專利名稱：：細(xì)菌產(chǎn)的抗氧化劑及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗氧化劑及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
：自由基是生命活動中多種生化反應(yīng)的中間代謝物質(zhì)。自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，會造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老過程并誘發(fā)各種疾病。在衰老過程中，機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡發(fā)生了變化，表現(xiàn)為氧化作用增強(qiáng)，抗氧化能力減弱隨著年齡的增長，抗氧化酶類如SOD等活性降低，體內(nèi)除氧自由基的能力受到影響，氧自由基濃度升高，引起膜脂質(zhì)的過氧化、蛋白質(zhì)變性、酶活性降低和DNA損傷等危害些生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的改變，必然導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂，從而導(dǎo)致各種疾病和引起衰老。因此說自由基攻擊生命大分子和各種細(xì)胞器造成組織損傷，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重大原因?？寡趸镔|(zhì)(抗氧化劑)是指能夠清除氧自由基，抑制或消除以及減緩氧化反應(yīng)的一類物質(zhì)。抗氧化劑的開發(fā)與研究一直以來受到人們的廣泛關(guān)注，特別是當(dāng)科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)人體的疾病與衰老是人體內(nèi)自由基作用的結(jié)果后，抗氧化劑的研究更有了廣闊的發(fā)展空間。天然抗氧化劑已從單純作為油脂和含脂食品的抗氧化劑，發(fā)展到作為體內(nèi)氧自由基的清除劑，起到保護(hù)人體細(xì)胞組織，保護(hù)心腦血管循環(huán)系統(tǒng)、抗癌及延緩衰老等生理作用。目前天然抗氧化物質(zhì)主要是從動植物中提取的，如維生素類、酶類和天然藥物類等。但是動植物中天然抗氧化物質(zhì)含量較低，提取工藝復(fù)雜，而且從這些資源提取勢必使這這些動植物資源遭到嚴(yán)重破壞，造成生物多樣性和生態(tài)環(huán)境的損失。近年來，利用一些微生物具有產(chǎn)生和宿主相同或相似生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)，對植物來源菌進(jìn)行了大量的研究，已從榛屬植物中分離得到多株可以產(chǎn)生具有生理活性物質(zhì)的菌株，其中包括可以產(chǎn)生抗氧化劑的青霉(產(chǎn)抗氧化劑的菌株為青霉JTLR-1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年3月21日，保藏編號為CGMCCNo.4701)。名稱為“一株產(chǎn)抗氧化劑的菌株(申請?zhí)?01110111548X，申請日:2011年04月29日)”的專利中利用青霉JTLR-I產(chǎn)抗氧化劑的提取方法(具體如下取青霉JTLR-I的發(fā)酵固體培養(yǎng)物用液氮冷凍并研碎后，以Ig固體培養(yǎng)物加入IOmL質(zhì)量濃度50%的甲醇水的比例進(jìn)行提取，用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后，除去上層正己烷層，取下層冷凍干燥，即得到菌產(chǎn)抗氧化劑)存在雜質(zhì)較多，抗氧化活性低的問題。發(fā)明人期望獲得具有高提取率的抗氧化劑，并且期望將這種抗氧化劑配制成具有優(yōu)良性能的組合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有提取方法得到的菌產(chǎn)抗氧化劑存在雜質(zhì)較多，抗氧化活性低的問題，而提供微生物來源的抗氧化劑制備方法。本發(fā)明的第一個實(shí)施方案提供的是一種制備細(xì)菌產(chǎn)的抗氧化劑的方法，該方法包括以下步驟1)將12環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在3540°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；3)取Ig無水提取物溶解于6070ml乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為56mL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；4)按體積比20100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為2.55mