專利名稱：抗原組合物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明主要涉及脂質(zhì)用于制備抗原組合物的用途，特別是制備活的細菌疫苗的用途，及使用該組合物使動物免疫的方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)人和動物的病原體，包括那些引起肺結(jié)核(TB)的病原體，可通過粘膜表面引發(fā)感染。因此，對抗這些病原體的保護性免疫可能需要強粘膜免疫反應的誘導。然而，在非腸道免疫后的粘膜免疫反應一般較弱。盡管對保護粘膜位點的疫苗，特別是TB疫苗有著明顯的需要，但當前使用的疫苗是通過皮內(nèi)或皮下注射使用的。因而人們希望開發(fā)更有效的組合物，和/或可選擇途徑的疫苗給藥系統(tǒng)。特別是口服疫苗具有許多優(yōu)點，包括易于服用，并以粘膜免疫反應為目標。盡管如此，能夠?qū)游锖腿颂峁┱衬ず?或系統(tǒng)免疫的口服疫苗到目前為止大多是無效的。這種疫苗的功效受到在其通過腸道時疫苗退化的影響。特別是大多數(shù)抗原化合物具有肽鍵，其很容易被腸道中的胃酶和蛋白酶分解。許多疫苗依賴于有機體凍干制劑的使用。例如，目前使用的人TB疫苗以被稱為卡介苗(BCG)的活減毒細菌的凍干制劑為基礎。然而，已表明凍干過程可導致BCG活性損失 30-50%并損害剩余活細菌的恢復(7)?？稍谑褂们笆褂袡C體保持較大活性的組合物將極大地提高疫苗的功效。為改善免疫反應，抗原與許多佐劑混合以刺激免疫原性。這些佐劑主要是明礬和水包油型乳化液。后一類以弗氏(Freimd's)礦物油佐劑為代表。然而，在人和脊椎動物疫苗中使用弗氏完全佐劑(FCA)是不可取的，因為已有毒性反應的報道?；谶@些理由，弗氏佐劑可能也不適用于口服。在其它的水包油型乳化液中因為油含量高，所以需要表面活性劑。表面活性劑的清潔性使它們不適用于腸道或口服使用。另外，甚至對于被批準使用的表面活性劑也有毒性反應的報道。乳化液其它的缺點在于其是一種液體分散于另一種液體中時不能混溶的異質(zhì)系統(tǒng)，該系統(tǒng)是不穩(wěn)定的，并且水相隨時間發(fā)生分離，這對使疫苗保持在穩(wěn)定的懸浮液中造成困難。此外，防止在油包水型乳化液的水相中截留的抗原免于降解是不可能的。也研究了脂質(zhì)體和脂質(zhì)囊泡在疫苗上的使用，特別是對容易膠囊化的較小抗原成分而言。通常，脂質(zhì)體和脂質(zhì)囊泡對于較大抗原如活的微生物的膠囊化是無效的。另外，脂質(zhì)體和脂質(zhì)囊泡生產(chǎn)成本高且生產(chǎn)耗時，并且在它們的制備中所用的提取過程可能導致疫苗制劑化學結(jié)構(gòu)或活性改變，因此導致疫苗免疫原性的改變。例如，受熱和溶劑可能改變抗原成分如蛋白質(zhì)的生物學完整性。因此本發(fā)明的目的是提供一種抗原組合物和/或給藥系統(tǒng)，其可解決這些需要或至少為公眾提供一種有用的選擇。發(fā)明概述因此，在第一個方面本發(fā)明提供一種抗原組合物，其包含脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分，該抗原成分包含活的有機體。
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優(yōu)選地，該脂質(zhì)制劑是固體形式。在另一個方面本發(fā)明提供一種抗原組合物，其包含在10°C或以上時為固體形式的脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分。優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物中使用的脂質(zhì)制劑包含長鏈脂肪酸。在脂肪酸組分方面，優(yōu)選的脂質(zhì)制劑包含40% -100%，優(yōu)選為60% -100%，更優(yōu)選為80 % -100 %，再更優(yōu)選為90 % -100 %的C16和/或C18脂肪酸。更優(yōu)選的組合物含有脂質(zhì)制劑，該脂質(zhì)制劑包含少于35%，優(yōu)選少于25%，更優(yōu)選少于10%的Cw或更短的脂肪酸。在一種實施方案中，脂質(zhì)制劑包含20 % -60 %的飽和脂肪酸；25%-60%的單不飽和脂肪酸；及0. 5% -15%的多不飽和脂肪酸。在特別優(yōu)選的組合物中，脂質(zhì)制劑包含35 % -50 %的飽和脂肪酸；40%-55%的單不飽和脂肪酸；及5%-9%的多不飽和脂肪酸。在本發(fā)明中所用的通常優(yōu)選的脂質(zhì)制劑具有以下配方3%的肉豆蔻酸的棕櫚酸；15%的硬脂酸；40%的油酸；及6%的亞油酸。抗原成分可以是蛋白質(zhì)、糖蛋白質(zhì)、肽、或者具有蛋白質(zhì)或肽成分的因子。在一種實施方案中，抗原成分包含活的有機體。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物中的活的有機體是細菌，特別是非病原性細菌，更優(yōu)選屬于分支桿菌屬的細菌。本發(fā)明中使用的特別優(yōu)選的分支桿菌是牛型結(jié)核菌(Mycobacterium bovis)BCG。在一種實施方案中，組合物包含至少兩種抗原成分。第一種優(yōu)選為活的有機體，而第二種抗原成分優(yōu)選取自傳染媒介或者是弱免疫原性的蛋白質(zhì)或肽。在另一個方面，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明的抗原組合物的方法，該方法包括將抗原成分與脂質(zhì)制劑混合。在另一個方面，本發(fā)明還提供一種使動物免疫的方法，該方法包括對所述的動物使用本發(fā)明的抗原組合物。在另一個方面，本發(fā)明提供一種刺激動物中粘膜免疫反應的方法，該方法包括對所述的動物使用本發(fā)明的抗原組合物。 在這些方法中該組合物的使用優(yōu)選通過口服途徑。本發(fā)明還涉及脂質(zhì)制劑在制備本發(fā)明的抗原組合物中的用途。附圖簡要說明現(xiàn)在將參照附圖對本發(fā)明的各方面進行描述，其中

