn)化，因此，HER2/neu全蛋白或含有胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)的片段應(yīng)用于腫瘤疫苗中具有致瘤性和導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的過度轉(zhuǎn)化的潛在風(fēng)險。此外，HER2/neu蛋白主要在胚胎期的組織或器官中表達(dá)，而在成年組織或器官極少表達(dá)，因而機(jī)體免疫系統(tǒng)往往不能有效識別而導(dǎo)致免疫耐受。人類的多種腫瘤組織均存在HER2/neu過度表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原發(fā)性腎細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌等。目前，手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)療法對于早期ffiR2/neu陽性腫瘤具有一定的療效，但一方面化療、放療具有較大的副作用，另一方面由于許多腫瘤發(fā)現(xiàn)較晚，往往失去手術(shù)治療的最佳機(jī)會，所以通過增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用殺滅腫瘤細(xì)胞、達(dá)到治療腫瘤目的的免疫與基因療法作為腫瘤治療的一種新模式，成為腫瘤治療和免疫學(xué)研究的熱點。目前對于HER2/neu陽性腫瘤已有多種免疫和基因治療方案，如單克隆抗體、構(gòu)建HER2/neu重組病毒疫苗、核酸疫苗、細(xì)胞因子的應(yīng)用等。隨著HER2/neu氨基酸序列中T細(xì)胞表位被發(fā)現(xiàn)，并證實其可以在體外誘導(dǎo)出特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以這些表位肽為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗受到了研究者的關(guān)注，Disis采用完整P185蛋白不能有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，Georg采用HLA-A*0201限制性的九肽表位E75(Her2369_377)作為多肽疫苗可促發(fā)淋巴結(jié)陽性乳腺癌(NPBC)接受過治療的某些無疾病患者的特異性免疫反應(yīng)，然而，目前尚沒有取得令人滿意的免疫效果。因此選擇適當(dāng)?shù)膄fiR2/neu原癌基因片段區(qū)域是關(guān)鍵點，該片段既能夠暴露某些表位而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，又能夠避免全長基因表達(dá)產(chǎn)物帶來潛在轉(zhuǎn)化危險。近年來，腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)、腫瘤免疫逃逸和抗腫瘤免疫應(yīng)答機(jī)制的逐步闡明使人們認(rèn)識到，如何有效提呈腫瘤抗原、激發(fā)機(jī)體對腫瘤抗原的應(yīng)答能力是影響療效的一個關(guān)鍵因素。樹突狀細(xì)胞研究的深入不僅使基礎(chǔ)免疫學(xué)研究取得重要進(jìn)展，而且給腫瘤的免疫治療帶來了希望。DC作為機(jī)體免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell, APC),能高效地攝取、加工處理和提呈抗原，并能夠顯著的激活初始型T細(xì)胞以啟動T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng),是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動者,處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。在受到抗原刺激后，DC經(jīng)由循環(huán)或淋巴系統(tǒng)遷移至二級淋巴器官，并在此將所加工處理的抗原提呈給T細(xì)胞，在此過程中MHCI、II類分子、粘附分子等免 疫相關(guān)分子的高表達(dá)對DC功能的發(fā)揮起十分重要的作用。采用腫瘤抗原或其中的某些特異性表位肽致敏的DC作為腫瘤治療性疫苗已經(jīng)在基礎(chǔ)及臨床研究中得到了證實，在前列腺癌、黑色素瘤、惡性淋巴瘤等腫瘤中取得了較好的療效，被認(rèn)為是目前療效最有前景的腫瘤免疫治療方案。然而，單純采用小分子的抗原肽體外致敏DC的效率一般較低，DC在攝取小分子肽后，往往不能有效遞呈抗原并激發(fā)特異性的CTL(即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)，因此如何增強(qiáng)DC對抗原的加工遞呈，以期更有效地激發(fā)腫瘤抗原特異性的免疫應(yīng)答仍然是腫瘤免疫治療研究中亟待解決的問題。近年來有人嘗試?yán)幂o助蛋白，如KLH(鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白)輔助腫瘤特異性的抗原去刺激DC，結(jié)果可增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用高效的輔助分子作為免疫佐劑(Adjuvant)，增強(qiáng)腫瘤抗原肽致敏DC的效能，從而誘導(dǎo)出更強(qiáng)的抗腫瘤免疫，是提高DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療的一個重要途徑。隨著免疫學(xué)研究的進(jìn)展，新一代佐劑不斷被發(fā)現(xiàn)，如熱休克蛋白(Heat shockprotein, Hsp)、IFN- y、IL-12、LPS, lipid A和CpG等，其中Hsp以其所具有的獨特的生物學(xué)效應(yīng)，受到越來越多的關(guān)注。當(dāng)細(xì)胞遭受嚴(yán)重應(yīng)激時，Hsp可從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，成為一種內(nèi)在的“危險信號”向APC發(fā)出警示信息，并可活化DC，APC被Hsp趨化和激活后必將進(jìn)一步激發(fā)免疫反應(yīng)，引發(fā)抗原攝取和遞呈，靜息的T細(xì)胞由于獲得APC呈遞的抗原和危險信號的雙重刺激而活化，從而引起抗體產(chǎn)生、病損細(xì)胞及感染因子的清除等一系列免疫過程。