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，棄去洗脫液；幻按體積比60100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為2.55mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，收集洗脫液，在4550°C下減壓除去溶劑，得到具有抗氧化作用的提取物；其中，步驟2中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加10_12ml蒸餾水，步驟2中水層與萃取溶液的體積比為11.5，步驟3中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為13540，硅膠的粒徑為20μπι50μπι。本發(fā)明的第二個實(shí)施方案提供的是一種抗氧化劑，其是通過包括以下步驟的方法制備的1)將12環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在3540°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；3)取Ig無水提取物溶解于6070mL乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為56mL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；4)按體積比20100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為2.55mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，棄去洗脫液；幻按體積比60100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為2.55mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，收集洗脫液，在4550°C下減壓除去溶劑，得到具有抗氧化作用的提取物；其中，步驟2中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加10_12mL蒸餾水，步驟2中水層與萃取溶液的體積比為11.5，步驟3中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為13540，硅膠的粒徑為20μπι50μπι。本發(fā)明的第三個實(shí)施方案提供的是一種藥物組合物，其中包含本發(fā)明所述菌產(chǎn)抗氧化劑、表面活性劑、助表面活性劑、促過飽和物質(zhì)和油。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的菌產(chǎn)抗氧化劑占該藥物組合物重量的10%30%(w/w)，優(yōu)選1525%(w/w)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的表面活性劑占該藥物組合物重量的15%35%(w/w)，優(yōu)選20%30%(w/w)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的助表面活性劑占該藥物組合物重量的10%(w/w)，優(yōu)選15%30%(w/w)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的促過飽和物質(zhì)占該藥物組合物重量的10%(w/w)，優(yōu)選1.5%3%(w/w)O根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的油的量是加至該組合物重量的100%。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中以該藥物組合物的重量計(jì)，其中菌產(chǎn)抗氧化劑的含量為15%25%(w/w)，表面活性劑的含量為20%30%(w/w)，助表面活性劑的含量為15%30%(w/w)，促過飽和物質(zhì)的含量為1.5%3%(w/w)，以及加至100%量的油。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的菌產(chǎn)抗氧化劑的藥物組合物，以該藥物組合物的重量計(jì)，其中的油在該組合物中的量不予特別限定，而是以平衡的量加入，使組合物總重量達(dá)到100%。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的油是含818個碳原子的中和/或長鏈脂肪酸甘油酯，優(yōu)選中鏈脂肪酸甘油酯，更優(yōu)選中鏈脂肪酸甘油三酯(MCT)；或它們的混合物，優(yōu)選油酸與中鏈脂肪酸甘油酯的混合物，例如油酸與辛酸/癸酸甘油酯不同比例的混合物，其中油酸與中鏈脂肪酸甘油酯的重量比可以為13至10.5。