專利名稱：預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物預(yù)防醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種預(yù)防動物疫病發(fā)生的注射液的制備方法。
背景技術(shù)：
鴨出血性卵巢炎(鴨黃病毒病)是由黃病毒屬坦布蘇病毒(Tembusu virus, TMUV)，引起種鴨和蛋鴨的急性傳染病，以突發(fā)產(chǎn)蛋急劇下降為特點(diǎn)，因該病主要導(dǎo)致卵泡變性、變形，卵泡膜充血、出血，暫將該病稱為鴨出血性卵巢炎，涉及面廣、發(fā)病率高、死亡率 5% _30%，病鴨發(fā)熱，精神欠佳，草綠色下痢，站立不穩(wěn)，雙腿癱瘓、向后或側(cè)面伸展；病變主要見于卵巢，表現(xiàn)為卵巢發(fā)育不良，卵泡變性、變形，卵泡膜充血、出血，子宮及輸卵管黏膜未見異常，部分病例可見卵黃性腹膜炎報(bào)道[曹貞貞，張存，黃瑜等。鴨出血性卵巢炎的初步研究。中國獸醫(yī)雜志2010年(第46卷)第12期3-7]。給飼養(yǎng)鴨禽的單位或個人帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失，同時，由于對病亡的鴨禽處理不當(dāng)，往往造成病毒的漫延，產(chǎn)生更大的惡果。目前，社會上尚未發(fā)現(xiàn)一種高效專用于預(yù)防鴨坦布蘇病毒疫病的有效藥物，這是鴨禽飼養(yǎng)單位或個人最感頭痛的事。本發(fā)明的目的是提供一種安全性好、無副作用、保護(hù)率高、保護(hù)期長、產(chǎn)生作用時間短、使用方便的防鴨坦布蘇病毒注射液及制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨黃病毒屬_坦布蘇病毒 (Tembusu virus, TMUV)病，以下簡稱“鴨出血性卵巢炎或鴨坦布蘇病毒病”)的蜂膠注射液， 該注射液對鴨出血性卵巢炎具有較好的預(yù)防效果。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
所述所述預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液由蜂膠水溶液、接種鴨黃病毒屬_坦布蘇病毒并感染后死亡的鴨胚勻漿組織和滅活液組成，所述蜂膠水溶液、鴨胚勻漿組織的重量比為8-9 1-2，所述蜂膠水溶液為體積分?jǐn)?shù)為0. 1-2% ；所述滅活劑為青霉素、鏈霉素和福爾馬林液，預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含有2000單位的青霉素和2000單位的鏈霉素，所述福爾馬林在預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中體積分?jǐn)?shù)為0. 4%。本發(fā)明的目的之二在于提供一種預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法， 該方法操作簡單，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法，具體包括以下步驟a將接種鴨黃病毒屬_坦布蘇病毒(Tembusu virus, TMUV)種毒并感染死亡后鴨胚制成鴨胚勻漿組織，與蜂膠及水介質(zhì)混合均勻，得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液，所述鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中蜂膠與水介質(zhì)組成體積濃度為0. 1-2%的蜂膠水溶液，所述蜂膠水溶液與鴨胚勻漿組織的體積比為8-9:1-2 ；b在步驟a所得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中加入滅活液，使所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，及體積分?jǐn)?shù)為0.4%的福爾馬林液，37-39°C滅活，得預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液。進(jìn)一步，所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法，所述鴨黃病毒屬-坦布蘇病毒(Tembusu virus, TMUV)種毒具體為
a在無菌條件下取因患鴨出血性卵巢炎死亡的鴨內(nèi)臟，放入組織搗碎機(jī)中搗碎； b取占總量為10-20%的被搗碎的鴨組織與占總重量為80-90%的濃度為0.8 %的生理鹽水混合，形成混合組織懸液；
c將混合組織懸液放入離心機(jī)中，在離心20-40分鐘后取其上清液； d在其上清液中，按每毫升上清液各加入2000單位青霉素和2000單位鏈霉素的配比加入青霉素和鏈霉素，得鴨黃病毒病種毒。進(jìn)一步，所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法，步驟a中所述死亡的鴨內(nèi)臟為卵巢、心、肝、脾、肺和腦中任一種或多種。進(jìn)一步，所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法，所述鴨黃病毒屬-坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)種毒接種于9_12日齡的鴨胚尿囊中的劑量為 0. lmL。進(jìn)一步，所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎蜂膠注射液每毫升含2000單位青霉素和 2000單位鏈霉素，并按總量的0. 4%的配比加入福爾馬林液，37-39°C滅活24小時。用本發(fā)明所述制備方法制成的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液對于預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨坦布蘇病毒病)具有顯著效果，保護(hù)率提高到90-100%，保護(hù)期延長到6-12 個月，產(chǎn)生作用時間縮短到5天，僅需一次注射即可達(dá)到預(yù)期效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