綜上所述，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)有效的Her2-neu陽性腫瘤治療性疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的就是提供一種新的具有熱休克蛋白和Herf-neu兩者生物活性的物質(zhì)，它是熱休克蛋白和Her2-neu胞外區(qū)片段的融合蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述融合蛋白的DNA、含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種成本低廉和/或步驟簡便的生產(chǎn)所述Hsp70Ll-Her2-neu融合蛋白的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用該融合蛋白制備Herf-neu陽性腫瘤治療性疫苗的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種融合蛋白，它包括(a)腫瘤抗原Her2_neu元件,該元件具有人腫瘤抗原Her2_neu的胞外區(qū)或其免疫原性片段的氨基酸序列；(b)熱休克蛋白元件，該元件具有人熱休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)任選的位于腫瘤抗原Her2_neu元件和熱休克蛋白元件之間的連接肽序列。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤抗原Her2_neu元件的長度為90-200個氨基酸，較佳地100-150個氨基酸。·在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤抗原Her2_neu元件為含腫瘤抗原Her2_neu的342-456位的片段(如含341-456位的片段);和/或所述的熱休克蛋白元件選自下組Hsp70或Hsp70Ll。在另一優(yōu)選例中，所述的接頭肽序列長度為1-30個氨基酸，較佳地1-4個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述的熱休克蛋白元件具有SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列，所述的腫瘤抗原Her2-neu元件具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的載體和含有上述載體的宿主細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、酵母(如畢赤酵母、釀酒酵母、或甲醇酵母)。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明融合蛋白的方法，包括步驟在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第三方面所述細(xì)胞，從而表達(dá)出本發(fā)明第一發(fā)明所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明第一部分所述融合蛋白的用途，它用于制備治療Her2-neu陽性腫瘤的治療性疫苗藥物或用于致敏樹突狀細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，Her2_neu陽性腫瘤選自下組乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種樹突狀細(xì)胞，它是用本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白致敏過的樹突狀細(xì)胞。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種Herf-neu陽性腫瘤預(yù)防性或治療性疫苗，它含有安全有效量本發(fā)明第六方面所述的樹突狀細(xì)胞或用樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞或本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種制備治療性疫苗的方法，包括步驟將有安全有效量本發(fā)明第六發(fā)明所述的樹突狀細(xì)胞或用所述樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞或本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白，與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑進(jìn)行混合，從而形成治療性疫苗。在本發(fā)明的第九方面，提供了一種制備致敏的樹突狀細(xì)胞的方法，包括步驟將樹突狀細(xì)胞與本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白接觸，從而致敏樹突狀細(xì)胞。
在本發(fā)明的第十方面，提供一種Her2_neu陽性腫瘤特異性細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)方法，包括以下步驟采用本發(fā)明所述的融合蛋白致敏的樹突狀細(xì)胞體外刺激人外周血淋巴細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，該刺激步驟包括(I)采用IO-IOOii g/ml的本發(fā)明所述的融合蛋白，與IO5-IO6個樹突狀細(xì)胞共同孵育，作用2-48小時，收集致敏的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞；(2)將致敏后且用射線滅活的樹突狀細(xì)胞按樹突狀細(xì)胞T細(xì)胞為I : 1-10000的比例共同孵育，在完全培養(yǎng)基中添加10-100U/ml的IL-2，10-100ng/ml IL-7，10-100ng/mlIL-10，培養(yǎng)7天；
重復(fù)(I)、(2)步驟3-10次，收集增殖的T細(xì)胞，即為Her2_neu陽性腫瘤特異性T細(xì)胞。 在本發(fā)明的第十方面，提供了一種制備免疫個體的方法，包括步驟將需要免疫的對象施用有安全有效量本發(fā)明第六方面所述的樹突狀細(xì)胞或用所述樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞或本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的對象是哺乳動物(包括人)。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I 顯示了 pPIC9k-Hsp70Ll_Her2342_456 構(gòu)建流程。圖2顯示了 pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456酵母轉(zhuǎn)化子陽性克隆的PCR鑒定結(jié)果。泳道1-10為用于鑒定的轉(zhuǎn)化子克隆，泳道Mk為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000。圖3顯示了經(jīng)各個步驟純化的Hsp70Ll-Her2342_456SDS_PAGE鑒定。泳道L為濃縮后的培養(yǎng)上清；泳道M為通過Phenyl HP柱純化后目標(biāo)蛋白；泳道N為通過Mono Q柱純化后目標(biāo)蛋白(終產(chǎn)品)；泳道MK為標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000。圖4顯示了 Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)Her2/neu特異性的T淋巴細(xì)胞CTL殺傷試驗結(jié)果。