專利名稱：鱖傳染性脾腎壞死病毒(isknv)orf093蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV) 0RF093 蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鱖LSinipercei chuatsi)是我國重要的淡水魚特色養(yǎng)殖品種之一，由傳染性脾腎
Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)弓白勺病是鱖魚養(yǎng)殖的主要疫病，導(dǎo)致鱖死亡率接近100%，成為制約鱖養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。 長期以來，對于鱖病毒病的防治一直沒有有效的藥物，而且抗生素、化藥等防治疾病弊端眾多，如病原耐藥性、環(huán)境污染、食品安全問題等。因此作為符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的病害控制措施，疫苗、抗血清等生物制劑正成為國際現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)規(guī)范和研究開發(fā)的前沿?zé)狳c領(lǐng)域。因此，研制與發(fā)展鱖傳染性脾腎壞死病毒病疫苗及治療制劑對防治鱖魚虹彩病毒病具有戰(zhàn)略意義，尋找新的疫苗候選抗原及抗病毒血清是當(dāng)今鱖魚虹彩病毒病研究的重點之一。傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)是虹彩病毒科腫大細胞屬的代表種，為細胞質(zhì)內(nèi)寄生的具囊膜二十面體病毒，直徑為150nm，含有雙鏈DNA，基因組由111，362個堿基組成，包括125個預(yù)測開放讀碼框ORF (open reading frames)，鱖魚是其主要感染宿主。目前控制病毒性疾病主要有兩種手段接種疫苗和使用抗病毒藥物。在鱖虹彩病毒病疫苗研究方面，潘厚軍等采用滅活組織漿疫苗對其進行防治，在室內(nèi)和田間實驗效果較好，但是由于疫苗材料來源于病鱖內(nèi)臟組織，受季節(jié)和數(shù)量上的限制，推廣應(yīng)用有一定的困難。由于基因工程疫苗不受上述條件的限制，成為研制鱖ISKNV疫苗的一個理想的方法。2004年，張敏等進行了 ISKNV主衣殼蛋白(Major capsid protein, MCP)的原核表達，采用免疫印記的方法初步確定了重組MCP蛋白與ISKNV MCP蛋白有相同的抗原特性，為ISKNV重組亞單位疫苗的研制提供了思路。2009年，付小哲等對重組MCP蛋白的免疫原性進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)重組 MCP蛋白有較好的免疫原性，可以激發(fā)鱖特異性免疫及非特異性免疫應(yīng)答。在其他虹彩病毒病疫苗研制方面，日本的研究人員研制出抗真鯛虹彩病毒(RSIV)細胞滅活疫苗，免疫保護率在75%以上，是亞洲地區(qū)唯一成功進行商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用魚類病毒性疾病的疫苗。日本研究人員還對RSIV核酸疫苗(0RF380R，ORF 569R)進行了研究，結(jié)果顯示重組核酸疫苗能夠產(chǎn)生45 60%左右的免疫保護。Park等根據(jù)0RF055構(gòu)建了條石鯛虹彩病毒(RBIV)核酸疫苗，結(jié)果顯示免疫真鯛血清在BF-2細胞上對病毒具有一定的中和作用，但尚無免疫保護數(shù)據(jù)。在抗血清等抗病毒藥物方面尚無相關(guān)研究。到目前為止，還沒有出現(xiàn)以ISKNV 0RF093基因作為疫苗前體及其抗血清制劑的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV) 0RF093蛋白在制備預(yù)防鱖傳染性脾腎壞死病毒病疫苗及藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV) 0RF093蛋白在制備預(yù)防鱖傳染性脾腎壞死病毒病疫苗或藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述(ISKNV) 0RF093蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明具有以下有益效果
鱖ISKNV 0RF093蛋白對鱖虹彩病毒病有較好的免疫預(yù)防作用，由0RF093重組蛋白制備的抗血清對鱖虹彩病毒病也有較好的中和效果。制備的0RF093重組核酸疫苗免疫鱖魚 30天后，保護率超過45%，由0RF093重組蛋白制備的兔抗血清對ISKNV也有較強的中和作用，中和液注射鱖魚觀天后，相對存活率超過56%。因此，鱖ISKNV 0RF093蛋白可以開發(fā)成為抗鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病新疫苗或新藥物。


圖 1 是 ISKNV 0RF093 基因的 PCR 擴增圖，其中 M 為 maker，1 為 ISKNV 0RF093 基因；