所述油在本發(fā)明菌產(chǎn)抗氧化劑藥物組合物中的含量為5%90%(w/w)，優(yōu)選5%85%(w/w)，優(yōu)選5%80%(w/w)，優(yōu)選10%80%(w/w)0如用于本文的，術(shù)語“中鏈脂肪酸甘油酯”通常是指具有C6C14鏈長的脂肪酸甘油酯，更優(yōu)選地是指C8C12的脂肪酸甘油酯；如以具有C8C12飽和脂肪酸制備的脂肪酸甘油酯，如中鏈脂肪酸甘油一酯、中鏈脂肪酸甘油二酯、中鏈脂肪酸甘油三酯中的一種或多種的混合物，其中前二者統(tǒng)稱為中鏈脂肪酸甘油部分酯。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的表面活性劑可以是適用于口服制劑的各種表面活性劑。所述表面活性劑在本發(fā)明菌產(chǎn)抗氧化劑藥物組合物中的含量可以為如上文所述。本發(fā)明可以使用的表面活性劑包括，但不限于，吐溫20、吐溫60、吐溫80、吐溫40、聚氧乙烯蓖麻油如EL-35(即聚氧乙烯(35)蓖麻油)、聚氧乙烯氫化蓖麻油如RH-40(即聚氧乙烯GO)氫化蓖麻油)、泊洛沙姆如F68或F108。更具體地說，本發(fā)明可以使用的表面活性劑的實(shí)例包括1)聚氧乙烯羥乙酸化的天然或氫化植物油，如聚氧乙烯羥乙酸化的天然或氫化蓖麻油(Cremophor,BASF;以及ECO，Nikkol)；2)聚氧乙烯-脫水山梨醇-脂肪酸酯，其中脂肪酸是單或三月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸或油酸(Tween，ICI)；3)聚氧乙烯脂肪酸酯如聚氧乙烯硬脂酸酯(Myrj，ICI)；4)聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Poloxamer,Pluronic或Lutrol，BASF)；5)單酸甘油酯、甘油二酯、或單酸甘油酯/甘油二酯如辛酸/葵酸單酸甘油酯/甘油二酯(ImWitor，Huls)；6)脫水山梨醇脂肪酸酯如脫水山梨醇單月桂酸酯、脫水山梨醇單棕櫚酸酯及脫水山梨醇單硬脂酸酯(Span，ICI)；以及7)天然植物油甘油三酯以及聚亞烷基多元醇的酯交換產(chǎn)品(Labrafil以及Labrasol，Gattefosse)等等。上述的表面活性劑能單獨(dú)或作為混合物使用，且優(yōu)選聚氧乙烯羥乙酸化的氫化蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油等。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的助表面活性劑(cosurfactant，亦稱為輔助表面活性劑)通常是指能夠提高液體的表面活性的物質(zhì)，其通常還能增強(qiáng)界面膜的流動性，使界面膜的彎曲更加容易，有利于微乳液的形成。本發(fā)明所述的助表面活性劑可以使用適用于口服給藥的各種助表面活性劑，其包括但不限于聚乙二醇類(例如分子量為200600的聚乙二醇，例如聚乙二醇-200、聚乙二醇-400、聚乙二醇-600)、Transcutol(即二乙二醇單乙醚，又稱為乙二醇單乙基醚，可以是其各種型號的產(chǎn)品，例如法國feittefosse公司的產(chǎn)品TranSCUtolP，以及TranSCUtolHP)、異丙醇、1，2-丙二醇和乙醇等等。本發(fā)明第一方面或第二方面任一項(xiàng)所述的藥物組合物中使用的助表面活性劑可以是上述列舉的助表面活性劑的一種，也可以是兩種或兩種以上的以任意比例的混合物，包括同一類型助表面活性劑中的多種型號的混合物，例如聚乙二醇-200+聚乙二醇-400的適宜比例的混合物，又例如Transcutol+聚乙二醇-200+聚乙二醇-400的混合物。所述助表面活性劑在本發(fā)明菌產(chǎn)抗氧化劑藥物組合物中的含量(在多種組合使用的情況下，可以是總含量，其中各單一種類助表面活性劑之間的比例可以是任意的)一般為80%(w/w)，優(yōu)選2%70%(w/w)，優(yōu)選5%60%(w/w)οTranscutol和聚乙二醇的其它細(xì)節(jié)是已知的，例如可以參見CN1717219A，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過引用并入本文。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的促過飽和物質(zhì)在本發(fā)明菌產(chǎn)抗氧化劑藥物組合物中的含量可以如上文所述。所述的促過飽和物質(zhì)又稱沉淀抑制劑(precipitationinhibitors)或稱為抑晶物質(zhì)，其通常是指在處方中對藥物的析出起抑制作用的物質(zhì)。本發(fā)明所述的促過飽和物質(zhì)是適用于口服制劑的纖維素及其衍生物(包括水溶性纖維素及其衍生物和水溶性差的纖維素及其衍生物，例如羥丙基甲基纖維素類如羥丙基甲基纖維素、CMC-Na類如CMC-Na、甲基纖維素類如甲基纖維素、羥丙基纖維素類如羥丙基纖維素等)以及聚乙烯吡咯烷酮類如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇類(如聚乙二醇，特別是例如高分子量聚乙二醇類，例如分子量為100030000的聚乙二醇)；以及上述物質(zhì)的復(fù)合物。