圖4A顯示，對于SW620細(xì)胞，Hsp70Ll_Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力顯著高于Her2342_456組(P < 0. 05)，而對照組Hsp70Ll組的效應(yīng)細(xì)胞未顯示顯著的殺傷活性(P< 0. 05)。圖4B 顯示，對于 SK-BR-3 細(xì)胞，Hsp70Ll_Her2342_456 組及 Her2342_456 組的效應(yīng)細(xì)胞均無明顯的殺傷效應(yīng)。圖4C 顯示，負(fù)載 E75(Her2369_377，KIFGSLAFL)的 T2 細(xì)胞可被 Hsp70Ll_Her2342_456組及Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞殺傷，而且前者的殺傷效應(yīng)顯著高于后者(P < 0. 05)，而Hsp70Ll對照組的效應(yīng)細(xì)胞沒有顯著殺傷活性(P < 0. 05)。圖4D顯示,所有實驗組的效應(yīng)細(xì)胞均不能殺傷本身不表達(dá)Her2/neu抗原但表達(dá)HLA-A*0201分子的T2細(xì)胞。圖4E顯示，所有實驗組的效應(yīng)細(xì)胞對結(jié)合有無關(guān)肽CAP-I的T2細(xì)胞均無顯著的殺傷活性。圖5顯示了 Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白致敏的DC免疫誘導(dǎo)Her2/neu特異性CTL的檢測結(jié)果圖5A顯示，對于SW620細(xì)胞，Hsp70Ll_Her2342_456組及Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞有顯著的殺傷，且Hsp70Ll-Her2342_456組殺傷能力明顯高于Her2342_456組(P < 0. 05)，而另兩個對照組包括無明顯殺傷活性。圖5B 顯示，對于負(fù)載E75(Her2369_377)的 T2 細(xì)胞，Hsp70Ll_Her2342_456 組及 Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞對其有殺傷活性，而且前者的殺傷效應(yīng)明顯高于后者(P < 0.05)，而另兩個對照組均無有明顯殺傷活性。圖5C 顯示，對于 SK-BR-3 細(xì)胞，Hsp70Ll_Her2342_456 組及 Her2342_456 組對其均無明 顯的殺傷效應(yīng)。圖顯示，所有實驗組的效應(yīng)細(xì)胞均不能殺傷T2細(xì)胞。圖6顯示了 SW620腫瘤在各過繼回輸組裸鼠體內(nèi)的生長情況?；剌擧sp70Ll-Her2342_456組小鼠脾細(xì)胞的裸鼠，腫瘤出現(xiàn)時間晚于其它對照組；且腫瘤直徑低于各個對照組小鼠的腫瘤直徑。圖7顯示了荷瘤裸鼠的存活曲線，回輸Hsp70Ll_Her2342_456組小鼠脾細(xì)胞的裸鼠，其存活率和生存時間大于其他對照組。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次將Her2/neU胞外區(qū)的免疫原性片段和熱休克蛋白(Hsp70Ll)融合在一起,產(chǎn)生新的融合蛋白。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，所述融合蛋白既具有腫瘤抗原Her2/neu胞外區(qū)的免疫原性又可避免全長Her2/neu基因表達(dá)產(chǎn)物帶來潛在轉(zhuǎn)化危險，還可以通過熱休克蛋白將腫瘤抗原Her2/neu有效致敏樹突狀細(xì)胞，從而制得免疫性顯著提高的Her2/neu陽性腫瘤疫苗。具體地，本發(fā)明Her2陽性腫瘤的治療性疫苗采用了含多個T細(xì)胞表位的Her2342_456與具有獨特免疫佐劑樣效應(yīng)的Hsp70Ll構(gòu)建融合蛋白Her2342_456-Hsp70Ll，致敏DC使Her2342_456中的特異性抗原肽得到有效的識別、加工、處理，并遞呈至體內(nèi)的T細(xì)胞激發(fā)更強(qiáng)的HER2/neu特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，本發(fā)明的融合蛋白可以在兩個元件的協(xié)同下增強(qiáng)抗腫瘤的效果，為抗腫瘤等治療提供新的化合物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。Herf/neu 陽性腫瘤如本文所用，術(shù)語“Herf/neu陽性腫瘤”包括指在腫瘤細(xì)胞膜上高度表達(dá)Her2/neu抗原的腫瘤，代表性的例子包括(但并不限于)直結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤。Her2/neu 兀件如本文所用，術(shù)語“Her2/neu”、“Her2-neu”可互換使用。如本文所用，術(shù)語“Her2_neu元件”、“Her2_neu胞外區(qū)元件”與“腫瘤抗原Her2-neu元件”可以互換，該元件序列與天然的或變異的腫瘤抗原Her2-neU免疫原性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有與天然腫瘤抗原Her2-neU基本相同的生物活性。
優(yōu)選的腫瘤抗原元件Her2_neu是人腫瘤抗原Her2/neu或其免疫原性片段，例如對應(yīng)于全長Her2-neu蛋白的第342-456位、或第341-456位的片段。熱休克蛋白元件如本文所用，術(shù)語“熱休克蛋白”包括熱休克蛋白和熱休克蛋白樣蛋白，代表性的例子包括(但并不限于):Hsp70、Hsp70Ll (Hsp70-like protein I)及其他的熱休克蛋白。這些熱休克蛋白的序列可從Genbank數(shù)據(jù)庫上獲得。 如本文所用，術(shù)語“元件”指構(gòu)成融合蛋白的某一段肽段，它來自于腫瘤抗原、熱休克蛋白的氨基酸序列。在DNA水平，元件指相應(yīng)的編碼序列。熱休克蛋白70L1元件與天然的或變異的全長熱休克蛋白70L1或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有與天然熱休克蛋白70L1基本上相同的生物活性。優(yōu)選的Hsp70Ll元件是人熱休克蛋白70L1，更佳地是全長的熱休克蛋白70L1或其活性片段。
·
