專利名稱：活化人工骨體外構(gòu)建方法及配套循環(huán)灌注接種環(huán)路的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，涉及應用于活化人工骨體外構(gòu)建中成骨性種子細胞與人工骨快速、高效的復合方法，特別涉及一種活化人工骨體外構(gòu)建方法及配套循環(huán)灌注接種環(huán)路，能夠顯著提高細胞接種效率，縮短人工骨體外活化時間，增強活化效果，同時便于大規(guī)模生產(chǎn)、消毒、包裝、運輸、貯存和臨床使用，利于人工骨的體外活化及臨床應用。
背景技術(shù)：
骨移植術(shù)是治療骨缺損和促進骨愈合的重要手段之一，自體骨移植因其能為成骨細胞和骨組織的生長提供支架(骨傳導性)、誘導周圍組織中的成骨前體細胞向缺損區(qū)域內(nèi)的移行和向成骨細胞分化(骨誘導性)、直接提供可參與成骨活動、形成新骨的成骨細胞(骨生成性)等特點，至今仍是骨移植的“金標準”。但是，自體骨骨量有限，取骨手術(shù)增加了患者的創(chuàng)傷和痛苦、延長了手術(shù)時間，且存在供區(qū)感染、出血、疼痛等并發(fā)癥。因此，同種異體骨、異種骨、人工骨等均獲批作為自體骨替代物應用于骨移植術(shù)中。但是，免疫排斥反應、病毒傳染等風險限制了異體骨和異種骨的推廣應用。近年來，以鈣磷類材料為主的人工骨在骨缺損的臨床治療中得到迅速推廣和普及。然而，由于現(xiàn)有人工骨材料均不含有成骨細胞，主要依靠骨傳導性即宿主骨的長入和爬行替代完成修復，骨愈合過程緩慢，修復效果并不理想。將骨愈合和骨修復的主體——成骨性種子細胞接種到各種人工骨和植骨材料上， 形成的活化人工骨兼具骨傳導性、骨誘導性和骨生成性。相比于異體骨、異種骨和人工骨， 復合有成骨細胞的活化人工骨是一種成骨活性最接近自體骨的骨移植物。在活化人工骨的構(gòu)建中，細胞接種是關鍵步驟。目前應用最普遍的細胞靜態(tài)接種方法是通過重力、負壓或毛細管作用使細胞接種至支架材料上(內(nèi))，操作簡便，但接種效率很低，支架上細胞數(shù)量少，成骨活性差，同時造成大量種子細胞的浪費；其次，細胞多附著在支架材料表面而難以進入內(nèi)部，造成支架內(nèi)細胞分布很不均勻；再次，靜態(tài)接種方法依靠純手工操作，易污染，難以轉(zhuǎn)化形成規(guī)模化生產(chǎn)。此外，由于含有活細胞，活化人工骨的包裝、 消毒、運輸、貯存等也存在諸多限制，這些原因?qū)е缕駷橹惯@種公認為“理想的骨移植物” 的活化人工骨仍未真正在臨床中得到應用。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種活化人工骨體外構(gòu)建方法及配套的循環(huán)灌注接種環(huán)路。為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案 一種活化人工骨體外構(gòu)建方法，其特征在于，按下列步驟進行
1)制作配套使用的循環(huán)灌注接種環(huán)路，該循環(huán)灌注接種環(huán)路由灌流室、連接管、以及連接管上串聯(lián)的第一通道轉(zhuǎn)換器和第二通道轉(zhuǎn)換器組成；
2)將待活化的人工骨材料預先裝入循環(huán)灌注接種環(huán)路的灌流室內(nèi)；以單個循環(huán)灌注接種環(huán)路為單位進行獨立包裝；
3)使用前于無菌狀態(tài)下取出循環(huán)灌注接種環(huán)路，將單個或多個循環(huán)灌注接種環(huán)路與蠕動泵相連，置于濃度為5%的(X)2環(huán)境、溫度為37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)；
4)經(jīng)第二通道轉(zhuǎn)換器向循環(huán)灌注接種環(huán)路內(nèi)注滿細胞培養(yǎng)液，開啟蠕動泵4-6小時， 進行人工骨材料預濕化處理并排出材料孔隙內(nèi)空氣；經(jīng)第一通道轉(zhuǎn)換器將預定數(shù)量種子細胞注入循環(huán)灌注接種環(huán)路中，將第一通道轉(zhuǎn)換器和第二通道轉(zhuǎn)換器調(diào)節(jié)至整個循環(huán)灌注接種環(huán)路通暢；