在無菌條件下取因患鴨出血性卵巢炎死亡的鴨內(nèi)臟(包括心、肝、脾、肺、腦和卵巢)放入組織搗碎機(jī)中搗碎，取占總重量的10%的被搗碎的鴨組織，占總重量的90%濃度為0. 8 %的生理鹽水混合，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中在4 000轉(zhuǎn)/分條件下離心 20分鐘，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2 000單位青霉素和2 000單位鏈霉素后即形成鴨出血性卵巢炎種毒。將鴨出血性卵巢炎種毒放入濃度為0. 8%的生理鹽水中稀釋100倍，形成鴨黃病毒屬-坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)種毒稀釋液，用 0.1毫升劑量的鴨坦布蘇種毒稀釋液接種于9日齡的鴨胚尿囊中，接種后選取在48小時出血、水腫等特征死亡的鴨胚，放入組織搗碎機(jī)中搗碎，得鴨勻漿組織，以重量份計(jì)取10份的鴨勻漿組織與90份的蜂膠水溶液混合，蜂膠終濃度達(dá)到0. 1 %，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中，在4000轉(zhuǎn)/分條件下離心20分鐘后，取其上清液，即鴨胚勻漿組織蜂膠混合液，在所得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中加入滅活液，使預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，及體積分?jǐn)?shù)為0. 4%的福爾馬林液， 37-39°C滅活，得預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨坦布蘇病毒病)的蜂膠注射液。實(shí)施例2在無菌條件下取因患鴨出血性卵巢炎死亡的鴨內(nèi)臟(包括心、肝、脾、肺、腦和卵巢) 放入組織搗碎機(jī)中搗碎，取占總重量的15%的被搗碎的鴨組織，占總重量的85%濃度為 0.8%的生理鹽水混合，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中在4000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2 000單位青霉素和2 000 單位鏈霉素后即形成鴨病毒性卵巢炎種毒。將鴨病毒性卵巢炎種毒放入濃度為0. 8 %的生理鹽水中稀釋100倍，形成鴨出血性卵巢炎種毒稀釋液，用0. 1毫升劑量的鴨出血性卵巢炎稀釋液接種于11日齡的鴨胚尿囊中，接種后選取在80小時出血、水腫等特征死亡的鴨胚放入組織搗碎機(jī)中搗碎，得鴨勻漿組織，以重量份計(jì)取15份的鴨勻漿組織與85份的蜂膠水溶液混合，蜂膠終濃度達(dá)到2%，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中，在4 000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘后，取其上清液，即鴨胚勻漿組織蜂膠混合液，在所得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中加入滅活液，使預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，及體積分?jǐn)?shù)為0. 4%的福爾馬林液，37-39°C滅活，得預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨坦布蘇病毒病)的蜂膠注射液。實(shí)施例3
在無菌條件下取因患鴨出血性卵巢炎死亡的鴨內(nèi)臟(包括心、肝、脾、肺、腦和卵巢) 放入組織搗碎機(jī)中搗碎，取占總重量的20%的被搗碎的鴨組織，占總重量的80%濃度為 0.8%的生理鹽水混合，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中在4 000轉(zhuǎn)/分條件下離心20分鐘，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000單位青霉素和2000單位鏈霉素后即形成鴨黃病毒病種毒。將鴨黃病毒病種毒放入濃度為0. 8%的生理鹽水中稀釋 100倍，形成鴨黃病毒病種毒稀釋液，用0. 1毫升劑量的鴨黃病毒病種毒稀釋液接種于12日齡的鴨胚尿囊中，接種后選取在48小時出血、水腫等特征死亡的鴨胚放入組織搗碎機(jī)中搗碎，得鴨勻漿組織，以重量份計(jì)取20份的鴨勻漿組織與80份蜂膠水溶液混合，蜂膠終濃度達(dá)到1%，形成混合組織懸液，并其放入離心機(jī)中，在4 000轉(zhuǎn)/分條件下離心40分鐘后，取其上清液，即鴨胚勻漿組織蜂膠混合液，在所得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中加入滅活液，使預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，及體積分?jǐn)?shù)為0.4%的福爾馬林液，37-39°C滅活，得預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨坦布蘇病毒病)的蜂膠注射液。實(shí)施例4