Hsp70Ll是本發(fā)明人從人外周血單核細(xì)胞來源的DC cDNA文庫中通過大規(guī)模隨機(jī)測序發(fā)現(xiàn)的一種新分子(GenBank的登錄號AF143723)，生物信息學(xué)分析表明該分子有典型Hsp70家族的特征，和Hsp70家族成員具有較高的同源性。本發(fā)明人前期研究結(jié)果也提示Hsp70L I具有與Hsp70類似的佐劑樣效應(yīng)，其誘導(dǎo)DC產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有促使免疫反應(yīng)向Thl型免疫應(yīng)答偏移的特點，體內(nèi)實驗也表明，Hsp70Ll與抗原肽交聯(lián)的復(fù)合物免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性Thl型免疫應(yīng)答反應(yīng)。連接肽如本文所用，術(shù)語“連接肽”或“氨基酸連接臂”可互換使用，指位于腫瘤抗原Her2/neu胞外區(qū)元件的氨基酸序列和熱休克蛋白元件的氨基酸序列之間的、起連接作用的短肽。連接肽的長度通常為1-40個氨基酸，較佳地為3-20個氨基酸，最佳地為2-10個氨基酸。技術(shù)人員可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法(如參見PNAS 1998 ；95 :5929-5934 ；Protein Eng, 2000 ；13(5) :309-312 ；Protein Eng,2003 ；15(11) :871-879 等文獻(xiàn))設(shè)計連接肽。通常，連接肽不影響或嚴(yán)重影響腫瘤抗原Her2/neu胞外區(qū)元件的氨基酸序列和Hsp70Ll元件的氨基酸序列形成正確的折疊和空間構(gòu)象。優(yōu)選的連接肽例子包括(但并不限于)為了有利于蛋白折疊成相互獨立的結(jié)構(gòu)域，用SGGGGSGGGG等序列作為連接臂是合適的；為了有利于蛋白酶把Her2/neu-HSp70Ll切割兩個獨立的蛋白分子，可用活性X因子的酶切位點(IEGR)作連接臂。相似的，糜蛋白酶I、木瓜蛋白酶、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位點也可設(shè)計作為氨基酸連接臂；為了有利于純化，可把6His作為連接臂，以用金屬親和層析純化Her2/neu-Hsp70L I融合蛋白；上述三種方案的結(jié)合也可設(shè)計成新的氨基酸連接臂，如融合了蛋白酶切位點(NIa蛋白酶)和金屬親和層析位點6His的連接肽。此外，另一種優(yōu)選方式是將腫瘤抗原Her2/neu胞外區(qū)元件和熱休克蛋白元件直接連接，而不含任何連接肽。融合蛋白及其制法如本文所用，術(shù)語“腫瘤抗原Her2/neu和熱休克蛋白的融合蛋白”、“ Her2/neu-Hsp融合蛋白”與“Hsp_Her2/neu融合蛋白”等可互換使用，都指由腫瘤抗原的氨基酸序列和熱休克蛋白的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在兩者之間可以有或者沒有連接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或沒有起始的甲硫氨酸或信號肽。
編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成，也可用PCR擴(kuò)增或合成的方法獲得腫瘤抗原和或熱休克蛋白70L1的編碼DNA序列，然后將其拼接在一起，形成編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。在獲得了編碼本發(fā)明 新融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的融合蛋白。如本文所用，術(shù)語“載體”包括質(zhì)粒、粘粒、表達(dá)載體、克隆載體、病毒載體等。代表性的狀態(tài)包括(但并不限于)能在真核細(xì)胞如CH0、C0S系列等真核細(xì)胞中表達(dá)的載體，能在釀酒酵母或畢氏酵母中表達(dá)的載體，能在家蠶等昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的載體以及原核表達(dá)載體。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，更佳地是甲醇酵母細(xì)胞。在獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞后，可在適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，從而表達(dá)出融合蛋白?？衫闷湮锢淼?、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。藥物組合物和給藥方式本發(fā)明還提供了一種藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以是治療性的或預(yù)防性的(如疫苗)。本發(fā)明的藥物組合物包括有效量的本發(fā)明的新型融合蛋白、或用該融合蛋白致敏的樹突狀細(xì)胞或用樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。對于含細(xì)胞的組合物，優(yōu)選形式為液態(tài)劑型。
組合物可制成單元或多元劑型。各劑型包含為了產(chǎn)生所期望的治療效應(yīng)而計算出預(yù)定量的活性物質(zhì)，以及合適的藥劑學(xué)賦形劑。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、癌旁、或局部給藥。使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明融合蛋白或相應(yīng)的樹突狀細(xì)胞或T細(xì)胞施用于人，其中該安全有效量通常至少約I微克融合蛋白/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克融合蛋白/千克體重，較佳地該劑量是約I微克-I毫克融合蛋白/千克體重；或者，通常為IO5-IO14細(xì)胞/人/次，更佳地為IO6-IO12細(xì)胞/人/次。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。此外，本發(fā)明的融合蛋白還可與其他治療藥物聯(lián)用，其中包括(但并不限于)各種細(xì)胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各種腫瘤化療藥物，如5_Fu、氨甲蝶呤等影響核酸生物合 成的藥物，氮芥、環(huán)磷酰胺等烷化劑類，阿霉素、放線菌素D等干擾轉(zhuǎn)錄過程阻止RNA合成的藥物，長春新堿、喜樹堿類影響蛋白質(zhì)合成的藥物及某些激素等各類藥物。綜上所述，本發(fā)明的主要優(yōu)點如下(l)Hsp_Her2/neu融合蛋白，既具有Her2/neu的免疫原性,又具有Hsp的免疫佐劑效應(yīng)的作用，是一種具有雙重優(yōu)點的治療腫瘤的新型藥物，因而可以更顯著地誘導(dǎo)出抗原特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。(2)用本發(fā)明融合蛋白致敏的樹突狀細(xì)胞(DC)，可使Her2/neu特異性抗原肽得到有效的識別、加工、處理，并遞呈至體內(nèi)的T細(xì)胞激發(fā)更強(qiáng)的Her2/neu特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。(3)動物試驗表明，本發(fā)明的融合蛋白或疫苗可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長，增加動物存活率，延長存活時間。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。實施例IHer2序列設(shè)計和優(yōu)化根據(jù)Her2核酸序列設(shè)計、合成甲醇酵母密碼子優(yōu)序列SEQ ID NO :1，并在3’端添加Not I酶切位點，序列連接于T載體pUC18(購自Invitrogen公司)，記為pucl8-HER2。該優(yōu)化的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)編碼的Her2/neu胞外區(qū)元件的氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示，長度為115，對應(yīng)于第342-456位。實施例2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建I. Her2342_456 和 Hsp70Ll 的 DNA 片段的獲得以質(zhì)粒pucl8-HER2為模板，以M13R和HSP-HER2-F為引物，得到用于構(gòu)建融合蛋白的編碼 Her2342_456 的 DNA 片段(PCR 產(chǎn)物 A，SEQ ID NO : I)。PCR反應(yīng)中使用的5’端寡核苷酸引物M13R序列為