圖1，脂質(zhì)制劑的脂肪酸組分。按照標準方案用氣相色譜分析脂質(zhì)。各脂質(zhì)的脂肪酸組分以總脂肪酸組分的百分比表示。圖2，配制且儲存在4°C (2a)或室溫(10_25°C ) (2b)的脂質(zhì)中后BCG的活性。BCG 制劑被加溫到37°C并在7H9肉湯中乳化。通過將連續(xù)10倍稀釋的各乳化液接種到7H11瓊脂平板上確定活的有機體的數(shù)目。在培養(yǎng)2-3周后確定制劑介質(zhì)的CFU/ul數(shù)目。結(jié)果表示的是兩次試驗的結(jié)果且用平均數(shù)表示。圖3，在口服不同劑量的按配方配制的M.bovis BCG疫苗后的牛PPD誘導的IFN-γ 反應。小鼠在口服按配方配制的M.bovis BCG(圓形)、非按配方配制的M.bovis BCG(三角形)或僅用制劑材料(菱形)后第8周處死。脾細胞用牛PPD孵育72小時，然后收集上清液并用夾心ELISA法進行分析。每個處理組包含6只小鼠，脾被單獨地處理。結(jié)果以pg/ml 表示，并用三次測定的平均值表示。豎條表示標準誤差。圖4，在BALB/c小鼠中對M.bovis BCG疫苗抗原誘導的脾IFN-γ反應。在皮下注射IO6CFU的Μ. bovis BCG疫苗(方形)、口服IO7CFU的按配方配制的M. bovis BCG疫苗 (圓形)、非按配方配制的M. bovis BCG(三角形)或僅用制劑材料(菱形)后的第2、4、6 和8周無痛處死小鼠。脾細胞用牛PPD孵育72小時，然后收集上清液并用夾心ELISA法進行分析。每個處理組包含5-6只小鼠，脾被單獨地處理。第8周的結(jié)果來自2個分離的試驗，P值< 0. 05 (Student t檢驗)。豎條表示標準誤差。圖5，與非粘附腹膜漿細胞(NPEC)共培養(yǎng)的巨噬細胞對M. bovis的生長抑制。用 M. bovis以每個巨噬細胞兩個細菌的MOI感染巨噬細胞，非粘附的自體同源NPEC按每個巨噬細胞10 NPEC的比率加入。在感染后72小時對[3H]尿嘧啶混合進行分析。不含M. bovis 的細胞培養(yǎng)的平均[咕]尿嘧啶攝入是460cpm。共培養(yǎng)巨噬細胞和NPEC的細胞內(nèi)細菌的生長用三次的平均值表示。結(jié)果代表兩個試驗。*表示與僅含制劑材料的對照組的平均值有顯著差異的平均值；豎條表示標準誤差。圖6，負鼠口服接種按配方配制的BCG對體外外周血淋巴細胞對PPD-B的母細胞化反應(blastogenic response)的影響。按配方配制的BCG -— ；非按配方配制的 BCG ■ — ■；非接種的對照X--X ；結(jié)果以平均刺激指數(shù)(Si)表示。*表示與非接種的對照組的平均值有顯著差異的平均值。豎條表示SE。圖7，口服接種按配方配制的BCG對用M. bovis進行免疫性實驗的負鼠的體重的影響。平均體重變化在從進行免疫性實驗到處死的時間內(nèi)確定。進行免疫性實驗前的負鼠的平均體重是3.0士0.07(士SE) kg。豎條表示SE。圖8，口服接種按配方配制的BCG對用M. bovis進行免疫性實驗的負鼠的肺重量的影響。平均肺重量在處死時確定。為使隨體重變化的肺重量差異標準化，將各動物的肺重量與體重相比并表示為比率。*表示與非接種的對照組的平均值有顯著差異的平均值；豎條表示SE0圖9，負鼠口服接種按配方配制的BCG對用M. bovis進行免疫性實驗后的從肺分離的分支桿菌平均數(shù)的影響。結(jié)果以CFU(Iogltl)/g組織的幾何平均數(shù)表示。*表示與非接種的對照組的平均值有顯著差異的平均值；豎條表示SE。圖10，負鼠口服接種按配方配制的BCG對用M. bovis進行免疫性實驗后的從脾分離的分支桿菌平均數(shù)的影響。結(jié)果以組織的CFU(Iogltl)/g的幾何平均數(shù)表示。*表示與非接種的對照組的平均值有顯著差異的平均值；豎條表示SE。圖11，對四種口服脂質(zhì)BCG制劑或皮下接種的免疫反應的比較。圖中顯示了接種 (第0周)和進行免疫性實驗(第8周)后對負鼠的體外外周血淋巴細胞對PPD-B的母細胞化反應的影響。結(jié)果表示為平均刺激指數(shù)(Si)。
圖12為本發(fā)明的普通疫苗給藥系統(tǒng)的示意圖。詳細說明因此，在第一個方面，本發(fā)明提供一種抗原組合物，其包含脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分，該抗原成分包含活的有機體。優(yōu)選地，脂質(zhì)為固體形式。適宜的是在10°C或以上為固體形式的脂質(zhì)。在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗原組合物，其包含在10°C或以上時為固體形式的脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分。在上述制劑中采用的脂質(zhì)優(yōu)選適于動物或人體食用，并可以廣泛地從天然的(來自于植物或動物)或合成的脂質(zhì)產(chǎn)品中選取，包括油、脂和蠟。最一般的情況是脂質(zhì)材料在高于約30°C的溫度下為液體，也就是說應選擇在將脂質(zhì)給藥、最通常是將脂質(zhì)口服給藥的動物的生理溫度下可達到熔點的脂質(zhì)。理想地，脂質(zhì)在大氣壓下在10-30°C下為固體形式，優(yōu)選在大氣壓下在20°C -30°C時仍為固體。然而脂質(zhì)的熔化溫度不是唯一的，并且包括具有熔化溫度范圍的油、脂和蠟。本文優(yōu)選使用的脂質(zhì)在約30°C和約37°C的生理溫度之間會發(fā)生從固相到液相的轉(zhuǎn)變。從本領域技術(shù)中可得到脂相行為的總結(jié)，例如參見(10)。因此，有經(jīng)驗的讀者能夠根據(jù)本領域的信息和簡單的試驗來選擇具有所需要特性和熔點的脂質(zhì)。適宜的脂質(zhì)制劑是包括羧酸甘油酯在內(nèi)的甘油三酸酯、由脂肪鏈和-COOH末端組成的化合物、飽和與不飽和的脂肪酸、及其混合物。當前優(yōu)選的脂質(zhì)主要是含有C8-C2tl?；母视腿狨?，例如肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、parinic、月桂酸、亞麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸或其混合物。現(xiàn)已確定，對于在本發(fā)明中可用的脂質(zhì)制劑，優(yōu)選的是較長鏈的脂肪酸，例如 C16-CliJg肪酸。已發(fā)現(xiàn)長鏈脂肪酸對有機體的保護更有效，如給予小鼠和負鼠的疫苗中的 BCG。