上述的羥丙基甲基纖維素類例如羥丙基甲基纖維素可以是它的各種具體型號的品種，例如各種分子量、各種粘度、各種聚合度、不同生產(chǎn)廠家、不同執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的品種，羥丙基甲基纖維素類的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可參見各種工具書，例如可參見羅明生，等，藥劑輔料大全，四川科學(xué)技術(shù)出版社，1995:p638-641。上述的甲基纖維素類例如甲基纖維素可以是它的各種具體型號的品種，例如各種分子量、各種聚合度、不同生產(chǎn)廠家、不同執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的品種。此外，本發(fā)明所用的促過飽和物質(zhì)還可以是甲基纖維素與羥丙基甲基纖維素的復(fù)合物，例如Metholose，包括它們的各種型號例如SH型和SM型。甲基纖維素類及其復(fù)合物的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可參見各種工具書，例如可參見羅明生，等，藥劑輔料大全，四川科學(xué)技術(shù)出版社，1995:p327-329。上述的聚乙烯吡咯烷酮類例如聚乙烯吡咯烷酮可以是它的各種具體型號的品種，例如各種分子量、各種粘度、各種聚合度、不同生產(chǎn)廠家、不同執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的品種，聚乙烯吡咯烷酮的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可參見各種工具書，例如可參見羅明生，等，藥劑輔料大全，四川科學(xué)技術(shù)出版社，1995:p805-807。上述的羥丙基纖維素類、聚乙二醇類和CMC-Na類的進(jìn)一步細(xì)節(jié)也可通風(fēng)上述文獻(xiàn)的相關(guān)章節(jié)。上述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過引用并入本文。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，根據(jù)需要其還可以含有適量選自矯味劑類、防腐劑類、抗氧劑類、增粘劑類的添加劑。所述的矯味劑類，可以改善產(chǎn)品口味，如薄荷醇、薄荷油、牛奶巧克力香精(如BFL1227型，hternationalFlavors&Fragrances公司產(chǎn)品)、山梨醇等。所述的抗氧劑類，可以提高產(chǎn)品化學(xué)穩(wěn)定性，如對羥基叔丁基茴香醚(BHA)、二叔丁基對甲苯酚(BHT)等。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以輕易地確定這些添加劑的用量。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的油選自中鏈脂肪酸甘油三酯(MCT)、油酸或其混合物。在一個實(shí)施方案中，所述的油選自辛酸/癸酸甘油酯、油酸或其混合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的表面活性劑選自吐溫80、聚氧乙烯蓖麻油如EL-35(即聚氧乙烯(35)蓖麻油)、聚氧乙烯氫化蓖麻油如RH-40(即聚氧乙烯00)氫化蓖麻油)、泊洛沙姆如F68或F108、或其混合物。在一個實(shí)施方案中，所述的表面活性劑選自吐溫80、聚氧乙烯氫化蓖麻油如RH-40(即聚氧乙烯00)氫化蓖麻油)、泊洛沙姆如F68或F108、或其混合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的助表面活性劑選自聚乙二醇類(例如分子量為200600的聚乙二醇，例如聚乙二醇-200、聚乙二醇-400、聚乙二醇-600)、Transcutol、異丙醇、1，2_丙二醇、或其混合物。在一個實(shí)施方案中，所述的助表面活性劑選自聚乙二醇-200、聚乙二醇lOOJranscutol、異丙醇、或其混合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述的促過飽和物質(zhì)選自羥丙基甲基纖維素類如羥丙基甲基纖維素、CMC-Na類如CMC-Na、甲基纖維素類如甲基纖維素、羥丙基纖維素類如羥丙基纖維素等、以及聚乙烯吡咯烷酮類如聚乙烯吡咯烷酮、或其混合物。在一個實(shí)施方案中，所述的促過飽和物質(zhì)選自羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、或其混合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述油為棉籽油，表面活性劑為泊洛沙姆，助表面活性劑為異丙醇，以及促過飽和物質(zhì)為聚乙烯吡咯烷酮。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述油為油酸與辛酸/癸酸甘油酯的混合物，表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油，助表面活性劑為聚乙二醇400，以及促過飽和物質(zhì)為羥丙基甲基纖維素。