5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，(SEQ ID NO :3)。3’端寡核苷酸引物HSP-HER2-F序列為5' -CTCTATTGAGATAGCATCTTGTTACGGTTTGGGTATG-3' (SEQ IDNO :4)。同時，收集經(jīng)41°C熱誘導(dǎo)Ih的HeLa細(xì)胞(ATCC Number :CCL_2)，利用細(xì)胞總RNA抽提試劑Trizol (Invitrogen公司)制備細(xì)胞總RNA,利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)合成第一鏈，以其為模板，用序列如下的a -factor和HSP-HER2-R為PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到用于構(gòu)建融合蛋白的編碼Hsp70Ll的DNA片段(PCR產(chǎn)物B，其編碼的氨基酸序列為 SEQ ID NO :8)。PCR反應(yīng)中使用的5’端寡核苷酸引物a-factor序列為5' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3' (SEQ ID NO :5)?！? ’ 端引物 HSP-HER2-R 序列為5' -CATACCCAAACCGTAACAAGATGCTATCTCAATAGAG-3' (SEQ IDNO :6)。反應(yīng)參數(shù)95°C 15秒，53°C 30秒，72°C 40秒，29個循環(huán)后72°C延伸lOmin，產(chǎn)物預(yù)期大小為1527bp，使用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。2.構(gòu)建 pPICZ a -Hsp70Ll-Her2342-456 轉(zhuǎn)化子將上述步驟中獲得的Her2342_456 (PCR產(chǎn)物A)和Hsp70Ll的DNA片段(PCR產(chǎn)物B)作為模板，以a-factor引物(SEQ ID NO :5)和M13R引物(SEQ ID NO. 3)進(jìn)行擴(kuò)增，得到Hsp70Ll-Her2342_456的DNA片段，膠回收后XhoI和NotI雙酶切，同時用XhoI和NotI雙酶切處理pPICZ a A質(zhì)粒(購自Invitrogen公司)，按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌宿主菌DH5 a (Qiagen公司)，挑取陽性克隆，經(jīng)XhoI-NotI酶切鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。經(jīng)測序證實，已插入了所設(shè)計的序列正確的Hsp70Ll-Her2342_456編碼序列，插入位置與讀框也全部正確。重組子記為pPICZ a -Hsp70Ll-Her2342-456o3.構(gòu)建 pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456 轉(zhuǎn)化子將所獲得的pPICZ a -Hsp70Ll_Her2342_456用SacI和BamHI雙酶切，回收片段經(jīng)試劑盒進(jìn)行純化，與SacI和BamHI雙酶切處理的載體pPIC9k (購自Invitrogen公司)按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌宿主菌DH5 a，篩選pPIC9k-HSp70Ll-Her2342_456轉(zhuǎn)化子。經(jīng)SacI-BamHI酶切鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀,BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。經(jīng)測序證實，已插入了所設(shè)計的序列正確的Hsp70Ll-Her2342_456編碼序列，插入位置與讀框也全部正確。重組子記為pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456。圖I為pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342-456 構(gòu)建流程圖。實施例3高表達(dá)Hsp70Ll-Her2342_456工程菌的構(gòu)建及陽性酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定試劑盒(Qiagen公司)大量抽提pPIC9k-Hsp70Ll_Her2342_456質(zhì)粒,用SacI內(nèi)切酶線性化，2. OkV, 25 u F，200 Q的轉(zhuǎn)化條件下電轉(zhuǎn)化至GSl 15感受態(tài)酵母細(xì)胞，獲得酵母轉(zhuǎn)化子。將MD平板上的單克隆分別接種到3ml YTO培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24小時后提取酵母基因組DNA，以a -factor引物(SEQ ID NO 4)和3’ -aox引物(3，-AOX 5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'，(SEQ ID NO :7))，PCR 鑒定酵母轉(zhuǎn)化子。陽性的重組子經(jīng)電泳鑒定。結(jié)果顯示，對于陽性酵母轉(zhuǎn)化子(記為pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456酵母)，獲得了