在無菌條件下取因患鴨出血性卵巢炎死亡的鴨內(nèi)臟(包括心、肝、脾、肺、腦和卵巢) 放入組織搗碎機(jī)中搗碎，取占總重量的15%的被搗碎的鴨組織，占總重量的85%濃度為 0.8%的生理鹽水混合，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中在4000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000單位青霉素和2 000單位鏈霉素后即形成鴨出血性卵巢炎種毒。將鴨出血性卵巢炎種毒放入濃度為0. 8%的生理鹽水中稀釋100倍，形成鴨出血性卵巢炎種毒稀釋液，用0. 1毫升劑量的鴨出血性卵巢炎種毒稀釋液接種于11日齡的鴨胚尿囊中，接種后選取在80小時出血、水腫等特征死亡的鴨胚放入組織搗碎機(jī)中搗碎，得鴨勻漿組織，以重量份計(jì)取15份的鴨勻漿組織與85份水介質(zhì)混合，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中，在4000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘后，取其上清液，即鴨胚勻漿組織蜂膠混合液，在所得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中加入滅活液，使預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，及體積分?jǐn)?shù)為0.4%的福爾馬林液，37-39°C滅活，得預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨坦布蘇病毒病)的蜂膠注射液。實(shí)施例5
在無菌條件下取因患鴨出血性卵巢炎死亡的鴨內(nèi)臟(包括心、肝、脾、肺、腦、卵巢) 放入組織搗碎機(jī)中搗碎，取占總重量的15%的被搗碎的鴨組織，占總重量的85%濃度為 0.8%的生理鹽水混合，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中在4000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2 000單位青霉素和2 000 單位鏈霉素后即形成鴨黃病毒病種毒。將鴨黃病毒種毒放入濃度為0. 8%的生理鹽水中稀釋100倍，形成鴨黃病毒病種毒稀釋液，用0. 1毫升劑量的鴨黃病毒病種毒稀釋液接種于 11日齡的鴨胚尿囊中，接種后選取在80小時出血、水腫等特征死亡的鴨胚放入組織搗碎機(jī)中搗碎，得鴨勻漿組織，以重量份計(jì)取15份的鴨勻漿組織與85份蜂膠水溶液混合，蜂膠終濃度達(dá)到3%，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中，在4000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘后，取其上清液，即鴨胚勻漿組織蜂膠混合液，在所得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中加入滅活液，使預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，及體積分?jǐn)?shù)為0.4%的福爾馬林液，37-39°C滅活，得預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨坦布蘇病毒病)的蜂膠注射液。實(shí)施例6
在無菌條件下取因患鴨出血性卵巢炎死亡的鴨內(nèi)臟(包括心、肝、脾、肺、腦、卵巢) 放入組織搗碎機(jī)中搗碎，取占總重量的15%的被搗碎的鴨組織，占總重量的85%濃度為 0.8%的生理鹽水混合，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中在4000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，取其上清液，在上清液中按每毫升上清液各加入2000單位青霉素和2 000單位鏈霉素后即形成鴨黃病毒病種毒。將鴨黃病毒種毒放入濃度為0. 8%的生理鹽水中稀釋 100倍，形成鴨黃病毒病種毒稀釋液，用0. 1毫升劑量的鴨黃病毒病種毒稀釋液接種于11日齡的鴨胚尿囊中，接種后選取在80小時出血、水腫等特征死亡的鴨胚放入組織搗碎機(jī)中搗碎，得鴨勻漿組織，以重量份計(jì)取15份的鴨勻漿組織與85份白油乳化液混合，白油乳化液終濃度達(dá)到2%，形成混合組織懸液，并將其放入離心機(jī)中，在4000轉(zhuǎn)/分條件下離心30 分鐘后，取其上清液，即鴨胚勻漿組織蜂膠混合液，在所得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中加入滅活液，使預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，及體積分?jǐn)?shù)為0.4%的福爾馬林液，37-39°C滅活，得預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨坦布蘇病毒病)的蜂膠注射液。實(shí)施例7鴨出血性卵巢炎的檢測