圖2是SDS-PAGE分析ISKNV 0RF093重組融合蛋白的表達圖，其中1為蛋白marker， 2為pET3h(+)空載，3為誘導(dǎo)表達上清，4為誘導(dǎo)表達前菌體，5、6為誘導(dǎo)表達后菌體總蛋白；
圖3是SDS-PAGE分析ISKNV 0RF093重組融合蛋白的純化圖，其中1為蛋白marker，2 為pET32a(+)空載，3為純化后的重組蛋白，4為表達重組蛋白包涵體；
圖4是重組質(zhì)粒pET3h-093表達產(chǎn)物的western- bloting分析圖，其中1為 pET32a(+)空載，2為0RF093重組蛋白，3為預(yù)染蛋白marker ；
圖5是免疫斑點檢測ISKNV圖，其中1為鱖腦細胞，2為細胞培養(yǎng)的ISKNV。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例1
1鱖ISKNV 0RF093重組蛋白在大腸桿菌中的原核表達
1.1根據(jù)GenBank中傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV) [NC_003494] 0RF093序列(SEQ ID NO: 1)設(shè)計引物，并引入酶切位點(以下劃線標(biāo)注)。引物序列如下
Pl [5~- CGGAATTCATGAATAAAACGC -3，(SEQ ID NO :3)，引入 EcoR I 酶切位點； P2 [5' - CGGAAGCTTTTAAACATGGCGTC -3，(SEQ ID NO :4)，引入 Hind III酶切位點。1.2以本實驗室自保存的鱖ISKNV基因組為模板進行PCR擴增，25 μ L PCR反應(yīng)體系包含10 Xbuffer (含 Mg2+)2. 5 μ L，4X dNTP (10mmol/L)0. 5 μ L，上下游引物(20 μ mol/ L)各 0.5 μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0. 3 μ L，DNA 1. 0 μ L，無菌雙蒸水補足。PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性4min ；94°C變性45S，50°C復(fù)性45S，72°C延伸30S，30個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，結(jié)果顯示，在900bp左右出現(xiàn)亮帶，片段大小與預(yù)期927bp基本相符(見圖1 )，將目的產(chǎn)物進行膠回收純化，送至測序公司測序，序列見 SEQ ID N0:1。1.3將純化后的ISKNV 0RF093 PCR產(chǎn)物及提取的原核表達質(zhì)粒pET3h ( + )，分別用Hind III和EcoR I進行雙酶切。ρΕΤ3^ι ( + )的酶切體系為10XNEB Buffer 5 μ L， 100 X BSA 0. 5μ L, EcoR I (20U/y L) 1 μ L, Hind III(20U/y L) 1 μ L, pET32a ( + ) 15 μ L (7μ g/μ L)，滅菌雙蒸水補足50μ L。0RF093 PCR產(chǎn)物酶切體系為10XNEB Buffer 5 μ L， 100XBSA 0. 5 μ LjEcoR I (20U/μ L)1 μ L，Hind III(20U/μ L)1 μ L，0RF09340 μ L (2. 5μ g/ μ L)，滅菌雙蒸水補足50 μ L0將酶切產(chǎn)物進行膠回收純化。1.4將純化后的PCR產(chǎn)物和pET3h( + )質(zhì)粒16°C連接過夜，連接體系為 pET32a( + ) (9ng/ μ L) 3. 0 μ L, 0RF093 5· 0 μ L (7ng/μ L)，Τ4 DNA ligase (5U/ μ L) 1. 0 μ L, 2 X Rapid Ligation Buffer 1.0 μ L01.5將連接反應(yīng)液5 μ L加入IOOyL DH5 α感受態(tài)細胞(Takara，Japan)中，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻，置冰浴30min后，將感受態(tài)細胞置于42°C水浴熱激90S，然后快速轉(zhuǎn)到冰浴中冷卻:3min。再向每個離心管中加入900 μ L滅菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置于37°C搖床振蕩培養(yǎng)45min (轉(zhuǎn)速200rpm/min)。吸取100 μ L已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布LB平板(含 amp 50μ g/mL)，37°C正置培養(yǎng)30min后，倒置培養(yǎng)16h。1. 6挑取白色菌落，接種于3mL加Amp (終濃度50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中， 370C 200rpm培養(yǎng)過夜。吸取ImL菌液轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管中，送至測序公司測序，鑒定重組表達載體pET3^i-0RF093是否正確構(gòu)建，序列見SEQ ID N0:1。