2.Ik左右的PCR條帶(圖2)，與預(yù)測值相符。其中，該融合蛋白不含連接肽？？。實施例4重組Hsp70Ll-Her2342_456蛋白的表達(dá)、純化及鑒定挑選pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456酵母轉(zhuǎn)化子陽性克隆單菌落，將陽性克隆I、2、4、5、7和10于(圖2)置于裝有25ml BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于30°C，300rpm培養(yǎng)至0D600 = 0. 6 ;室溫下1500rpm離心5min，收集菌體，用IOml BMMY培養(yǎng)基重懸菌體(約 10-20ml)，置于IOOml的搖瓶中，30°C，300rpm搖床繼續(xù)生長；每1211添加100%甲醇至終濃度I. 0%，培養(yǎng)72h后離心，SDS-PAGE法檢測重組蛋白的表達(dá)(圖3，泳道L)。選取表達(dá)量最高的克隆用于后續(xù)的大規(guī)模重組蛋白表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，pPIC9k-Hsp70Ll_Her2342_456陽性酵母轉(zhuǎn)化子菌中可觀察到一條明顯的重組蛋白表達(dá)帶，分子量約為65kD，與預(yù)測的Hsp70Ll-Her2342_456目的蛋白的分子量相符。pPIC9k-Hsp70Ll-Her2342_456陽性酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清加入硫酸銨至終濃度為
I.2M,上樣至phenyl-SepharoseHP柱,采用20mM PB緩沖液洗脫目的蛋白峰。超濾濃縮目的蛋白組分，并將其轉(zhuǎn)移至20mM Tris/HCl (pH8. 0)緩沖液中，進(jìn)行SourceQ陰離子交換柱層析，采用NaCl梯度洗脫目的蛋白，各步驟的純化組分進(jìn)行SDS-PAGE鑒定(圖2，泳道M/N)。純化的重組Hsp70Ll_Her2342_456蛋白的鑒定通過行SDS-PAGE慢速銀染得到Hsp70Ll-Her2342-456融合蛋白凝膠，DTS掃描儀掃描蛋白凝膠，ImageMster軟件對融合蛋白進(jìn)行純度和分子量的計算。按說明書操作用鱟試劑盒檢測重組Hsp70Ll_Her2342_456蛋白的內(nèi)毒素含量。使用無LPS(脂多糖)的注射用水稀釋樣品，LPS標(biāo)準(zhǔn)作為參照。采用Lowery法測定蛋白質(zhì)濃度蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)和待測定蛋白分別用蒸餾水稀釋到0. 5ml，加入2. 5ml新鮮配制的堿性銅溶液(25ml 4%碳酸鈉，25ml 0. 2M氫氧化鈉，0. 04M硫酸銅和0. 5ml 2%酒石酸鉀)，搖勻，置于室溫IOmin ;加入酚試劑0. 25ml，搖勻置于室溫30min,650nm比色。根據(jù)各管的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的蛋白濃度。結(jié)果顯示，純化的重組Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，慢速銀染，顯示單一的蛋白條帶，分子量約65KD，凝膠掃描分析，純化的重組Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白純度>95%。內(nèi)毒素含量小于0. lEU/yg。測定蛋白濃度為0. 5mg/ml。實施例5Her2/neu陽性腫瘤的治療性樹突狀細(xì)胞疫苗的制備I. DC和T淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)取新鮮分離的健康志愿者(HLA-A*0201+)的外周血白細(xì)胞，通過淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Histopaque I. 077)(購于Sigma公司)密度梯度離心分離外周血單個核細(xì)胞。置37°C>5% CO2孵育2小時，貼壁的單核細(xì)胞在含人重組GM-CSF(即粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆刺激因子)(500U/ml)(先靈葆雅公司)和人重組IL-4(白細(xì)胞介素_4) (10ng/ml) (Promega公司)的完全培養(yǎng)基中37°C、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)，獲得外周血單核細(xì)胞來源的DC。非貼壁細(xì)胞用5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮，過尼龍毛柱(37°C孵育I小時)，獲得純化的T淋巴細(xì)胞。2. DC 的致敏收集上述培養(yǎng)至第六天的健康志愿者(HLA-A*0201+)外周血單核細(xì)胞來源的DC，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X IO5細(xì)胞/ml，lml/孔，分入24孔板，分別加入7. 5 y g/mlHsp70Ll-Her2342_456融合蛋白、對照重組Her2342_456蛋白和對照重組Hsp70Ll蛋白，孵育4小時后收集細(xì)胞，洗滌后懸浮在完全培養(yǎng)基中，用于刺激同體的T淋巴細(xì)胞。純化的T淋巴細(xì)胞與致敏的同體DC于37°C、5% CO2條件下共培養(yǎng)(T DC =10 1)，第五天加入20U/ml rhIL-2(重組人白細(xì)胞介素-2) (Sigma公司)，培養(yǎng)7天后收集上述淋巴細(xì)胞，同樣以10 I的比例再與新鮮制備的2X105/ml蛋白致敏的同體DC共培養(yǎng)進(jìn)行第二輪的刺激，共培養(yǎng)7天，并依此法進(jìn)行第三輪的刺激，培養(yǎng)過程中每隔3天加 入一次20U/ml rhIL-2, 2-3天半量更換新鮮培養(yǎng)基。末輪刺激后的7天收集細(xì)胞，使用免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司)陽性選擇分選⑶8+T細(xì)胞，方法嚴(yán)格依照廠商提供的說明書進(jìn)行。實施例6Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)Her2/neu特異性的T淋巴細(xì)胞CTL殺傷試驗采用4小時51Cr釋放法檢測CTL殺傷能力。方法如下用SW620細(xì)胞(Her2/neu+，HLA-A*0201+)、SK-BR-3 細(xì)胞(Her2/neu+，HLA_A*020D、T2 細(xì)胞分別作為靶細(xì)胞。一部分T2細(xì)胞懸浮在200 u I不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，先與10 u g/ml E75 (Her2369_377，KIFGSLAFL,為Her2342_456中所含的一個HLA_A*0201限制性的表位)或無關(guān)肽CAP-I共孵育 60min。加入 200 u Ci 51Cr (Amersham Pharmacia 公司)，置 37°C水浴標(biāo)記 90min,每間隔15min輕混勻一次，然后用培養(yǎng)基徹底洗去殘余的51Cr,用作殺傷的靶細(xì)胞，按10 I、5 1、2. 5 I三個不同效靶比加入相應(yīng)的制備好的效應(yīng)細(xì)胞(分選出的各組⑶8+T細(xì)胞)培養(yǎng)4小時，離心收集各孔上清，用Y計數(shù)儀檢測cpm值。最大釋放組各孔為單獨的靶細(xì)胞加100 ill 0. 1%的NP40(即乙基苯基聚乙二醇)；自發(fā)釋放組為單獨的靶細(xì)胞加完全培養(yǎng)基。各組均設(shè)三個復(fù)孔。殺傷率(％ )=(實驗組cpm-自發(fā)釋放組cpm) X 100/ (最大釋放組cpm-自發(fā)釋放組cpm)結(jié)果顯示如圖4所示。