如此看來，在本發(fā)明中優(yōu)選使用的脂質(zhì)制劑包含40% -100%，優(yōu)選為60% -100%, 優(yōu)選為80% -100%，更優(yōu)選為90% -100%的C16和/或C18脂肪酸。一般Q6脂肪酸占總脂肪酸含量的10% -40%，更優(yōu)選為20% -35 %，再更優(yōu)選為25% -32%，而C18脂肪酸占總脂肪酸含量的40% -90%，優(yōu)選為50% -80%，更優(yōu)選為 60% -70%。優(yōu)選的脂質(zhì)制劑還包含少于35%，優(yōu)選少于25%，更優(yōu)選少于10%的C14或更短的脂肪酸。從鏈長度來看，優(yōu)選的脂質(zhì)制劑包含少于5%的C14或更短的脂肪酸，25% -32%的 C16脂肪酸和60% -70%的C18脂肪酸。從它們的脂肪酸含量來看，在本發(fā)明中使用的脂質(zhì)制劑包含20% -60%，優(yōu)選為 30% -55%，更優(yōu)選為40% -50%的飽和脂肪酸；25% -60%，優(yōu)選為30% -60%，更優(yōu)選為 40% -55%的單不飽和脂肪酸；及0. 5% -15%，優(yōu)選為3% -11 %，更優(yōu)選為5% -9%的多不飽和脂肪酸。在本發(fā)明中使用的特別優(yōu)選的脂質(zhì)制劑包含40% -50%的飽和脂肪酸， 40% -50%的單不飽和脂肪酸，及5% -9%的多不飽和脂肪酸。在本發(fā)明中使用的通常優(yōu)選的脂質(zhì)制劑按HPLC分析測定，具有以下配方3%的肉豆蔻酸，26 %的棕櫚酸，15 %的硬脂酸，40 %的油酸及6 %的亞油酸。
通常優(yōu)選的脂質(zhì)制劑還包含來自于動物的分餾脂質(zhì)復合物、一種或多種氫化植物油，特別是橄欖油或椰子油、商用栓劑基本成分、其它的脂質(zhì)制劑或其混合物。脂質(zhì)制劑可用于抗原組合物的制備，及防止組合物中的抗原退化。脂質(zhì)制劑對于保持活的有機體、尤其是細菌的活性特別有用。脂質(zhì)制劑起到將有機體保持在活的而不是休眠狀態(tài)的作用。這一點對于配制成口服使用的包含活的有機體的疫苗特別重要。脂質(zhì)還可將抗原保持在均勻的懸浮液中。也就是說，在本發(fā)明的組合物中抗原成分、特別是活的有機體在整個固體或膏狀脂質(zhì)基質(zhì)中是均勻分布的。在口服時脂質(zhì)還可防止抗原受胃腸道分泌物的破壞。在通過其它途徑如皮下使用時防止受巨噬細胞的攻擊也是可能的。這使得抗原和特別是活的有機體可以通過胃腸道粘膜吸收，并隨后可以在宿主中復制?；畹挠袡C體在宿主中的復制刺激了保護性免疫反應，這一點通過用劇毒細菌進行免疫性實驗后疾病嚴重程度的降低得到了確定。適用于多種給藥途徑的制劑還可以包括添加劑，如填充劑、增量劑、粘結(jié)劑、潤濕劑、乳化劑、拋光劑、表面活性劑、助懸劑、防腐劑、著色劑、鹽、抗氧化劑，包括谷氨酸鈉 (MSG)、維生素如維生素E、丁基化羥基茴香醚(BHA)、白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(ADC)、 保護涂層、引誘劑、芳香劑、及有助于包含在脂質(zhì)中的有機體存活的試劑，但并不局限于此。保護涂層或腸衣可以從例如包括明膠在內(nèi)的凝膠、石蠟及塑膠中選擇。當選擇口服途徑時涂層還有助于防止暴露于胃酸和酶。當用于口服使用時，制劑還可以包括例如改善口味的添加劑，如調(diào)味劑(包括茴香油、巧克力和薄荷油)和甜味劑(包括葡萄糖、果糖或任何其它食糖或人造甜味劑)?？乖煞挚梢允堑鞍踪|(zhì)、糖蛋白質(zhì)、肽、或者具有蛋白質(zhì)或肽成分的因子或其混合物。這種成分可以來自可被用于在動物中產(chǎn)生免疫反應的試劑。最通常地，抗原至少帶有一個抗原決定基，其存在于對處理的動物是病原性的有機體上。也可以使用本領域公知的其它抗原結(jié)構(gòu)，例如與載體結(jié)合的多糖、糖脂和半抗原。優(yōu)選地，抗原成分是活的有機體。組合物中的活的有機體可以選自真菌、原生動物、細菌和病毒。例如，HIV、SIV、布魯氏菌和炭疽。優(yōu)選地，有機體是細菌，優(yōu)選在配制成口服或皮下給藥的組合物中使用通常選自非病原性細菌的有機體，優(yōu)選的細菌是選自分支桿菌屬的非病原性菌株，包括結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)復合體(包括結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、牛分枝桿菌 (M. bovis)、非洲分枝桿菌(M. Africanum)及田鼠分枝桿菌(M. microtii))、胞內(nèi)鳥型分枝桿菌(M. avium-intracellulare)復合體(包括胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)和鳥型分枝桿菌(M. avium))、副結(jié)核桿菌(M. paratuberculosis)、母牛分支桿菌(M. vaccae)、 恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)、龜分枝桿菌(M. chelonae)、偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuityum)、 堪薩斯分枝桿菌(M. kansaii)、麻風分枝桿菌(M. 1印rae)、海魚分枝桿菌(M. Marinum)、潰蕩分枝桿菌(M. ulcerans)、猿分枝桿菌(M. simiane)、嗜血分支桿菌(M. haemophilum)、摩爾分支桿菌(M. malmoense)、石氏分枝桿菌(M. shimoidei)、胃分支桿菌(M. gastri)、地分支桿菌復合體(M. terrae complex)和無色分枝桿菌(M. nonchromogenicum)。在特別優(yōu)選實施方式中該試劑為卡介苗(BCG)，其是M. bovis的減毒株，包括下列菌株83/6235, Pasteur 1173P2, Glaxo 1077, Japanese 172, Prague, Russian, Brazilian, Danish 1331, Copenhagen, Connaught,并包括這些菌株的功能等效變體和其它的M. bovis減毒株、克隆體、變異體和重組體，或者天然重組體或者通過多種基因工程技術(shù)產(chǎn)生的重組體，及其抗原成分。