專利名稱：人鼠嵌合型抗人CD14抗體Hm2F9及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術，主要涉及人鼠嵌合型抗人CD14抗體Hm2F9及在制備抗內毒素治療藥物中的用途。
背景技術：
CD14 分子是一種糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)的錨定蛋白，分子量約^KDa左右，主要在單核細胞和巨噬細胞上表達。⑶14在體內有兩種存在形式膜 CD14 (membrane CD14, mCD14)和可溶性 CD14 (soluble CD14, sCD14)。CD14 是重要的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)識別受體，G_菌進入血液后，細菌脂多糖結合蛋白(lipopolysacchride binding protein，LBP)、LPS 與單核 / 巨噬細胞表面的 mCD14 分子形成復合物，觸發(fā)Toll-like受體4 (TLR4)信號傳導通路，信號傳遞給細胞內的接頭蛋白MyD88，激活特異性轉錄因子如核因子-κ B (nuclear factor-kappa B, NF-κ B )、活化蛋白-1 (activator protein-l，AP_l)禾口干擾素調節(jié)因子一3 (interferon regulatory factor-3, IRF-3)，介導單核巨噬細胞分泌炎癥前因子和某些中間體以及共刺激因子的表達。s⑶14可代替mCD14與LPS形成復合物，使不表達mCD14的上皮細胞和內皮細胞對LPS 的敏感性增加，引起粘附分子的表達增高和靶細胞的損傷，從而加重炎癥反應。另外除了 TLR-4信號通路外，CD14 可以識別G+菌的肽多糖(ρ印tidoglycan)成分，激活TLR-2 受體介導特異性的炎癥反應。這些反應在局部感染中可以起到消滅病原微生物的作用，但是同樣可能引發(fā)嚴重的敗血癥或感染性休克。由于CD14在LPS的致炎過程中的起著關鍵作用，如何對其進行人為的調控，已成為抗內毒素治療研究的重要領域之一。有研究發(fā)現(xiàn)mCD14陰性細胞轉染CD14基因后可使其對LPS的反應增強1000倍，而⑶14基因敲除小鼠對LPS的敏感性較對照組下降10000 倍，源于CD14基因敲除小鼠的單核細胞對LPS的敏感性降低。因此在發(fā)生敗血癥或感染性休克時，阻斷CD14的功能，抑制其引發(fā)的對病原微生物的固有免疫反應。目前，已有一些 CD14特異性的單克隆抗體在體外實驗、動物實驗和臨床試驗中顯示了較為理想的效果。動物試驗發(fā)現(xiàn)，CD14單抗對低濃度LPS的阻斷效應非常明顯，可以降低內毒素血癥兔子的死亡率，減少腎臟壞死和肺損傷，而且無論是預防性的給藥以及感染后治療性的給藥均有保護作用，但是由于抑制了機體免疫系統(tǒng)對病原微生物的反應，可能增加二次感染的幾率。在內毒素血癥短尾猴的動物實驗中，28C5 (—種抗人CD14特異性的鼠源性單抗)也取得了類似的結果，預防性的用藥降低了低血壓、肺滲出的發(fā)生率，減少了前炎癥因子的釋放。IC4 U8C5的人鼠嵌合型工程抗體)已進入到臨床試驗階段，在健康人群和嚴重敗血癥患者中應用顯示其具有較好的耐受性和較低的免疫原性，健康人群預防用藥可以減輕LPS引發(fā)的臨床癥狀，抑制前炎癥因子的釋放，但在嚴重敗血癥患者的治療中不能降低患者的死亡率，也不能抑制前炎癥因子的釋放，不過可以在一定程度上減輕患者多臟器功能的損傷。雖然，目前CD14特異性的單克隆抗體的抗內毒素治療已經取得一些效果，但是療效有限，副作用較多，且不同單抗的抗原表位不同，其臨床效果也有差異，故有必要對更多的CD14單克隆單體進行基因工程的改造。ZCH(Zhejiang Children's Hospital)-7-2F9 (簡稱 2F9)為鼠抗人 CD14 單抗，屬鼠IgGlK亞類，它已被第6屆國際人類白細胞分化抗原命名大會(HLDA6)正式命名，是我國唯一為IgGlK亞類的CD14單抗。但是該抗體是鼠源性的，在臨床治療中可能發(fā)生血清病或產生人抗鼠免疫球蛋白抗體(human anti-mouse antibody，HAMA)，只有將其進行人源化的改造，將抗體分子中部分鼠源片段替換為人源片段，以大大降低或基本消除抗體的免疫原性。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種人鼠嵌合型抗人⑶14抗體Hm2F9，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。所述的抗⑶14的人鼠嵌合型的抗體Hm2F9 是鼠源性單克隆抗體ZCH-7-2F9的單鏈抗體(參見文獻Ning BT, Tang YM, Cao J, Shen HQ, Qian BQ. [Construction and expression of prokaryotic vector of single chain antibody derived from a new clone of anti_CD14 antibody ZCH-7-2F9]· Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2008. 