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述油為大豆油，表面活性劑為吐溫80，助表面活性劑為聚乙二醇400，以及促過飽和物質(zhì)為甲基纖維素。根據(jù)本發(fā)明其中所述油為辛酸/癸酸甘油酯，表面活性劑為吐溫60，助表面活性劑為1，2-丙二醇，以及促過飽和物質(zhì)為羥丙基甲基纖維素。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述油為辛酸/癸酸甘油酯，表面活性劑為吐溫60，助表面活性劑為1，2_丙二醇，以及促過飽和物質(zhì)為羥丙基甲基纖維素。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其為透明或基本上透明的液體狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其與水性介質(zhì)(例如，但不限于，水、0.9%氯化鈉溶液、5%葡萄糖溶液、格林氏溶液、果汁例如檸檬汁、胃液、模擬胃液、腸液、模擬腸液、胃腸液、模擬胃腸液等)接觸時(shí)可以形成具有平均直徑不到IOOOnm的乳化微粒，優(yōu)選形成具有平均直徑為IOnmIOOOnm的乳化微粒，優(yōu)選形成具有平均直徑為IOnm600nm的乳化微粒，優(yōu)選形成具有平均直徑為IOnm500nm的乳化微粒，優(yōu)選形成具有平均直徑為IOnm400nm的乳化微粒，優(yōu)選形成具有平均直徑為IOnm300nm的乳化微粒，優(yōu)選形成具有平均直徑為IOnm200nm的乳化微粒。由此與水性介質(zhì)接觸可以獲得自乳化的微乳制劑，例如本發(fā)明的藥物組合物可以在胃和/或腸液或者模擬胃和/或腸液中通過胃和/或腸的生理蠕動而自身乳化，形成具有上述平均直徑的乳化微粒。本發(fā)明將菌產(chǎn)抗氧化劑制成自乳化油劑組合物，加入水后可形成乳劑。但在常規(guī)例如現(xiàn)有技術(shù)已知的情況下，菌產(chǎn)抗氧化劑在水中溶解度很低，在制劑制造、儲存、運(yùn)輸和使用等過程中特別是在水稀釋條件下容易結(jié)晶析出，從而使藥物吸收下降，本發(fā)明在自乳處方中添加如本文所述的水溶性纖維聚合材料或其他聚合物等促過飽和物質(zhì)，使藥物在胃腸道內(nèi)達(dá)到過飽和狀態(tài)，延緩藥物在體內(nèi)析晶沉淀，使體系在表面活性劑用量較低的條件下保證藥物以溶解的分子態(tài)存在。這種添加了促過飽和物質(zhì)的釋藥系統(tǒng)可以稱為過飽和自微iL釋藥系統(tǒng)(SupersaturatableSelf-microemulsifyingDrugDeliverySystem,S-SMEDDS)。S-SMEDDS將難溶性藥物包裹于自微乳中，與傳統(tǒng)自乳化制劑相比，使藥物在制劑制造、儲存、運(yùn)輸和使用等過程中以及在胃腸液稀釋下以穩(wěn)定的分子態(tài)存在，抑制晶體析出，不但提高藥物溶出的速率，促進(jìn)吸收，而且吸收穩(wěn)定、均勻，并且大大提高了臨床用藥的安全性，降低毒副作用?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中用于制備藥物制劑的技術(shù)特別是自微乳技術(shù)的常規(guī)方法，制備本發(fā)明的菌產(chǎn)抗氧化劑的具有自微乳功能的藥物組合物以及進(jìn)一步的如上文所述的制劑。例如，將菌產(chǎn)抗氧化劑或其類似物與適合的所述油、表面活性劑、助表面活性劑和促過飽和物質(zhì)混合，制備得到本發(fā)明的菌產(chǎn)抗氧化劑藥物組合物。將該菌產(chǎn)抗氧化劑藥物組合物裝入硬膠囊或軟膠囊，可進(jìn)一步得到本發(fā)明的菌產(chǎn)抗氧化劑硬膠囊或軟膠囊制劑。在本文的上下文中，提及物質(zhì)的重量百分?jǐn)?shù)時(shí)，或者提及的計(jì)量單位例如“％(w/w)”時(shí)，除非另有說明，所述百分?jǐn)?shù)(％)或者“％(w/V)”是各物質(zhì)重量占藥物組合物總重量的百分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)計(jì)算的。除非另外明確指出，否則本申請中出現(xiàn)的“百分比(％)”是指重量百分比，并且在本發(fā)明的一個具體制劑的實(shí)施方案中，活性成分和輔料的重量百分比之和等于100%；或者以其中的某一基礎(chǔ)賦形劑進(jìn)行平衡，例如根據(jù)處方總組成，在配制時(shí)采用一種基礎(chǔ)賦形劑例如油進(jìn)行平衡(例如以該油加至理論處方的全重量或全體積來平衡)。研究結(jié)果表明，本發(fā)明包含菌產(chǎn)抗氧化劑的具有自微乳性能的藥物組合物的溶出效果好，生物利用度高，因此口服劑量較小，在一定程度上降低了毒副作用，并且制劑在制造、儲存、運(yùn)輸和使用等過程中具有良好的穩(wěn)定性。本發(fā)明微生物來源的抗氧化劑制備方法，采用具有較高抗氧化活性的青霉JTLR-I作為微生物來源；本發(fā)明中的制備方法可以除去較多雜質(zhì)，且得到的抗氧化劑比現(xiàn)有提取方法濃縮了至少6倍以上，可見抗氧化活性高。