專利名稱：貓人參提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥貓人參提取物，以及該貓人參提取物的制備方法和醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
目前，包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤作為常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類的健康。世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，1990年全世界腫瘤所致死亡數(shù)占總死亡數(shù)的12. 3%，預(yù)計2015年將達(dá)到14.6%。據(jù)美國國立癌癥研究院(NationalCancer Institute)數(shù)據(jù)1998 2002年惡性腫瘤發(fā)病率為469. 7/10萬，家庭、國家及社會為此付出的代價沉重。在惡性腫瘤的多種治療方法中，化療在臨床上發(fā)揮著重要的作用。目前，從中藥、天然藥物中開發(fā)抗腫瘤藥物已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要方向。 中藥貓人參為稱猴桃科植物對萼稱猴桃(Actinidia valvata Dunn)的根和老莖，主要分布于浙江、江西、江蘇等華東地區(qū)，臨床用于治療惡性腫瘤，為華東地區(qū)常用抗腫瘤中藥。目前，僅見少量關(guān)于貓人參化學(xué)成分、藥理作用方面的研究報道[張亞妮，劉嶺，凌昌全.貓人參有效部位對小鼠移植性腫瘤H22的抑制作用及機制探討.中國中藥雜志，2006，36(11) :918-920;陸胤，陳紹瑗，吳平，等.藥用植物貓人參有效成分研究(I)-無機元素分析.浙江大學(xué)學(xué)報，2004，30 (2) =185-188 ;辛海量，吳迎春，徐燕豐，等.對萼獼猴桃根與莖的比較研究.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29 (3) :298-302]。目前，未見有葡聚糖凝膠柱色譜技術(shù)用于制備總皂苷含量高的貓人參提取物的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供ー種總皂苷含量高的貓人參提取物，并提出其制備方法和醫(yī)藥用途。對于中藥提取物的制備而言，簡便、快速、高效的脫色、除雜、純化方法至關(guān)重要，也是中藥提取物制備エ藝中的瓶頸問題。本發(fā)明人長期從事中藥化學(xué)、制備エ藝以及抗腫瘤中藥新藥等方面的研究工作，在貓人參提取物的制備過程中，曾嘗試采用多種除雜脫色エ藝路線，結(jié)果表明不僅エ藝步驟繁瑣，而且效果也不盡理想。最終經(jīng)反復(fù)篩選優(yōu)化，采用活性炭和活性白土混合脫色劑對粗提物進(jìn)行除雜脫色，再用葡聚糖凝膠色譜對脫色后產(chǎn)物進(jìn)行純化，取得了很好的效果，非常便于生產(chǎn)應(yīng)用。本發(fā)明貓人參提取物的有效組分主要為三萜皂苷類成分，包括科羅索酸、2 α，3 β，24-三羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸、2 α，3 α，24-三羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸和2 α，3α ,19α ,24-四羥基烏蘇烷_12_烯_28_酸等，總皂苷占提取物的質(zhì)量百分含量為40% 75%。本發(fā)明提供的貓人參提取物的制備方法，主要包括藥材提取、除雜脫色、分離純化エ序，具體說明如下
(I)藥材提取將干燥、粉碎后的中藥貓人參藥材，以體積濃度為50% 95%こ醇或甲醇水溶液，用回流或滲漉方法進(jìn)行提取，提取液合井，回收濃縮至無醇味，得濃縮液；將上述濃縮液放冷，離心，分取沉淀；本步驟還可選用體積濃度為70% 95%こ醇或甲醇水溶液進(jìn)行，優(yōu)選體積濃度為80%こ醇或甲醇水溶液。考慮到可能的有機溶劑殘留、生產(chǎn)中的安全因素以及成本因素，こ醇水溶液為首選。(2)除雜脫色將步驟(I)制得的沉淀以體積濃度為50% 100%こ醇或甲醇水溶液溶解，加入脫色劑除雜脫色，脫色液濃縮至近干，得除雜脫色后產(chǎn)物。本步驟溶解沉淀還可選用體積濃度為70% 100%こ醇或甲醇水溶液，優(yōu)選體積濃度為100%こ醇或甲醇水溶液。本步驟脫色劑可選用活性碳，或活性白土，或兩者的混合物。優(yōu)選活性炭與活性 白土之比為10 : I I : 20(重量比)的混合脫色剤，最優(yōu)選活性炭與活性白土之比為I 10 (重量比)的混合脫色剤。本步驟脫色劑的用量脫色劑與藥材重量比為25% 200%，優(yōu)選25% 100%，最優(yōu)選50 %。