5)開啟蠕動泵進行循環(huán)灌注接種12- 24小時，得到活化人工骨。實現(xiàn)上述活化人工骨體外構(gòu)建方法的配套循環(huán)灌注接種環(huán)路，其特征在于，由灌流室、連接管、以及連接管上串聯(lián)的第一通道轉(zhuǎn)換器和第二通道轉(zhuǎn)換器組成。所述的蠕動泵為防水型蠕動泵。所述的環(huán)路中連接管為透氣性管。上述得到的活化人工骨可以移植入患者體內(nèi)進行骨缺損或骨折治療、脊柱融合寸。本發(fā)明的顯著特點在于
1、通過灌注式動態(tài)循環(huán)細胞接種，能夠顯著提高種子細胞接種效率和待活化的人工骨材料內(nèi)細胞分布均勻度，從而增強活化人工骨構(gòu)建效果，縮短構(gòu)建時間；
2、預活化的人工骨材料封閉于灌注環(huán)路內(nèi)，使用時通過灌注環(huán)路的蠕動泵管部分環(huán)路與蠕動泵直接組裝，方便包裝、消毒、運輸和貯存，利于臨床使用；
3、整個細胞接種過程均在封閉環(huán)境下進行，最大限度避免了污染；
4、接種細胞密度、數(shù)量，灌注接種速率、方式(單向循環(huán)、雙向往復)等均精確可控。因此，可在短時間(12- 小時)內(nèi)快速構(gòu)建出活化人工骨，滿足臨床治療需要。本發(fā)明較傳統(tǒng)靜態(tài)接種方法大大節(jié)省了種子細胞數(shù)量；整個細胞接種過程均在封閉環(huán)境下進行，最大限度避免了污染，預活化的人工骨材料封閉于灌注環(huán)路內(nèi)，使用時通過灌注環(huán)路的蠕動泵管部分環(huán)路與蠕動泵直接組裝，方便包裝、消毒、運輸和貯存，利于臨床使用。


圖1是本發(fā)明所涉及的配套循環(huán)灌注細胞接種環(huán)路結(jié)構(gòu)及其工作狀態(tài)示意圖；圖中的連接管用標記7表示，粗箭頭標記6表示細胞循環(huán)灌注接種狀態(tài)。下面結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式參照圖1，本發(fā)明的活化人工骨體外快速構(gòu)建方法，首先制作配套循環(huán)灌注接種環(huán)路，配套循環(huán)灌注接種環(huán)路由灌流室2、連接管7、以及連接管7上串聯(lián)的第一通道轉(zhuǎn)換器4 和第二通道轉(zhuǎn)換器6組成；使用過程中，通過調(diào)節(jié)第一通道轉(zhuǎn)換器4和第二通道轉(zhuǎn)換器5即可在環(huán)路內(nèi)添加種子細胞懸液及更換培養(yǎng)液，或取樣檢測。根據(jù)置入人工骨材料的不同選取相應規(guī)格的灌流室2，將待活化的人工骨材料3 預先裝入灌流室2內(nèi)，以單個灌注接種環(huán)路為單位進行獨立包裝。
使用前于無菌狀態(tài)下取出配套循環(huán)灌注接種環(huán)路，通過配套循環(huán)灌注環(huán)路的連接管7與蠕動泵1相連接(多個配套循環(huán)灌注接種環(huán)路可同時連接于一臺蠕動泵上)，將整個循環(huán)灌注接種環(huán)路置于濃度為5%的CO2環(huán)境、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)。經(jīng)第二通道轉(zhuǎn)換器5向接種環(huán)路內(nèi)注滿細胞培養(yǎng)液，開啟蠕動泵1，以設定速率灌注4-6小時，進行人工骨材料預濕化處理并排出材料孔隙內(nèi)空氣。經(jīng)第一通道轉(zhuǎn)換器將預定數(shù)量種子細胞注入循環(huán)灌注接種環(huán)路中，將第一通道轉(zhuǎn)換器4和第二通道轉(zhuǎn)換器5調(diào)節(jié)成灌注接種狀態(tài)(圖中的粗箭頭6表示的回路)，開啟蠕動泵1，以設定速率進行灌注接種，12-24小時后細胞在活化的人工骨材料內(nèi)接種完畢，快速得到活化人工骨。用于移植入患者體內(nèi)進行骨移植術(shù)治療。蠕動泵1為防水型蠕動泵，由防水型蠕動泵提供灌注動力，灌流室2內(nèi)預置人工骨材料3，連接在灌流室2入管上的第一通道轉(zhuǎn)換器4用于加注種子細胞懸液，第二通道轉(zhuǎn)換器5用于細胞培養(yǎng)液的注入及必要時更換。環(huán)路中的連接管7均為透氣性管，可保持本系統(tǒng)內(nèi)、外自由的氣體交換。在活化人工骨構(gòu)建必需的細胞接種過程中，通過灌注式動態(tài)循環(huán)細胞接種方法， 接種細胞密度、數(shù)量，灌注接種速率、方式(單向循環(huán)、雙向往復)等均精確可控，因此可顯著提高種子細胞接種效率和支架材料內(nèi)細胞分布均勻度，縮短了構(gòu)建時間，增強了構(gòu)建效果， 較傳統(tǒng)靜態(tài)接種方法大大節(jié)省了種子細胞數(shù)量；整個細胞接種過程均在封閉環(huán)境下進行， 最大限度避免了污染；預活化的人工骨材料封閉于灌注環(huán)路內(nèi)，使用時通過灌注環(huán)路的蠕動泵管部分環(huán)路與蠕動泵直接組裝，方便包裝、消毒、運輸和貯存，利于臨床使用。