具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。一、抗氧化劑的制備例1)將2環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2S04除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在3540°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；3)取Ig無水提取物溶解于65mL乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為5mL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；4)按體積比20100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為3mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，棄去洗脫液；幻按體積比60100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為3mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，收集洗脫液，在4550°C下減壓除去溶劑，得到具有抗氧化作用的提取物，其中，步驟2中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加Ilml蒸餾水，步驟2中水層與萃取溶液的體積比為11.5，步驟3中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為135，硅膠的粒徑為20μπι50μπι。以上制備例獲得的抗氧化劑的抗氧化能力以IC50值表示為4.23μg/mL。本制備例獲得的細(xì)菌來源的抗氧化劑(在本文中可稱為菌產(chǎn)抗氧化劑)用于以下實(shí)施例制備本發(fā)明組合物。在用以上方法經(jīng)另外的三次平行制備操作中，IC50值分別為4.18μg/mL,4.40μg/mL,~4.61μg/mL。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，改變上述步驟幻、步驟4)和步驟幻的任意一個或多個條件，使這些條件限定的參數(shù)偏離本發(fā)明第一實(shí)施方案所限定的參數(shù)，其結(jié)果IC50值大于28μg/mL。二、抗氧化劑清除DPPH自由基能力的測定方法用無水乙醇配置6.5X10-5mol/LDPPH溶液，另將本發(fā)明所得抗氧化劑和化學(xué)合成抗氧化劑BHT溶于無水乙醇配制成系列濃度溶液作為樣液；精確吸取2.5mLDPPH溶液和0.5mL樣液搖勻，室溫避光放置反應(yīng)IOmin后倒入光徑Icm比色皿517nm下測定吸光值；重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值；然后按下式計(jì)算DPPH自由基清除率，抗氧化劑清除自由基能力采用清除DPPH的IC50值表示，即DPPH自由基清除率為50%時(shí)所對應(yīng)的抗氧化劑溶液濃度；清除率(％)=[I-(Ai-Aj)/AO]X100%，其中AO為2.5mLDPPH溶液+0.5mL無水乙醇，Ai為2.5mLDPPH溶液+0.5mL樣液，Aj為2.5mL無水乙醇+0.5mL樣液。三、制備藥物組合物的實(shí)施例部分實(shí)施例1.本發(fā)明菌產(chǎn)抗氧化劑藥物組合物(軟膠囊或硬膠囊制劑)的組成及制備處方組成權(quán)利要求1.制備細(xì)菌產(chǎn)的抗氧化劑的方法，該方法包括以下步驟1)將12環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在3540°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；3)取Ig無水提取物溶解于6070mL乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為56mL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；4)按體積比20100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為2.55mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，棄去洗脫液；5)按體積比60100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為2.55mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，收集洗脫液，在4550°C下減壓除去溶劑，得到具有抗氧化作用的提取物；其中，步驟2中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加10-12mL蒸餾水，步驟2中水層與萃取溶液的體積比為11.5，步驟3中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為13540，硅膠的粒徑為20μπι50μπι。