從前面的說明中可以理解，抗原成分是蛋白質(zhì)或肽等的復合物。在一種實施方案中，組合物包含至少兩種選自上述的抗原成分，且可能包括亞單位抗原的多種組合。三種或更多的抗原成分也是可行的。組合物中抗原成分的濃度可以按照公知的技術(shù)方案變化，只要它的量在給動物使用后能有效地刺激免疫反應，特別是在與小腸的淋巴組織相關的消化道中的免疫反應。在分支桿菌的情況下，在IXIO5到IXlOici菌落形成單位(CFU)/ml的范圍內(nèi)是適宜的。優(yōu)選該濃度為lX107 lX109CFU/ml。對于蛋白質(zhì)和肽型抗原，在10-1000 μ g/g范圍內(nèi)的制劑是適宜的。對于病毒型抗原，1 X IO3-I X IO10,優(yōu)選1 X IO5-I X IO8空斑形成單位(PFU) /ml 的范圍是適宜的。免疫反應可以是體液或細胞介導的，包括粘膜免疫反應。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及一種通過給動物使用本發(fā)明的抗原組合物而刺激動物中粘膜免疫反應的方法。該組合物可以使用本領域中已知的技術(shù)進行制備。通常如果需要可將脂質(zhì)制劑加熱至液化，再加入如上所述的抗原成分和其它組分(如果使用)?？乖M合物的分散可以通過混合、振蕩或其它對抗原成分活性沒有不良影響的技術(shù)實現(xiàn)。在本發(fā)明中使用的更優(yōu)選的組合物也基本上沒有包括水在內(nèi)的含水成分。在此使用的術(shù)語“基本上沒有”意指該組合物含有少于10%的含水成分，優(yōu)選少于5%的含水成分。如上所述，含水成分特別是水溶劑的出現(xiàn)降低了脂質(zhì)制劑的保護效應，特別是在腸道中。在一種實施方案中，抗原組合物是疫苗。在一種變化的實施方案中，抗原組合物是與疫苗一起使用以增強疫苗功效的佐劑。特別優(yōu)選含分支桿菌和含BCG的抗原組合物用作佐劑。本發(fā)明的抗原組合物也可被用于對第二種或更多的如上所述用作抗原成分的抗原分子產(chǎn)生反應，特別是對那些具有弱免疫原性的抗原成分。這可以通過將抗原分子與組合物的抗原成分結(jié)合而使本發(fā)明抗原組合物中的第二種或更多的抗原分子共同給藥來實現(xiàn)。結(jié)合可以使用標準的技術(shù)來實現(xiàn)(9)，特別地，相關抗原可以與抗原載體或佐劑通過不干擾體內(nèi)抗體生成的連接基團結(jié)合?？乖d體或佐劑可以是任何包含上述有機體的抗原成分，但優(yōu)選是分支桿菌，更優(yōu)選是BCG。適用的連接基團包括甘露糖受體結(jié)合蛋白，如卵白蛋白和與Fc受體結(jié)合的蛋白。第二種或更多的抗原分子優(yōu)選為蛋白質(zhì)或肽。特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)是免疫避孕(immimocontrac印tive)蛋白質(zhì)。脂質(zhì)再次用作給藥基質(zhì)，在圖12中給出了這種疫苗給藥系統(tǒng)的例子。當使用該組合物時，可導致對結(jié)合的分子或共同給藥分子增強的免疫反應。在本發(fā)明的另一方面中還提供了一種使動物免疫的方法，該方法包括對所述的動物使用本發(fā)明的抗原組合物。在此使用的術(shù)語“動物”指的是溫血動物，特別是哺乳動物。人、狗、貓、鳥、牛、綿羊、鹿、山羊、大鼠、小鼠、兔、負鼠、獾、豚鼠、鼬、豬和水牛是在該術(shù)語含義范圍內(nèi)的動物的例子。單胃動物和反芻動物特別符合該術(shù)語。本發(fā)明的組合物可以通過各種不同的途徑使用，包括非腸道(皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi))、粘膜、氣霧劑和口服使用，但不局限于此。在一種實施方案中，口服使用是優(yōu)選的。組合物可以以藥丸、片劑、膠囊、錠劑或其它適宜劑型的形式使用。由于避免了使用針和注射器，口服用藥被眾多使用者接受，并且對于野生動物來說是經(jīng)濟和實用的接種方法。因此在一種實施方案中申請人提供了用于口服使用的新型活疫苗。在變化的實施方案中，組合物可以被配制成通過注射進行的非腸道給藥。這種給藥形式還可以包括與身體組織相容的可注射的和皮下儲存制劑。由儲存制劑導致的延時釋放吸收可以單獨使用脂質(zhì)制劑或與另外的生物降解聚合物一起使用而獲得。儲存制劑使得抗原成分的持續(xù)釋放以一種更近似于感染過程的方式進行，從而促進在使用該組合物的動物體內(nèi)免疫反應的進行。脂質(zhì)保護效應也與這些給藥形式同時發(fā)生。組合物可以以單劑量使用，特別是對于非腸道使用，或者隨時間以重復劑量使用，例如，按分段間隔的初始劑量和加強劑量。使用劑量是由抗原成分的釋放率及其抗原性確定的。一般需考慮諸如動物的重量、年齡、性別、同時治療(如果有)等因素，要處理的抗原的特性也可能要顧及?？诜呙绲囊话銊┝糠秶缟厦娼o出的，即每劑量是 IXlO5到1 XlOici,優(yōu)選IX IO7到IXlO9CFU/千克。對于肽和蛋白質(zhì)型抗原，劑量范圍是 I-IO1OOOyg,優(yōu)選為10-1000 μ g。對于病毒型抗原，劑量范圍是1 X IO3-I X 101(1，優(yōu)選為 1 X IO5-I X 108PFU/ml。不管采用哪種給藥方式，當在疫苗制劑中使用活的有機體時，都預期它們可在宿主體內(nèi)繁殖以促進免疫反應。組合物也可以被配制成用于群體接種計劃的單劑量制劑或多劑量制劑。直到需要使用前，本發(fā)明的組合物可以在一定的時間內(nèi)儲存在室溫下，或者優(yōu)選儲存在約4°C的普通冷凍條件下。在4°C時，脂質(zhì)制劑有助于處于休眠而不是活躍狀態(tài)的有機體的儲存和維持而不被破壞。對于非腸道給藥，該組合物被加熱到30-40°C以在使用前液化。對于口服使用，該組合物為固體或膏狀。應該理解，上述說明只是以實施例的方式進行說明，本領域所屬技術(shù)人員可預料到所用材料和技術(shù)兩個方面的變化?，F(xiàn)在提供用以闡明本發(fā)明的非限制性實施例。