圖4A中，Hsp70Ll_Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞顯示了對SW620細(xì)胞的殺傷活性，而且殺傷能力顯著高于Her2342_456組(P < 0. 05)，而對照組Hsp70Ll組的效應(yīng)細(xì)胞未顯示顯著的殺傷活性(P < 0. 05)。對SK-BR-3細(xì)胞(圖4B)，Hsp70Ll-Her2342_456組及Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞均無明顯的殺傷效應(yīng)，表明以上兩組的效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷是HLA-A*0201限制性的，而對表面遞呈非HLA-A*0201限制性抗原表位的靶細(xì)胞無殺傷作用。對于負(fù)載E75(Her2369_377，KIFGSLAFL)的T2細(xì)胞，結(jié)果(圖4C)顯示其可被Hsp70Ll-Her2342_456組及Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞殺傷，而且前者的殺傷效應(yīng)顯著高于后者(P < 0. 05)，而Hsp70Ll對照組的效應(yīng)細(xì)胞沒有顯著殺傷活性(P < 0. 05)。圖4D顯示所有實驗組的效應(yīng)細(xì)胞均不能殺傷本身不表達(dá)Her2/neu抗原但表達(dá)HLA_A*0201分子的T2細(xì)胞。對于將結(jié)合有無關(guān)肽CAP-I的T2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有實驗組的效應(yīng)細(xì)胞對其均未顯示顯著的殺傷活性(圖4E)，表明效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性只針對Herf/neu抗原。該結(jié)果證明Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏的腫瘤患者外周血單個核細(xì)胞來源的DC體外誘導(dǎo)出了HLA-A*0201限制性的Her2/neu特異性的CTL。實施例7Hsp70Ll-Her2342-456融合蛋白致敏的DC體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性抗腫瘤效應(yīng)I.小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(BMDC)分離頸椎脫位法處死HLA_A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠(The Jackson Laboratory),無菌取股骨，無血清培養(yǎng)基沖洗出骨髓細(xì)胞，溶除紅細(xì)胞，加入抗Ia、B220、⑶4、⑶8單抗(終濃度均為IOy g/ml)及補(bǔ)體(10 I稀釋)，37°C水浴45min溶除T、B及Ia+細(xì)胞，隨后加IOng/ml mGM-CSF (Promega公司)、lng/ml mIL_4 (Promega公司)培養(yǎng)3天后，貼壁細(xì)胞重新加入新鮮完全培養(yǎng)基及mGM-CSF、mIL-4繼續(xù)培養(yǎng)3天后，吹打收集疏松貼壁的增殖性細(xì)胞聚集·體置新瓶培養(yǎng)，3天后收集懸浮細(xì)胞即為富集的BMDC。2.蛋白體外致敏BMDC上述培養(yǎng)至第六天的小鼠DC，分別加入7. 5 ii g/ml Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白、對照重組Her2342_456蛋白和對照重組Hsp70Ll蛋白，并設(shè)置未刺激的DC作為空白對照組，孵育4小時后收集細(xì)胞,用于免疫小鼠。3. HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫以蛋白體外致敏的HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠的BMDC對同系小鼠進(jìn)行免疫。每只小鼠后腿皮下注射I X IO6經(jīng)7. 5 y g/ml蛋白致敏的同系小鼠的BMDC或未未經(jīng)任何因素致敏的同系小鼠的BMDC。每只小鼠共免疫三次，間隔一周。4. CTL殺傷試驗以上每組免疫小鼠的脾細(xì)胞加入7. 5 ii g/ml的重組Her2342_456蛋白作為抗原進(jìn)行再刺激，補(bǔ)加25U/ml IL-2，培養(yǎng)7-9天，用作CTL測試其殺傷靶細(xì)胞的能力。靶細(xì)胞同實施例6。51Cr釋放法檢測CTL殺傷能力同實施例6。5.結(jié)果結(jié)果顯示如圖5所示。來自Hsp70L 1-Her2342_456組及Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞顯示了對SW620細(xì)胞的顯著殺傷(圖5A)，而且Hsp70Ll-Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞殺傷SW620的能力明顯高于Her2342_45f^i(P < 0. 05)，而另兩個對照組包括Hsp70Ll組、未致敏的DC免疫組的效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞SW620沒有明顯殺傷活性。對于負(fù)載E75 (Her2369_377，KIFGSLAFL)的T2細(xì)胞，結(jié)果(圖5B)發(fā)現(xiàn)Hsp70Ll-Her2342_456組及Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞對E75致敏的T2細(xì)胞具有殺傷活性，而且前者的殺傷效應(yīng)明顯高于后者(P < 0. 05)，而另兩個對照組包括Hsp70Ll組、未致敏DC免疫組的效應(yīng)細(xì)胞對負(fù)載E75的T2細(xì)胞沒有明顯殺傷活性。對于SK-BR-3細(xì)胞，結(jié)果(圖5C)顯示Hsp70Ll-Her2342_456組及單獨的Her2342_456組的效應(yīng)細(xì)胞對SK-BR-3細(xì)胞均無明顯的殺傷效應(yīng)，表明以上兩免疫組的效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷是HLA-A*0201限制性的，而對表面遞呈非HLA-A*0201限制性抗原表位的靶細(xì)胞無殺傷作用。圖顯示，所有實驗組的效應(yīng)細(xì)胞均不能殺傷T2細(xì)胞。上述結(jié)果表明效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性只針對Her2/neu抗原，說明Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白致敏的DC免疫HLA_A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)其產(chǎn)生了 Her2/neu特異性的CTL。實施例8