權(quán)利要求
1.一種活化人工骨體外構(gòu)建方法，其特征在于，按下列步驟進行1)制作配套使用的循環(huán)灌注接種環(huán)路，該循環(huán)灌注接種環(huán)路由灌流室、連接管、以及連接管上串聯(lián)的第一通道轉(zhuǎn)換器和第二通道轉(zhuǎn)換器組成；2)將待活化的人工骨材料預先裝入循環(huán)灌注接種環(huán)路的灌流室內(nèi)，以單個循環(huán)灌注接種環(huán)路為單位進行獨立包裝；3)使用前于無菌狀態(tài)下取出循環(huán)灌注接種環(huán)路，將循環(huán)灌注接種環(huán)路與蠕動泵相連， 并將循環(huán)灌注接種環(huán)路置于濃度為5%的(X)2環(huán)境、溫度為37°C的培養(yǎng)箱內(nèi)；4)經(jīng)第二通道轉(zhuǎn)換器向循環(huán)灌注接種環(huán)路內(nèi)注滿細胞培養(yǎng)液，開啟蠕動泵4-6小時， 進行人工骨材料預濕化處理并排出材料孔隙內(nèi)空氣；經(jīng)第一通道轉(zhuǎn)換器將預定數(shù)量種子細胞注入循環(huán)灌注接種環(huán)路中，將第一通道轉(zhuǎn)換器和第二通道轉(zhuǎn)換器調(diào)節(jié)至整個循環(huán)灌注接種環(huán)路通暢；5)開啟蠕動泵進行循環(huán)灌注接種12- 24小時，得到活化人工骨。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蠕動泵為防水型蠕動泵。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的連接管為透氣性管。
4.一種實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的活化人工骨體外構(gòu)建方法的配套循環(huán)灌注接種環(huán)路，其特征在于，由灌流室(2)、連接管(7)、以及連接管上串聯(lián)的第一通道轉(zhuǎn)換器(4)和第二通道轉(zhuǎn)換器(5)組成。
5.如權(quán)利要求4所述的配套循環(huán)灌注接種環(huán)路，其特征在于，所述的第一通道轉(zhuǎn)換器 (4)用于向循環(huán)灌注接種環(huán)路內(nèi)添加預定數(shù)量的種子細胞懸液；所述的第二通道轉(zhuǎn)換器 (5 )用于向循環(huán)灌注接種環(huán)路內(nèi)注入或更換細胞培養(yǎng)液，或取樣檢測。
6.如權(quán)利要求4所述的配套循環(huán)灌注接種環(huán)路，其特征在于，所述的蠕動泵(1)為防水型蠕動泵。
7.如權(quán)利要求4所述的配套循環(huán)灌注接種環(huán)路，其特征在于，所述的連接管(7)為透氣性管。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于臨床的活化人工骨體外快速構(gòu)建方法及循環(huán)灌注接種環(huán)路，由灌流室、通道轉(zhuǎn)換器和連接管組成了單個循環(huán)灌注接種環(huán)路結(jié)構(gòu)，將待活化的人工骨材料預先裝入循環(huán)灌注接種環(huán)路的灌流室內(nèi)，將單個或多個循環(huán)灌注接種環(huán)路與一臺蠕動泵相連接；通過灌注式動態(tài)循環(huán)細胞接種方法，接種細胞密度、數(shù)量，灌注接種速率、方式(單向循環(huán)、雙向往復)等均精確可控，因此可顯著提高種子細胞接種效率和支架材料內(nèi)細胞分布均勻度，縮短了構(gòu)建時間，增強了構(gòu)建效果，較傳統(tǒng)靜態(tài)接種方法大大節(jié)省了種子細胞數(shù)量，利于臨床使用。
文檔編號A61F2/28GK102389342SQ201110188289
公開日2012年3月28日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者張揚, 王林, 王臻, 胡蘊玉, 裴國獻, 雷偉, 馬真勝 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學