實施例材料與方法細菌。M.bovis BCG Pasteur 1173P2 (巴斯德研究所，巴黎)用作疫苗菌株。用于巨噬細胞感染研究和負鼠免疫性實驗的M.bovis菌株是最初從刷尾(brushtail)負鼠的結(jié)核性傷口中分離出來并且先前已被用于巨噬細胞和負鼠接種研究(1，4)的M.bovis 83/6235 (AgResearch，Wallaceville，新西蘭)。對于BCG制劑和巨噬細胞感染，細菌在含有補充了白蛋白葡萄糖-過氧化氫酶(ADC;BBL，Becton Dickinson, Maryland, USA)的 Middlebrook 7H9 培養(yǎng)基(Difco,Detroit,Mich.)的 175ml 培養(yǎng)瓶(Falcon)中生長到中對數(shù)生長期(mid log phase)。通過離心收集細菌并在儲存于-70°C之前在磷酸緩沖液(PBS) 中清洗兩次。為進行負鼠免疫性實驗，M.bovis在含有補充了 0.006% ν/ν堿性油酸、0.5% w/v白蛋白片段V和0. 25% w/v葡萄糖的Dubos肉湯培養(yǎng)基(Difco實驗室，Detroit，USA) Wtween白蛋白肉湯(TAB)中生長到中對數(shù)生長期，并且通過混濁度估計細菌的數(shù)量。在 TAB中進行稀釋以對負鼠接種。BCG或M.bovis的菌落形成單位(CFU)的數(shù)目按前面所描
10述的進行測定(5)。制劑成分。根據(jù)熔化溫度和將BCG保持在均勻的懸浮狀態(tài)的能力選擇三種脂質(zhì)產(chǎn)品以配制BCG。選擇在37°C為液體而在30°C以下變成固體的脂質(zhì)以在BCG活性研究中進行測試。在活性測試后，選擇下面的三個制劑在小鼠和負鼠的口服疫苗試驗中進行測試制劑C-來自于動物的分餾復合物脂質(zhì)制劑K-由純化的氫化椰子油的甘油三酸酯組成制劑N-Novarta B，一種商品栓劑基本成分。這三種制劑通過氣相色譜進行分析以確定脂肪酸的百分率。BCG制劑。顆粒狀的BCG被再次懸浮在被加熱到37°C的制劑介質(zhì)中。BCG按 lX107CFU/ml的濃度再次懸浮以用作小鼠的疫苗，或者按lX108CFU/ml的濃度再次懸浮以用作負鼠的疫苗。為增加對負鼠的吸引力和可口性，每毫升制劑中加入IOmg的葡萄糖和10μ 1的茴香油(Pharmacare,Auckland NZ)。對于小鼠的口服疫苗，每毫升制劑中加入 IOmg的葡萄糖，Img的谷氨酸單鈉(Sigma)和10% ν/ν的ADC。這些添加劑分散于制劑脂質(zhì)中，并先前已證明對BCG的活性沒有影響。BCG制劑被轉(zhuǎn)移到15ml試管(falcon)中并允許在4°C輕輕混合以凝固。從試管中移出制劑并在無菌條件下按照活性測試和接種研究的需要分割成Ig的小球。按如下所述的通過將小球在7H11瓊脂板上培養(yǎng)和計數(shù)CFU以測試 BCG的分散。BCG活性。儲存于4°C或室溫(10_25°C)后按前述(4)測定制劑中的CFU數(shù)目。通過將三個BCG制劑的IOOmg等分試樣加熱到37°C并持續(xù)15分鐘，并在7H9肉湯中進行連續(xù)的 10倍稀釋以收集培養(yǎng)的樣品。通過將100 μ 1的每種乳化液接種在補充了油酸-ADC(0ADC ； Becton Dickinson)和0. 5%甘油的Middlebrook 7H11瓊脂板上(Difco)來測定活的有機體數(shù)目。使用玻璃涂布器分散乳化液。用石蠟密封培養(yǎng)板并在5% CO2中371孵育。菌落的數(shù)目在培養(yǎng)2-3周后計數(shù)。結(jié)果以BCG制劑的CFU/μ g表示。小鼠的接種。特定的無病原體雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)從Dunedin的Otago 大學動物實驗科學系獲得。小鼠試驗經(jīng)Otago大學動物倫理委員會批準進行(批準號 51/2000)。將小鼠分到單獨的籠中并在口服接種前斷食12小時。非配制的對照由Craig's 不含防腐劑的草莓醬(Heinz-ffatties Ltd. , Hastings, New Zealand)中的 Μ. Bovis 組成。 先前的研究表明在M小時間隔內(nèi)將Μ. Bovis BCG混在果醬中對Μ. Bovis BCG活性沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。非接種的對照只包含脂質(zhì)制劑。對于劑量反應和時間過程試驗，在24 小時的間隔內(nèi)給予小鼠兩次單獨劑量的疫苗。對于氣霧劑免疫性試驗，給予小鼠一次口服劑量(5X107CFU)或者皮下接種1X106CFU。在顆粒和果醬的消耗期間在不同的時間間隔觀察小鼠以確保它們吃了完全劑量。在接種后的不同時間點，通過吸入CO2將小鼠處死，并在無菌條件下摘除脾。脾細胞增殖測試。用細胞過濾器(70 μ m網(wǎng)孔；Beckton Dickinson)通過過濾細胞獲得脾細胞懸浮液。在0.83%的NH4Cl(pH 7. 2)中溶解紅細胞。在PBS中清洗細胞兩次并按 1 XlO6Ail再次懸浮在包含10%小牛血清(FCS)、20mM HEPES 100U/ml的青霉素、100 μ g/ml 的鏈霉素、5.巰基乙醇的Dulbeccos，s 改良 Eagles 培養(yǎng)液(DMEM) (DMEM-10% FCS，全部來自Gibco-BRL，USA)中。細胞在加入10%小牛血清(FCS)的RPMI (Gibco)中按 IOVml的濃度再次懸浮。脾細胞(每孔5 X IO5)被涂布在96孔板(Nunc)的三重孔中。細胞用最終濃度為 60 μ g/ml 的來自 Μ. bovis (bovine PPD ；CSL, Melbourne, Australia)的純化蛋白質(zhì)衍生物或僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)。4天后收集細胞，在用1 μ Ci的[3H]胸腺嘧啶(Amersham， Buckinghamshire, England)脈沖18小時后，如前所述測定混入的胸腺嘧啶(5)。通過將用牛PPD孵育的三重培養(yǎng)物的每分鐘平均計數(shù)(cpm)除以僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)的脾細胞的平均 cpm獲得刺激指數(shù)(Si)。脾細胞的細胞因子產(chǎn)率的體外測試。按如上所述的脾細胞增殖測試制備脾細胞懸浮液。