(3)分離純化將(2)中制得的除雜脫色后產(chǎn)物用體積濃度為50% 95%こ醇或甲醇水溶液溶解，上葡聚糖凝膠色譜柱，先用體積濃度為5% 25%こ醇或甲醇水溶液洗脫至近無色，再用體積濃度為70% 100%こ醇或甲醇水溶液洗脫皂苷類成分，收集洗脫液，濃縮，干燥，粉碎，即得貓人參提取物。本步驟溶解除雜脫色后產(chǎn)物還可選用體積濃度為70% 95%こ醇或甲醇水溶液，優(yōu)選體積濃度為80%こ醇或甲醇水溶液。本步驟優(yōu)選Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜柱進(jìn)行分離純化,先選用體積濃度為10% 25%こ醇或甲醇水溶液洗脫至近無色，優(yōu)選20%こ醇或甲醇水溶液；選用體積濃度為70% 100%こ醇或甲醇水溶液洗脫皂苷類成分，優(yōu)選100%こ醇或甲醇?？紤]到可能的有機溶劑殘留、生產(chǎn)中的安全因素以及成本因素，こ醇水溶液為首選。本步驟應(yīng)用葡聚糖凝膠脫色對于貓人參提取物的制備至關(guān)重要，若不采用葡聚糖凝膠純化，盡管提取物的得率得以提高，但是提取物的總皂苷含量將會大大降低，以至于總皂苷含量降低到50%以下，大大降低了提取物的品質(zhì)(詳見實施例7)，根據(jù)SFDA頒布的《藥品注冊管理辦法》，總皂苷含量降低到50%以下吋，就不能作為有效部位申報新藥。這正是本發(fā)明提取物制備エ藝中采用葡聚糖凝膠純化步驟的創(chuàng)造性意義。本發(fā)明采用紫外-可見分光光度法對貓人參提取物的總皂苷含量進(jìn)行測定，提取物中単體成分的鑒定采用1Hnmr^3Cnmr進(jìn)行分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。隨后的實施例將證明，采用本發(fā)明前述制備エ藝，最終可得到總皂苷質(zhì)量百分含量為60% 75%的貓人參提取物，其有效組分主要為三萜皂苷類成分，主要包括科羅索酸、2 α，3 β , 24- ニ輕基烏蘇燒-12-稀-28-酸、2 α，3 α，24- ニ輕基烏蘇燒-12-稀-28-酸和2 α，3 α，19 α，24-四羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸等。本發(fā)明貓人參提取物的制備方法具有エ藝簡便，成本低廉，安全有效，無有機溶劑殘留等優(yōu)點，經(jīng)藥理實驗證明具有較強的抗腫瘤作用，因而可用于制備抗腫瘤藥物。鑒于現(xiàn)代社會中惡性腫瘤發(fā)病率的急劇上升，從中藥、天然藥物中開發(fā)抗腫瘤藥物已經(jīng)成為抗腫瘤新藥研發(fā)的重要方向，本發(fā)明提取物具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為貓人參提取物的高效液相色譜(HPLC)圖。圖2為貓人參提取物的體外抗腫瘤實驗量效關(guān)系曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。這些實施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。本發(fā)明以下實施例中，こ醇、甲醇的濃度均為體積濃度。
實施例I (制備貓人參提取物)貓人參藥材粗粉1kg，以80%こ醇水溶液，10倍、8倍、8倍，2小吋、I. 5小吋、I. 5
小時，回流提取，提取液趁熱過濾，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，蒸餾水調(diào)節(jié)濃度為Ig (生藥)/ml,5000rpm,離心15分鐘，分取沉淀，以適量無水こ醇溶解,補加至10000ml。加入混合脫色劑(活性炭活性白土= I 10)500g除雜脫色，加熱至70°C，保持恒溫I小吋，濾過，濾過液減壓濃縮至近干，用80%こ醇溶解樣品，毎次取40ml上S印hadex LH-20葡聚糖凝膠柱，20%こ醇水溶液洗脫至近無色，用100%こ醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，粉碎，得提取物6. 43g，外觀極淡黃色。按照參考文獻(xiàn)(何正有，張藝，張旭，等.分光光度法測定藏藥翼首草中總皂苷的含量.華西藥學(xué)雜志，2002，17 (I) 43-45)方法進(jìn)行總皂苷含量測定，提取物總皂苷含量以熊果酸計74. 05%。對提取物進(jìn)行HPLC分析，HPLC色譜圖見圖I。分析條件島灃LC-20AD高效液相色譜儀(四元低壓梯度洗脫系統(tǒng)，ELSD檢測器)，色譜柱Shim-packCLC-ODS色譜柱(4. 6mmX 25mm, 5 μ m);保護(hù)柱DIKMA Easy Guard C18 (IOmmX 4. 6mm),流動相A:こ臆，B 0. 5%醋酸水溶液，梯度洗脫0 60min，流動相A :45% 60%。