1. 7吸取含有鑒定正確的pET3h-0RF093 DH5 α菌液30 μ L加到3 mL含有Amp (終濃度50μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)粒提取試劑盒 (OMEGA, USA)提取重組質(zhì)粒pET32a-0RF093o取2 μ L重組質(zhì)粒加入100 μ L BL21 (DE3)感受態(tài)細胞(Takara，Japan)中進行轉(zhuǎn)化，后續(xù)實驗方法見步驟1. 5。1.8挑取白色菌落，接種于3ml加Amp (終濃度50 μ g/ mL)LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩過夜，按1%的接種量再次接種于含有Amp培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD值為0. 6，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)，37°C誘導(dǎo)表達4h。1. 9收集菌體進行SDS-PAGE分析。配制15%的分離膠和5%的濃縮膠。吸取20 μ 1 菌液，加入等體積2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后100°C水浴5min，吸取20 μ 1樣品加入點樣孔中，120V電泳，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳，將凝膠置于新配的考馬斯亮藍染色液中，染色lh，回收考馬斯亮藍染色液，加入脫色液室溫下?lián)u動脫色，直至背景顏色完全脫去。結(jié)果顯示在約36KD處有一條特異性表達帶，與預(yù)期大小相符(見圖2)，其氨基酸序列見SEQ ID NO :2ο1. 10 融合蛋白按照 Bugbuster His Bind Purfification KitCNOVAGEN, Canada) 說明書進行純化。1. 11將純化好的蛋白溶液裝入透析袋，4°C依次用透析液1、2、3、4、5進行透析， 透析時間依次為21^^31:31^1 (過夜)。再將透析好的蛋白溶液用PEG20000進行濃縮。 吸出透析好的樣品溶液，12000rpm離心IOmin，取10 μ 1上清進行SDS-PAGE分析(見圖3)， 方法見步驟1.9。透析液1 :50 mM Tris-Cl (ρΗ8· 5)，4 mM Urea , 5mM EDTA,5πιΜβ-巰基乙醇，20%甘油；
透析液 2:50 mM Tris-Cl (ρΗ8· 5)，2 mM Urea ,2. 5mM EDTA, 2. 5mMB-巰基乙醇，20%甘油；
透析液 3 :50 mM Tris-Cl (ρΗ8· 5), 1 mM Urea, ImM EDTA, ΙπιΜβ-巰基乙醇，20%甘油；
透析液 4 50 mM Tris-Cl (ρΗ8· 5) ,0. 5 mM Urea, 5mM EDTA,
0. 5mMB-巰基乙醇，20%甘油；
透析液 5:50 mM Tris-Cl (pH8. 5)，20% 甘油。2抗重組0RF093融合蛋白多克隆抗體的制備
2.1將復(fù)性后的0RF093重組蛋白濃度調(diào)整為ang/mL，與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化。2. 2取新西蘭白兔2只，一只注射0RF093重組蛋白，一只注射PBS(pH7. 4)。注射前，從耳靜脈取Iml血制備血清，作為對照。2. 3首次免疫采用皮下多點注射方式進行，每只注射anl。免疫15天后進行加強免疫，加強免疫時采用弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量為初次免疫的2/3。以后每隔7天加強免疫一次，免疫劑量為初次免疫的2/3。每次加強免疫前均由耳靜脈取血1ml，ELISA檢測抗體效價。2. 4待效價達到所需效價時，割斷兔頸動脈放血。50mL離心管收集全血，室溫靜置 lh，待其凝固后，放置4°C冰箱過夜。4°C下5000rmp離心lOmin，取上清即血清。在血清中加入0. 05%疊氮鈉，小管分裝后-20°C保存。3免疫印記分析抗重組0RF093融合蛋白多克隆抗體
3.1將純化后的重組0RF093融合蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，方法見步驟1. 9。3. 2電泳完畢后，將凝膠上分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜(NC膜)上，在80mA 的電流下轉(zhuǎn)移4h，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移情況。3. 3用含5%的脫脂奶粉的封閉液封閉無關(guān)蛋白的潛在結(jié)合位點，室溫搖床孵育 lh。3.4棄封閉液，立即加入抗重組0RF093融合蛋白多克隆抗體和新的封閉液 (1:100)，4°C孵育 lh。3. 5轉(zhuǎn)移掉封閉液，用PBS漂洗3次，IOmin/次。最后用TBS漂洗1次，lOmin。3.6取2 μ L辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)稀釋于IOmL溶解液中(5%脫脂奶粉，50mM Tris-Cl, pH7. 