2.一種抗氧化劑，其是通過包括以下步驟的方法制備的1)將12環(huán)青霉JTLR-I接種于PDA固體培養(yǎng)基，在下培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)接于裝有200mL察氏培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)物過濾后取固形菌絲，然后用液氮反復(fù)凍融并研碎后，加入蒸餾水形成過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的流體，再用正己烷萃取，直至正己烷萃取液無色后取水層加入萃取溶劑進(jìn)行萃取，萃取三次，合并三次萃取液，然后加入無水Na2SO4除水，過濾去除固形物后得到提取液，再在3540°C下減壓除去溶劑，得到無水提取物；3)取Ig無水提取物溶解于6070mL乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，上樣流速為56mL/min，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；4)按體積比20100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，然后洗脫硅膠，洗脫流速為2.55mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，棄去洗脫液；5)按體積比60100將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，繼續(xù)洗脫硅膠，洗脫流速為2.55mL/min，洗脫體積為硅膠體積的15倍，收集洗脫液，在4550°C下減壓除去溶劑，得到具有抗氧化作用的提取物；其中，步驟2中蒸餾水的加入量為每Ig研碎后物質(zhì)加10-12mL蒸餾水，步驟2中水層與萃取溶液的體積比為11.5，步驟3中上樣的量按無水提取物質(zhì)量計(jì)，無水提取物與硅膠的質(zhì)量比為13540，硅膠的粒徑為20μπι50μπι。3.—種藥物組合物，其中包含權(quán)利要求2所述菌產(chǎn)抗氧化劑、表面活性劑、助表面活性劑、促過飽和物質(zhì)和油。4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述的菌產(chǎn)抗氧化劑重量占該藥物組合物重量的10%30%。5.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述的表面活性劑重量占該藥物組合物重量的15%35%。6.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述的助表面活性劑重量占該藥物組合物重量的10%35%。7.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述的促過飽和物質(zhì)重量占該藥物組合物重量的10%。8.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述的油的量是加至該組合物重量的100%。9.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中以該藥物組合物的重量計(jì)，其中菌產(chǎn)抗氧化劑的含量為15%25%，表面活性劑的含量為20%30%，助表面活性劑的含量為15%30%，促過飽和物質(zhì)的含量為1.5%3%，以及加至100%量的油。10.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述的油是含818個碳原子的中和/或長鏈脂肪酸甘油酯。全文摘要本發(fā)明公開了細(xì)菌產(chǎn)的抗氧化劑及其藥物組合物。所述抗氧化劑是通過包括以下步驟的方法制備的1)將環(huán)青霉JTLR-1接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)，收集液體發(fā)酵培養(yǎng)物；2)制備無水提取物；3)取無水提取物溶解于乙酸乙酯，得無水提取物乙酸乙酯溶液，然后上樣于硅膠填料，棄去流經(jīng)硅膠填料的乙酸乙酯溶液；4)將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，洗脫硅膠，棄去洗脫液；5)將乙酸乙酯溶液和無水乙醇混合，洗脫硅膠，減壓除去溶劑，得到具有抗氧化作用的提取物。本發(fā)明抗氧化劑的制備方法具有產(chǎn)品抗氧化能力高的特點(diǎn)。文檔編號A61K36/06GK102258541SQ20111019143公開日2011年11月30日申請日期2011年7月8日優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日發(fā)明者劉利群,鄒積宏,金濤申請人:黑龍江大學(xué)