37(1) : 51-9.)和人 IgG 的 Fc 片段融合蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供所述的一種人鼠嵌合型抗人CD14抗體Hm2F9在制備抗內毒素血癥藥物中的應用。研究表明，所述的人鼠嵌合型抗人CD14抗體Hm2F9具有特異性結合CD14陽性細胞的能力。⑶14分子是LPS結合蛋白，主要在單核細胞和巨噬細胞上表達，與LPS和LBP結合成復合物后，可以通過Toll-like受體4信號傳導通路，介導單核巨噬細胞分泌炎癥前因子和某些中間體以及共刺激因子的表達。阻斷CD14的功能，可以抑制其引發(fā)的對病原微生物的固有免疫反應。ZCH-7-2F9單抗具有良好的識別CD14抗原而不識別其他組織、細胞成分的特性，因此，該抗體具有制備治療內毒素血癥藥物的應用前景。但2F9是鼠源性的抗體，應用于人體會產生免疫反應其根本原因是鼠源性免疫球蛋白(抗體)的Fc段對人體具有免疫原性，因此，有必要對鼠源性抗體進行人源化改造。本發(fā)明研制的嵌合抗體Hm2F9，是通過一系列繁瑣而復雜的分子生物學技術構建帶有SCFv2F9-FC基因的分泌型真核表達載體，然后轉染哺乳動物細胞CHO獲得的。該抗體對CD14陽性的細胞具有特異性的識別能力，對臨床內毒素血癥的治療將產生十分重要的應用價值。


圖1是Lk _scFv2F9理論序列。圖2是scFv2F9片段PCR產物電泳圖。圖3是TA- scFv2F9 EcoR I酶切鑒定電泳圖。圖4是TA-ScFv2F9質粒測序結果。圖5是pHMCH3-Hm2F9質粒酶切鑒定電泳圖。圖6是G418篩選第10天未轉染組CHO細胞組及轉染組細胞圖。圖 7 是 CH0-Hm2F9 細胞 RT-PCR 結果。圖8是CH0-HmF9細胞培養(yǎng)上清流式分析圖。
圖 9 是 HmF9 SDS-PAGE 圖。圖 10 是 HmF9Western-Blot 圖。
具體實施例方式本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例一分泌型人鼠嵌合真核表達載體pHMCH3-Hm2F9的構建第一部分重組載體pHMCH3-Hm2F9的構建
1.以本實驗室前期構建的帶有鼠抗人CD14單克隆抗體2F9單鏈的Psectag 2Ascfv2F9載體(參見文獻Ning BT, Tang YM, Cao J, Shen HQ, Qian BQ. [Construction and expression of prokaryotic vector of single chain antibody derived from a new clone of anti-CD14 antibody ZCH-7-2F9]· Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2008. 37(1): 51-9.)為模板，設計引物，PCR擴增出scFv2F9片段(序列參見圖1 )，并將Sfi I和EcoR I酶切位點引入該片段的兩端(參見圖1中兩端劃線部分)。1. 1設計引物通過PCR將酶切位點Sfi I和EcoR I (劃線部分)弓丨入scFv2F9 的兩端，引物序列如下
scFv2F9 段上游引物(SEQ ID NO 3) 5 ‘ -GGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGCA -3 scFv2F9 段下游引物(SEQ ID NO 4) 5' - GAATTCTTTTATTTCCAACTTGG -3' 1.2PCR反應體系
權利要求
1.一種人鼠嵌合型抗人⑶14抗體Hm2F9，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種人鼠嵌合型抗CD14抗體Hm2F9在制備抗內毒素治療藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人鼠嵌合型抗CD14抗體Hm2F9，是鼠源性CD14特異性單克隆抗體ZCH-7-2F9的單鏈抗體和人IgG的Fc片段結合的嵌合抗體。由于CD14分子在LPS的致炎過程中的起著關鍵作用，對其進行人為的調控，已成為抗內毒素治療研究的重要領域之一。本發(fā)明提供的單抗具有良好的特異性結合CD14陽性細胞而不識別其他組織、細胞成分的特性，可在制備抗內毒素血癥藥物中的應用。
文檔編號A61P7/00GK102260350SQ20111019134
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月9日 優(yōu)先權日2011年7月9日
發(fā)明者寧鉑濤, 湯永民, 沈笛穎 申請人:浙江大學