5,150mM NaCl) (1 5000)，將膜浸泡于此液中，排除袋里氣泡，然后密閉袋口，搖床上輕搖，37 °C Ih。3. 7去掉辣根過氧化物酶溶液，TBS漂洗3次，IOmin/次。漂洗后的膜移入干凈培養(yǎng)皿，按膜面積加入0. lmL/cm2的底物溶液(DAB)與H2A混合液(IOmL底物溶液加入IOyL 30% 液，混勻后立即使用)。3. 8室溫輕搖，仔細觀察蛋白帶的生色反應(yīng)，一旦蛋白帶的顏色深度達到要求(約 2-3min),即用水稍為漂洗，將濾膜轉(zhuǎn)移到裝PBS的培養(yǎng)皿中，終止反應(yīng)。結(jié)果顯示，抗血清能與重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，并顯示出一條相應(yīng)大小的蛋白條帶(見圖4)。4.免疫斑點分析抗重組0RF093融合蛋白多克隆抗體4.1將鱖腦細胞傳瓶至25cm2的細胞培養(yǎng)瓶，待細胞形成匯合的單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，然后加入約Iml的ISKNV病毒濾液，27°C約Ih進行病毒吸附。吸出感染上清，加入細胞維持液(L-15添加5%的FBS)，置27°C細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天。4. 2將ISKNV的細胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍溶3次后，40000rpm/min離心，沉淀用TE緩沖液溶解，未感染的鱖腦細胞也經(jīng)同樣處理。4. 3將5 μ L溶解的沉淀點在硝酸纖維素濾膜上，設(shè)鱖腦細胞做陰性對照。60°C烘干lh，用含5%的脫脂奶粉的封閉液封閉，室溫搖床孵育lh。以后操作均與免疫印跡分析相同，方法見步驟3. 5 3. 8。結(jié)果顯示，ISKNV的細胞樣品處有明顯的斑點出現(xiàn)，而鱖腦細胞對照則沒有斑點(見圖5)，說明重組0RF093抗血清可以和ISKNV反應(yīng)，重組0RF093有與ISKNV 0RF093相似的抗原特性。5.鱖ISKNV與抗重組0RF093融合蛋白多克隆抗體中和試驗
5.1實驗鱖魚(購自廣東省佛山市荷塘鎮(zhèn)三根養(yǎng)殖場)，體質(zhì)量40-50g，在充氣及流水養(yǎng)殖池內(nèi)暫養(yǎng)2周。從中隨機挑取20尾，經(jīng)鏡檢觀察寄生蟲、肝臟分離細菌、PCR檢測ISKNV 全部陰性，確認健康后用于實驗。實驗期間水溫27 31°C，每天投喂餌料魚(鯪魚)，攻毒后改為每隔3天投喂一次餌料魚。5. 2取具有典型鱖病毒病癥狀的鱖魚脾和頭腎，經(jīng)PCR檢測為ISKNV陽性后，以1 10質(zhì)量體積比加PBS冰浴勻漿，40C 4 000r/min離心30min，取上清經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，加入青霉素和鏈霉素至1000 UI/ml，4°C冰箱中保存。取病毒濾液接種于胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為30°C，4 后，觀察培養(yǎng)基上無細菌生長，此病毒濾液用于中和試驗。5. 3將實驗鱖魚隨機分為3個實驗組，分別為093組、陽性對照組、陰性對照組，每組30尾，每個組設(shè)一個平行對照組。將制備好的兔抗重組0RF093融合蛋白血清與病毒濾液按1 :1比例混合，4°C放置過夜(12小時左右)，次日腹腔注射093組魚體；陽性對照組腹腔注射病毒濾液；陰性對照組腹腔注射PBS(pH7.4)。各組的注射體積均為200 μ L/尾。觀察28天，每天記錄發(fā)病情況。結(jié)果顯示(見表1)，觀天后，093組、陽性對照組、陰性對照組各組的平均累積死亡率分別為43. 3%、100%、0，093組的相對保護率為56. 7%，說明制備的抗重組0RF093融合蛋白多克隆抗體對ISKNV具有較好的中和效果，可以用來制備防治鱖虹彩病毒病的藥物制劑。
權(quán)利要求
1.鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV) 0RF093蛋白在制備預(yù)防鱖傳染性脾腎壞死病毒病疫苗或藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)ORF093蛋白在制備預(yù)防鱖傳染性脾腎壞死病毒病疫苗或藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的鱖ISKNVORF093蛋白對鱖虹彩病毒病有較好的免疫預(yù)防作用，保護率超過45%，可以開發(fā)成為抗鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病新疫苗或新藥物。
文檔編號A61K39/12GK102240399SQ201110191339
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月9日
發(fā)明者付小哲, 吳淑勤, 李寧求, 潘厚軍, 石存斌 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所