裸鼠荷瘤及過繼回輸治療效果的觀察6-8周齡的雌性裸鼠(購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心)，右側(cè)腹部皮下一點接種體外培養(yǎng)擴(kuò)增的SW620腫瘤細(xì)胞。三天后進(jìn)行過繼回輸治療。分組同實施例7中免疫HLA-A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，另外設(shè)置單獨腹腔注射IL-2的對照組。如前述經(jīng)體外抗原再刺激7-9天后的免疫小鼠的脾細(xì)胞收集后尾靜脈回輸至荷瘤裸鼠體內(nèi)，回輸后第二天腹腔注射IL-2 2000U，以后隔天同樣方法注射同樣劑量的IL-2，第一次回輸后7天進(jìn)行第二次回輸，方法相同。接種腫瘤細(xì)胞后每隔兩天觀察腫瘤出現(xiàn)及生長情況。記錄各鼠腫瘤出現(xiàn)的時間，測量腫瘤的直徑，觀察各組小鼠的存活情況。結(jié)果顯示，Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏的DC免疫的HLA_A*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞過繼回輸至負(fù)荷SW620腫瘤的裸鼠，可以顯著抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長，而且提高了小鼠的存活率。如圖6，回輸Hsp70Ll-Her2342_456組小鼠脾細(xì)胞的裸鼠，腫瘤出現(xiàn)時間明顯晚于其它幾個對照組(P<0. 05)。觀察至第22天時，此組中出現(xiàn)腫瘤生長的小鼠的腫瘤平均直徑明顯的低于各個對照組小鼠的腫瘤平均直徑(P < 0. 05)。由圖7可見，幾個對 照組裸鼠在荷瘤第25天至第50天之間全部死亡，而在第50天過繼回輸Hsp70Ll-Her2342_456組小鼠脾細(xì)胞的裸鼠存活率為25 %，觀察至第90天此組中小鼠的存活率仍為25 %，且存活的小鼠體內(nèi)均未觀察到有腫瘤生長。實施例9Hsp70Ll-Her2341_456融合蛋白誘導(dǎo)特異性的T淋巴細(xì)胞CTL殺傷實驗重復(fù)實施例1-6,不同點在于，Her2/neu元件采用腫瘤抗原Her2/neu的341-456位的片段，從而制得Hsp70Ll-Her2341_456融合蛋白。結(jié)果表明，該融合蛋白也可誘導(dǎo)Her2/neu特異性的T淋巴細(xì)胞CTL殺傷。實施例10含連接肽的Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞CTL殺傷實驗重復(fù)實施例1-6,不同點在于,在Her2/neu元件與HSP元件之間存在因酶切位點引入的長度為2個殘基的連接肽，從而制得Hsp70Ll-L2-Her2342_456融合蛋白。結(jié)果表明，該融合蛋白也可誘導(dǎo)Her2/neu特異性的T淋巴細(xì)胞CTL殺傷。實施例11含Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白致敏的DC的藥物組合物重復(fù)實施例7，不同點在于，用人的DC細(xì)胞替換小鼠DC細(xì)胞。并且，將經(jīng)Hsp70Ll-Her2342_456融合蛋白致敏的人樹突狀細(xì)胞置于生理鹽水中，制成藥物組合物，為注射劑劑型。實施例12含Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白的藥物組合物將實施例4中制備的Hsp70Ll_Her2342_456融合蛋白進(jìn)行凍干處理，制得藥物組合物，為凍干劑型。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，它包括 (a)腫瘤抗原Her2-neu元件,該元件具有人腫瘤抗原Her2_neu的胞外區(qū)或其免疫原性片段的氨基酸序列； (b)熱休克蛋白元件，該元件具有人熱休克蛋白或其活性片段的氨基酸序列；以及 (c)任選的位于腫瘤抗原Her2-neu元件和熱休克蛋白元件之間的連接肽序列。
2.如權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述腫瘤抗原Her2-neu元件為含腫瘤抗原Her2-neu的342-456位的片段；和/或 所述的熱休克蛋白元件選自下組Hsp70或Hsp70Ll。
3.如權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述的熱休克蛋白元件具有SEQIDNO 8所示的氨基酸序列,所述的腫瘤抗原Her2-neu元件具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
4.一種分離的DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求I所述的融合蛋白。
5.—種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的DNA分子。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求5所述的載體或染色體中整合有權(quán)利要求4所述的DNA分子。
7.—種產(chǎn)生權(quán)利要求I所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步驟 在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的融合蛋白；和 分離所述的融合蛋白。
8.權(quán)利要求I所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備治療Her2-neU陽性腫瘤的治療性疫苗藥物。
9.一種樹突狀細(xì)胞，其特征在于，它是用權(quán)利要求I所述的融合蛋白致敏過的樹突狀細(xì)胞。
10.一種Her2-neu陽性腫瘤治療性疫苗，其特征在于，它含有安全有效量權(quán)利要求9所述的樹突狀細(xì)胞或用所述樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞或權(quán)利要求I所述的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種Her2-neu抗原陽性腫瘤治療性疫苗的制備及應(yīng)用。具體的，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，該融合蛋白含有(a)腫瘤抗原Her2-neu胞外區(qū)元件和(b)熱休克蛋白元件。本發(fā)明還提供用所述融合蛋白致敏的樹突狀細(xì)胞以及相應(yīng)的腫瘤治療性疫苗。試驗表明，體內(nèi)應(yīng)用本發(fā)明疫苗可以有效激發(fā)Her2-neu抗原特異性的免疫應(yīng)答，有效地應(yīng)用于Her2-neu陽性腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK102838679SQ20111017252
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者吳艷峰, 萬濤, 曹雪濤 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)