Iml的細胞懸浮液被分散到24孔培養(yǎng)板(Costar)中，并將100 μ 1的PBS或者牛 PPD(60yg/ml的終濃度)加入到孔中。培養(yǎng)物在5% CO2中37°C孵育72小時，之后收集 200 μ 1的培養(yǎng)上清液并在70°C冷凍以作細胞因子分析。按照生產(chǎn)商指示使用商用試劑盒 (R&D Systems, Duoset，City, Country)進行白介素-2(IL_2)和干擾素-Y (IFN- y )的捕獲ELISAs。培養(yǎng)上清液中的細胞因子水平通過標準曲線的外插法確定。兩個ELISAs的最小靈敏度被確定為對于IFN- γ是50pg/ml，對于IL-2是35pg/ml。Μ. bovis抑制試驗。來自腹膜的巨噬細胞在與或不與自體同源淋巴細胞共培養(yǎng)后測試對M.bovis的細胞內(nèi)生長的抑制。按照前述方案的改良方法進行試驗。腹膜分泌細胞 (PEC)通過從雌性BALB/c小鼠洗胃獲得。細胞被收集在補充了 BSA和20U/ml的肝磷脂的PBS中，清洗一次，并按2 X 106/ml再次懸浮在含有10%小牛血清和100U/ml青霉素的 DMEM培養(yǎng)液(經(jīng)補充的DMEM)中。100 μ 1的細胞懸浮液被分散到96孔平板(Nunc)中。在 5% CO2中37°C孵育2小時后除去不貼壁的細胞，清洗并按5X 106/ml的密度再次懸浮在經(jīng)補充的DMEM中。通過在25ml培養(yǎng)瓶(falcon)中孵育而在其余的貼壁細胞群中選擇性耗竭不貼壁的細胞。不貼壁的PEC(NPEC)在May-GrunwaldlGiemsa染色后被確定包含> 90% 的淋巴細胞。熱的經(jīng)補充的DMEM被加入估計包含5X104細胞/孔的貼壁單層中。該細胞群對非特異性酯酶染色試劑(目錄號181-B ；Sigma, St. Louis, Mo, USA)具有98%的陽性， 此后稱作巨噬細胞。如前所述(2)用M. bovis以2個細菌/巨噬細胞的MOI感染巨噬細胞。 非吞噬的細菌通過溫和清洗除去。100μ 1 (包含5X105細胞)的自體同源NPEC加入到包含感染的巨噬細胞的各孔中，且在5% CO2中37°C下再次孵育培養(yǎng)物。選擇得到的NPEC對巨噬細胞的比為10 1的比率以模擬在外周血單核細胞中發(fā)現(xiàn)的比率。對照孔由單獨的 M. bovis感染的巨噬細胞或非感染的NPEC和巨噬細胞組成。72小時后，用1. 0 μ Ci [3H]尿嘧啶脈沖18小時。用0. 皂甙溶解細胞，且在用自動細胞收集器(Cambridge Technology, USA)將細胞收集到玻璃纖維過濾器(Whatman Inc, Finland)上之前在80_90°C加熱20分鐘殺死細菌?；烊氲腫3H]尿嘧啶的量用液體β型閃爍計數(shù)儀(Wal lac ,Country)確定。用M. bovis對小鼠進行氣霧劑免疫性實驗。每個疫苗組6只小鼠，在接種第8周用劇毒的M. bovis氣霧劑進行免疫性實驗，用Grover等在1967年公開的改良方法制備 M. bovis 83/6235的單獨細胞懸浮液并儲存在-70°C。為制備這些懸浮液，細菌細胞通過聲處理分散30秒，并通過8 μ m薄膜過濾器過濾。小鼠使用氣霧劑室通過呼吸途徑感染，氣霧劑室可產(chǎn)生大小適合于進入肺泡空間的微滴核。霧狀液體中活的M. bovis的濃度按經(jīng)驗調(diào)節(jié)以使每個小鼠的肺吸入并保持5-20個活的有機體(B. Buddie and G. de Lisle，未公布資料)。相似的過程已證明得到對豚鼠肺的可重復均勻的感染。氣霧劑感染和隨后的保持及感染小鼠的處理是在生物危害性設備的嚴格隔離條件下進行的。M. bovis的分離。在進行氣霧劑免疫性實驗后的37-40天處死小鼠。為分離分支桿菌每個小鼠的肺和脾被單獨地處理。器官在Ten-Broeck研磨器中勻漿化，且樣品在3500g離心20分鐘。沉淀物再次懸浮在Iml的蒸餾水中，在TAB中制得適量的稀釋液，且0. Iml稀釋或未稀釋的樣品被接種在改良的分支桿菌7H11瓊脂上(1)。對各稀釋液重復制備兩個。 培養(yǎng)條件和分離物的鑒別方法按如前所述的進行(1)。數(shù)據(jù)的分析。平均細胞因子水平的差異和對疫苗組的脾細胞增殖反應轉(zhuǎn)化成Iogltl 的統(tǒng)計分析使用Mudent t檢驗確定。從肺和脾的細菌計數(shù)被轉(zhuǎn)化成Iogltl并用方差分析進行分析。為進行統(tǒng)計，當沒有從組織中培養(yǎng)細菌時，采用最小可檢測數(shù)的一半(％CFU/器官)。負鼠的接種和免疫性實驗。如前所述捕捉負鼠并籠養(yǎng)⑷。用BCG喂飼兩組負鼠 (5只/組)。Ig的顆粒狀配制的BCG(1X IO8CPU)被給予一組中的每個負鼠，第二組被給予果醬中的BCG(IX IO8CPU)以與配制過程中的對照。預先證明果醬不抑制BCG活性(數(shù)據(jù)未顯示)。第三組(6只/組)被給予只包含制劑介質(zhì)的顆粒并作為非接種的對照。在顆粒消耗期間觀察負鼠以確認吃入全部顆粒。第二天重復接種(總BCG劑量2X108CFU/負鼠)。 所有負鼠在接種后41天通過氣霧劑途徑進行免疫性實驗。在第二個試驗中，四種口服脂質(zhì)BCG制劑與皮下接種比較。每個疫苗組的6只負鼠在接種8周后通過用劇毒的M. bovis通過氣霧劑進行免疫性實驗。脂質(zhì)C，K，N和F (包含10%小牛血清的一種改良的K)。用M. bovis對負鼠進行氣霧劑免疫性實驗。負鼠用M. bovis 83/6235進行免疫性實驗，其最初是從TaumaranuLNew kaland負鼠的淋巴結(jié)分離的(5)。分離物的單獨的細胞懸浮液使用Grover等在1967所公開的改良方法制備并儲存在_70°C。為制備這些懸浮液，細菌細胞通過聲處理分散30秒，并通過8 μ m薄膜過濾器過濾。通過肌肉注射鹽酸氯胺酮(30mg/kg ;Parnell Laboratories, Auckland, New Zealand)麻醉負鼠,使用氣霧劑室通過呼吸途徑感染，氣霧劑室可產(chǎn)生大小適合于進入肺泡空間的微滴核。霧狀液體中活的 Mbovis的濃度按經(jīng)驗調(diào)節(jié)以使每個負鼠的肺吸入并保持10-20個活的有機體(B.Buddie and G. de Lisle，未公布)。這種免疫性實驗的劑量已預先從在感染后4周的非接種負鼠的肺中可大致觀察到的初期結(jié)節(jié)的數(shù)目估測。