流速1. Oml/min，柱溫25°c。經(jīng)與對照品比對，采用1Hnmi^13Cnmr進(jìn)行鑒定，色譜圖中色譜峰ι，4，6，7代表的化合物分別為2 α，3α，19α，24_四羥基烏蘇烷_12_烯_28_酸，2 α，3 α，24-三羥基烏蘇燒-12-稀-28-酸,2 α , 3 β , 24- ニ輕基烏蘇燒-12-稀-28-酸以及科羅索酸。實施例2 (制備貓人參提取物)貓人參藥材粗粉1kg，以95%こ醇水溶液作為提取溶劑，其余同實施例1，得提取物5. 12g，產(chǎn)品外觀淡黃色，總皂苷含量以熊果酸計66. 80%。 實施例3 (制備貓人參提取物)貓人參藥材粗粉1kg，以60%こ醇水溶液作為提取溶劑，其余同實施例1，得提取物4. 23g，產(chǎn)品外觀淡黃色，總皂苷含量以熊果酸計51. 52%。實施例4 (制備貓人參提取物)貓人參藥材粗粉lkg，混合脫色劑用量2000g (活性炭活性白土= I 10)，其余同實施例1，得提取物2. 90g，產(chǎn)品外觀淡黃色，總皂苷含量以熊果酸計40. 22%。實施例5 (制備貓人參提取物)
貓人參藥材粗粉1kg，混合脫色劑用量IOOOg(活性炭活性白土= I 5)，其余同實施例1，得提取物3. 48g，產(chǎn)品外觀淡黃色，總皂苷含量以熊果酸計48. 90%。實施例6 (制備貓人參提取物)貓人參藥材粗粉1kg，在葡聚糖凝膠純化步驟，用20%甲醇水溶液洗脫至近無色，再80%甲醇洗脫皂苷成分，其余同實施例1，得提取物4. 24g，產(chǎn)品外觀淡黃色，總皂苷含量以熊果酸計61. 35%。實施例7 (制備貓人參提取物)貓人參藥材粗粉1kg，脫色后不經(jīng)葡聚糖凝膠純化，直接干燥粉碎，其余同實施例1，得提取物10. 36g，產(chǎn)品外觀褐色，總皂苷含量以熊果酸計40. 54%。
實施例8 (制備貓人參提取物)貓人參藥材粗粉1kg，僅選用50g活性炭作為脫色劑脫色，其余同實施例1，得提取物7. 12g，產(chǎn)品外黃色，總皂苷含量以熊果酸計43. 79%。實施例9 (貓人參提取物的藥效實驗)I.體外抗腫瘤實驗(MTT測試)取對數(shù)生長期的HL60、!fep3B、!fepG2腫瘤細(xì)胞(由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所引進(jìn))，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基分別配成7 X104、l. 05 X IO5個/ml的細(xì)胞懸液，分別接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種90 μ I ;分別加入含不同濃度提取物(實施例I方法制備)的PBS溶液10 μ 1，使終濃度分別為50、100、200、300、400、500 μ g/ml，空白對照組加10 μ I RPMI 1640培養(yǎng)基，每組設(shè)5個平行孔，37°C ,5% CO2培養(yǎng)3d ;每孔加5mg/ml MTT生理鹽水溶液10 μ 1，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h ；96孔板800g離心lOmin，棄去上清，每孔加DMSO150μ 1，振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上以492nm波長測定光密度值。按下式計算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率腫瘤細(xì)胞生長抑制率(％ ) = (I-實驗組OD/對照組OD值)X 100以濃度對腫瘤細(xì)胞生長抑制率作圖得量效關(guān)系曲線(圖2)，結(jié)果表明提取物具有較強的細(xì)胞毒作用。2、體內(nèi)抗腫瘤實驗小鼠肝癌細(xì)胞系H22(由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所引迸)復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)期細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整至I X IO6個/ml，以每只O. 5ml接種于小鼠腹腔中，一周后抽取小鼠腹水，用生理鹽水按照I : 4稀釋成細(xì)胞懸液，以O(shè). 2ml/只接種于小鼠(昆明種小鼠由復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心提供)右前肢腋部皮下。在接種24h后，小鼠完全隨機分組?？瞻讓φ战M灌胃給予等體積空白溶劑；提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組(實施例I方法制備)灌胃給藥，劑量見表1，連續(xù)14天；CTX組(環(huán)磷酰胺，上海華聯(lián)制藥有限公司)腹腔注射CTX 30mg/kg，隔日一次，連用4次。所有各組給藥容積均為O. 2ml/只。末次給藥后次日，采用頸椎脫臼法處死小鼠，剝離瘤塊稱重，按照以下公式計算腫瘤生長抑制率腫瘤生長抑制率(％ )=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重 XlOO結(jié)果表明給予提取物低、中、高劑量均能抑制腫瘤的生長(表I)，表明提取物具有較強的抗腫瘤效果。表I.貓人參提取物對小鼠移植瘤的抑制作用