取實(shí)施例1-6中的勻漿組織用TRIzol Reagent RNA提取試劑盒進(jìn)行病毒RNA的提取，應(yīng)用RT-PCR的方法進(jìn)行鴨病毒的檢測萬春和，施少華，程龍飛，陳紅梅，傅光華，彭春香，林芳，林建生，黃瑜。鴨出血性卵巢炎病毒RT-PCR檢測方法的建立。福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2011，1:10-12，檢測結(jié)果均為陽性。實(shí)施例8無菌檢測
取實(shí)施例1-6制備的注射液分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基和血瓊脂平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)24 小時，按常規(guī)方法觀察，雜菌檢測為陰性。實(shí)施例9安全試驗(yàn)選用未免疫的11日齡的肉鴨中，每組10只，按實(shí)施例1-6制備的注射液劃分，6組和生理鹽水空白組，共計(jì)7組；每只注射lmL，隔離飼養(yǎng)15天，每日作體溫、呼吸、精神、食欲、糞便、等臨床觀測，注射上述疫苗后，免疫注射組均未引起疫苗發(fā)病與死亡，注射部位未見明顯的病理變化，無不良反應(yīng)，精神、食欲佳。實(shí)施例10抗體檢測
選用未免疫的11日齡的肉鴨中，每組10只，按實(shí)施例1-6制備的注射液劃分，6組和生理鹽水空白組，共計(jì)7組；
檢測方法間接ELISA檢測方法。結(jié)果詳見表1。
權(quán)利要求
1.預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液，其特征在于，所述預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液由蜂膠水溶液、接種鴨黃病毒屬-坦布蘇病毒并感染后死亡的鴨胚勻漿組織和滅活液組成，所述蜂膠水溶液、鴨胚勻漿組織的重量比為8-9 :1_2，所述蜂膠水溶液為體積分?jǐn)?shù)為0. 1-2%;所述滅活劑為青霉素、鏈霉素和福爾馬林液，預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含有2000單位的青霉素和2000單位的鏈霉素，所述福爾馬林在預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中體積分?jǐn)?shù)為0. 4%。
2.權(quán)利要求1所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟a將接種鴨黃病毒屬_坦布蘇病毒種毒并感染死亡后鴨胚制成鴨胚勻漿組織，與蜂膠及水介質(zhì)混合均勻，得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液，所述鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中蜂膠與水介質(zhì)組成體積濃度為0. 1-2%的蜂膠水溶液，所述蜂膠水溶液與鴨胚勻漿組織的體積比為 8-9:1-2;b在步驟a所得鴨胚勻漿組織蜂膠混合液中加入滅活液，使所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液中每毫升含2000單位青霉素和2000單位鏈霉素，及體積分?jǐn)?shù)為0.4%的福爾馬林液，37-39°C滅活，得預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法，其特征在于，所述鴨黃病毒-坦布蘇病毒病種毒具體為a在無菌條件下取因患鴨出血性卵巢炎死亡的鴨內(nèi)臟，放入組織搗碎機(jī)中搗碎；b取占總量為10-20%的被搗碎的鴨組織與占總重量為80-90%的濃度為0.8 %的生理鹽水混合，形成混合組織懸液；c將混合組織懸液放入離心機(jī)中，在離心20-40分鐘后取其上清液；d在其上清液中，按每毫升上清液各加入2000單位青霉素和2000單位鏈霉素的配比加入青霉素和鏈霉素，得鴨黃病毒_坦布蘇病毒病種毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法，其特征在于，步驟a中所述死亡的鴨內(nèi)臟為心、肝、脾、肺、卵巢和腦中任一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液的制備方法，其特征在于所述鴨黃病毒-坦布蘇病毒種毒接種于9-12日齡的鴨胚尿囊中的劑量為0. lmL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種動物預(yù)防醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種預(yù)防動物疫病發(fā)生的注射液的制備方法，所述預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液由蜂膠水溶液、接種鴨黃病毒屬-坦布蘇病毒并感染后死亡的鴨胚勻漿組織和滅活液組成；其制備方法為在鴨胚勻漿組織蜂膠混合液加入滅活液，得鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液；用本發(fā)明所述制備方法制成的預(yù)防鴨出血性卵巢炎的蜂膠注射液對于預(yù)防鴨出血性卵巢炎(鴨坦布蘇病毒病)具有顯著效果，保護(hù)率提高到90-100％，保護(hù)期延長到6-12個月，產(chǎn)生作用時間縮短到5天，僅需一次注射即可達(dá)到預(yù)期效果。
文檔編號A61P15/00GK102228482SQ20111017713
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者付利芝, 劉作華, 彭祥偉, 殷素會, 粟劍 申請人:重慶市畜牧科學(xué)院