相似的過程已證明得到對豚鼠肺的可重復均勻的感染(ffiegeshaus et al. , 1970 ；Smith et al.，1970)。氣霧劑感染和隨后的保持及感染小鼠的處理是在生物危害性設備的嚴格隔離條件下進行的。負鼠的尸檢。所有負鼠在進行免疫性實驗后的56 57天處死，并進行廣泛的總尸檢。肺與周圍組織分離并稱重。從負鼠組織分離M. bovis。對于每個動物，肺和脾的樣品各稱取約lg，樣品從肉眼可見的損傷處獲取，如果沒有損傷，樣品從器官的預定部分獲取，并為分離分支桿菌而進行單獨處理。稱重樣品，在Ten-Broeck研磨器中勻漿并在0. 75%的氯化十六烷基吡啶鐺中凈化1小時。樣品在3500g離心20分鐘，且沉淀物再次懸浮在Iml的蒸餾水中。在TAB中制得適量的稀釋液，且0. Iml稀釋或未稀釋的樣品被接種在改性的分支桿菌7H11瓊脂板上。 對各稀釋液重復制備兩個。培養(yǎng)條件和分離物的鑒別方法按如前所述的進行(1)。負鼠外周血淋巴細胞增殖試驗。用排除了紅血細胞的全血測定對PPD-B和 PPD-A(CSL Limited, Parkville, Australia)的增殖反應。對 Con A 的反應也被測試。簡言之，Iml的肝素化血與pH 7. 2的50ml 0. 17M Tris-0. 16M NH4Cl在37°C混合10分鐘，在 200C的PBS中清洗兩次，并在補充了 2mM谷酰胺和2%正常負鼠血清的DMEM組織培養(yǎng)基中調(diào)到:3ml。細胞QOO μ 1)被涂布在于PBS中含有50 μ 1 PPD-B、PPD-A或Con A或單獨PBS 的平底96孔板中，以得到60 μ g/ml PPD或5 μ g/ml Con A的終濃度。平板被放在5% CO2 的空氣孵育器中72小時，用1 μ Ci/孔的3H-胸腺嘧啶(Amersham，UK)脈沖，再18小時后收集，并在Micro Beta Trilux (ffallac,Finland)中進行3H計數(shù)。通過將用PPD刺激的三重培養(yǎng)物的每分鐘計數(shù)(cpm)除以用培養(yǎng)基和PBS培養(yǎng)的三重培養(yǎng)物的cpm計算刺激指數(shù) (Si)。數(shù)據(jù)的分析。小鼠細胞因子分泌物的統(tǒng)計顯著差異使用Mudent t檢驗確定 (GraphPad, San Diego, Calif. ) 0將這些研究進行兩次而具有相似的結(jié)果。對于負鼠淋巴細胞增殖反應，> 3. 5的刺激指數(shù)被記為陽性反應，因為這表示在背景平均值(接種之前 PPD-B的平均Si)之上的至少三個標準差的反應。不同處理組負鼠的體重改變、肺重量、淋巴細胞增殖反應和細菌計數(shù)通過單次方差分析進行初始比較。然后用Duncan’ s多重檢驗比較各組的平均值。淋巴細胞增殖反應和從肺和脾得到的細菌計數(shù)在分析之前轉(zhuǎn)化成 Log100為進行統(tǒng)計，當沒有從組織中培養(yǎng)細菌時，采用最小可檢測數(shù)的一半(％ CFU/器官)。結(jié)果A.脂質(zhì)制劑的脂肪酸成分。選擇用于配制口服BCG的脂質(zhì)進行氣相色譜分析。圖 1顯示了在小鼠和負鼠接種試驗中使用的3種脂質(zhì)的脂肪酸成分。在三種脂質(zhì)制劑中脂肪酸的相對百分比如圖1所示。通過HPLC對脂質(zhì)的化學分析表明三種制劑包含下述的脂肪酸混合物制劑C89%總脂質(zhì)5 %中性，40. 5 %極性-包括3 %肉豆蔻酸，26 %棕櫚酸，15 %硬脂酸，40%油酸和6%亞油酸)。制劑K47%月桂酸，20%肉豆蔻酸，12%棕櫚酸，12%硬脂酸和3%油酸。制劑NNovarta B是一種商用栓劑基本成分，由酯化、氫化的分餾植物油和甘油三酸酯的混合物組成，包括44 %月桂酸，20 %肉豆蔻酸，16 %棕櫚酸，19 %硬脂酸。B.配制后的BCG活性。配制的BCG在儲存于4°C后的活性如圖加所示。在16周后，制劑C和K保持高水平的BCG活性，其中制劑C與制劑K (52% )相比顯示較高的活性維持率(98%)。相比而言，制劑N顯示BCG活性逐漸喪失，導致16周后超過97%的活的有機體損失。這些結(jié)果表明與制劑N相比，制劑C和K更適于在4°C保持BCG活性。配制的BCG在儲存于室溫(10_25°C )后的活性如圖2b所示。制劑C和K保持高水平的BCG活性，其中在40天時的制劑C與在22天時的制劑K (平均log1(1CFU/ug = 10) 相比顯示持久的活性維持率(平均IogltlCFUAig = 10)。相比而言，在12天時的制劑N顯示BCG活性快速地損失(平均IogltlCFUAig = 10)。這些結(jié)果表明與制劑N相比，制劑C和 K更適于在室溫下保持BCG活性。C.小鼠中配制的BCG的免疫原性。在小鼠中口服配制的M.bovis BCG誘導免疫反應。為了確定口服M. bovis BCG后測量系統(tǒng)免疫反應的適合方法，我們比較了口服IO7CFU脂質(zhì)制劑的M. bovis BCG或果醬中的M. bovis BCG (非配制的M. bovis BCG)后第8周牛PPD誘導的脾細胞增殖(LTA)，及
14脾的IL-2和INF- γ反應。表1表明盡管LTA和INF- γ測試顯示在配制和非配制的口服 Μ. bovis BCG組之間具有顯著差異，但IL-2測試的差異不顯著。由于INF-γ在對抗肺結(jié)核中的重要性，INF-Y測試被用于進一步的試驗中以監(jiān)測系統(tǒng)免疫反應。為確定口服后Μ. bovis BCG劑量的效果，我們比較了用不同劑量的配制或非配制的M. bovis BCG接種后小鼠8周內(nèi)對牛PPD的脾INF-γ反應。圖2表明在用IO6CFU的 Μ. bovis BCG 口服免疫后在配制組中檢測到低水平的INF- y ( < 200pg/ml)，但在疫苗組之間沒有顯著差異。當劑量增加到IO7CFU時，非配制組的INF-γ反應保持低水平，而對配制的M. bovis BCG的反應顯著增加(P < 0. 05)。在使用IO8CFU的M. bovis BCG時也可看到類似的差異。當疫苗劑量增加到BCG為IO9CFU時，在非配制組也可看到INF-Y水平的增加， 同時配制組保持高水平。在M. bovis BCG劑量為IO7-IO9CFU時，在配制的M. bovis BCG組中INF-γ反應顯著大于非配制的M. bovis BCG組。