_劑量；mm (g) 腫_制率㈨
權(quán)利要求
1.一種貓人參提取物，其特征在于該提取物中總皂苷的含量為40% 75% ;有效成分包括科羅索酸、2 α，3 β，24-三羥基烏蘇烷-12-烯_28_酸、2 α，3 α，24-三羥基烏蘇燒-12-稀-28-酸和2 α , 3 α , 19 α , 24-四輕基烏蘇燒~12~稀-28-酸。
2.權(quán)利要求I所述的貓人參提取物的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)藥材提取將干燥、粉碎的貓人參藥材以體積濃度為50% 95%乙醇或甲醇水溶液進(jìn)行提取，提取液濃縮至無醇味，放冷，離心，分取沉淀； (2)除雜脫色將步驟(I)制得的沉淀以體積濃度為50% 100%乙醇或甲醇水溶液溶解，加入脫色劑除雜脫色，脫色液濃縮，得除雜脫色后產(chǎn)物； (3)分離純化將步驟(2)制得的除雜脫色后產(chǎn)物用體積濃度為50% 95%乙醇或甲醇水溶液溶解，上葡聚糖凝膠柱，先用體積濃度為5% 25%乙醇或甲醇水溶液洗脫至 近無色，再用體積濃度為70% 100%乙醇或甲醇水溶液洗脫皂苷類成分，收集洗脫液，濃縮，干燥，粉碎，即得總皂苷質(zhì)量百分含量為60% 75%提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的貓人參提取物的制備方法，其特征在于步驟(I)所用的提取方式為滲漉提取或者回流提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的貓人參提取物的制備方法，其特征在于回流提取條件溫度50 80°C，料液重量比1 30 I : 60，乙醇或甲醇體積濃度為50% 95%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的貓人參提取物的制備方法，其特征在于步驟(3)中所用的脫色劑為活性碳，或活性白土，或者活性碳和活性白土的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的貓人參提取物的制備方法，其特征在于步驟(3)所用的脫色劑為活性炭和與活性白土之比為10 : I I : 20 (重量比)的混合脫色劑，用量為藥材量的 25% 200%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的貓人參提取物的制備方法，其特征在于步驟(3)所用的脫色劑為活性炭與與活性白土之比為I : 10(重量比)的混合脫色劑，用量為藥材量的50%。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的貓人參提取物的制備方法，其特征在于步驟(3)中的葡聚糖凝膠為Sephadex LH-20葡聚糖凝膠。
9.權(quán)利要求I所述的貓人參提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種貓人參提取物，其總皂苷的質(zhì)量百分含量為40％～75％，有效成分主要包括科羅索酸、2α，3β，24-三羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸、2α，3α，24-三羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸和2α，3α，19α，24-四羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸。本發(fā)明還提供了該貓人參提取物的制備方法，該制備方法包括提取、脫色劑除雜脫色、葡聚糖凝膠純化等工序。經(jīng)藥理實驗表明，本發(fā)明貓人參提取物具有較好的抗腫瘤作用，因而可將其用于制備抗腫瘤的藥物。
文檔編號A61K36/185GK102846680SQ201110183280
公開日2013年1月2日 申請日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者辛海量, 凌昌全, 蘇永華, 曲麗萍, 盛佳鈺, 楊延龍, 張慧卿, 王麗娜, 李同明 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)