在高劑量非配制組中看到的INF-γ反應的增加表明為獲得免疫反應的誘導，與配制的Μ. bovis BCG相比，需要相當高口服劑量的 M-bovis BCG。為確定口服M. bovis BCG的免疫反應時間過程，我們比較了在口服或皮下接種M. bovis BCG后按2周時間的間隔睥的INF- γ反應。圖3顯示INF- γ反應在皮下接種后第4周達峰值，并在第6和8周逐漸降低。相反，INF-γ反應在口服接種配制的Μ. bovis BCG后第6周開始增加，并在接種后第8周保持高水平。對非配制的M. bovis BCG或僅含制劑材料的INF-Y反應在2-8周之間保持低水平。這些結(jié)果表明口服接種配制的M. bovis BCG后與皮下接種相比免疫反應被延遲，但至少持續(xù)8周。來自用配制的M. bovis 口服接種的小鼠腹膜的淋巴細胞抑制自體同源巨噬細胞中M. bovis的生長。NPEC加入到來自用M. bovis BCG制劑口服接種的小鼠的Μ. bovis感染的巨噬細胞中以確定是否淋巴細胞介導的效應器可以抑制Μ. bovis的細胞內(nèi)生長。巨噬細胞內(nèi)M. bovis的生長通過[3H]尿嘧啶攝入確定。僅在巨噬細胞內(nèi)或與來自口服接種小鼠的 NPEC共培養(yǎng)時M. bovis的生長如圖4所示。從用配制或非配制的M. bovis BCG 口服接種的小鼠或只給予制劑材料的小鼠得來的巨噬細胞它們在控制M. bovis生長的能力上沒有差異。當來自用配制的M. bovis BCG接種的小鼠的NPEC與自體同源的Μ. bovis感染的巨噬細胞共培養(yǎng)時，與來自用非配制的M. bovis BCG或僅用制劑材料接種的小鼠的NPEC共培養(yǎng)相比，[3H]尿嘧啶計數(shù)顯著降低(P<0.05)。這些結(jié)果證實來自用配制的Μ. bovis BCG 口服接種的小鼠的淋巴細胞可激活巨噬細胞以抑制Μ. bovis的細胞內(nèi)生長。體外M. bovis 細胞內(nèi)生長的對照能夠反映體內(nèi)可導致宿主內(nèi)M. bovis的散布降低的生長抑制?？诜臃N配制的M. bovis BCG可防止劇毒Μ. bovis的氣霧劑感染。為確定配制的口服M. bovis BCG的保護功效，對小鼠口服接種5 X IO7CFU的配制的M. bovis BCG或皮下接種1 X IO6CFU的M. bovis BCG。非接種小鼠作為對照。在接種后第8周通過氣霧劑途徑對小鼠用劇毒M. bovis進行免疫性實驗，并在進行免疫性實驗后37-40天處死。表2表明皮下M. bovis BCG接種可降低肺細胞計數(shù)約2. 34個log，降低脾細菌計數(shù)約1. 90個log。相比而言，配制的口服M. bovis BCG降低肺細菌計數(shù)約1. 0個log，降低脾細菌計數(shù)約1. 48個 log。表2中的結(jié)果表明口服配制的Μ. bovis BCG和皮下使用Μ. bovis BCG對劇毒Μ. bovis 的氣霧劑感染可產(chǎn)生有效保護，盡管皮下使用Μ. bovis BCG在肺中的保護功效大于口服配制的 M. bovis BCG 組。D.負鼠的免疫反應和病理學。
淋巴細胞增殖反應?？诜臃N配制的BCG對全血淋巴細胞對牛PPD增殖反應的效果如圖5和表3所示。在接種后第6周，配制的BCG組對PPD-B的平均刺激指數(shù)(SIs)明顯高于非配制的BCG組和非接種對照組(P < 0. 05)。在用M. bovis進行免疫性實驗后第4 周，所有組對PPD-B的平均SI均> 20。這些結(jié)果顯示，與非配制的BCG相比口服使用配制的BCG在負鼠中引發(fā)強烈的對PPD-B的免疫反應。進一步的試驗比較了四種口服脂質(zhì)BCG制劑和皮下接種的免疫反應(圖11)。皮下接種的負鼠顯示出強烈的LTA反應，在接種后第4周達峰值(平均SI為42. 5)，并到第8 周逐漸降低到SI = 30。相比而言，脂質(zhì)N配制的口服BCG在8周的接種期內(nèi)不能引發(fā)LTA 反應，在脂質(zhì)C、K和F中配制的口服BCG在接種后第4周誘導LTA反應較弱(Si = 1_7)，但逐步增加并維持到接種后第8周(Si = 15-2 。這些結(jié)果顯示，與皮下接種相比，口服接種的系統(tǒng)免疫反應被延遲，但它們持續(xù)更久。制劑N不誘導在非接種負鼠上看到的LTA反應， 也不防止M. bovis的氣霧劑感染(見表4)，這表明用于配制的口服BCG的脂質(zhì)類型對于防止肺結(jié)核是重要的。臨床結(jié)果。在免疫性實驗和尸檢之間不同組體重變化如圖6所示。用配制的BCG 接種的負鼠平均體重在免疫性實驗和尸檢之間增加0. 02kg。相比而言，非配制的BCG和非接種對照組的平均體重在此期間分別降低0. 35kg和0. 23kg。但是這些差異不具有統(tǒng)計顯著性。在進一步的試驗中(表4)，比較了四種口服脂質(zhì)BCG制劑和皮下接種，與非接種組(0. 147kg)相比，在免疫性實驗和尸檢之間的平均體重變化對于皮下接種組(平均體重降低0. OUkg)和口服脂質(zhì)BCG組之一 (F組)(0.035kg)而言明顯降低。相比而言，其它的口服BCG組平均體重降低0. 060kg (脂質(zhì)C)、0. 06Ag (脂質(zhì)K)及0. (脂質(zhì)N)。對接種未顯示免疫反應的負鼠(即非接種和脂質(zhì)N組)與有反應的各組相比顯示較大的體重下降。病理學。在所有的免疫性實驗動物的肺中觀察到肉眼可見的損傷。結(jié)核型肺炎的程度可以通過肺重量估測(圖7)。較高的肺重量與廣泛的結(jié)核型肺炎相聯(lián)系(3) (4)。為標準化肺重量隨體重變化的差異，將各動物的肺重量與體重相比，并表示為比率。用配制的 BCG接種的動物的平均肺重量與體重的比率是1.62。相比而言，非配制的BCG和非接種對照組的平均肺重量與體重的比率分別是2. 86和3.0。用配制的BCG接種負鼠的肺重量與體重的比率明顯與非配制的BCG組和非接種對照組不同(P <0.05)。通常，肺損傷是小的結(jié)合區(qū)或與在損傷中間的黃色壞死區(qū)結(jié)合的肺葉。腫脹的支氣管淋巴結(jié)可在具有極大肺損傷的動物中觀察到。在第二個試驗中(表4)，比較了四種口服脂質(zhì)BCG制劑和皮下接種，在接種組之間平均肺重量與體重的比率沒有明顯差異。然而，對接種未顯示免疫反應的負鼠(即非接種和脂質(zhì)N組)與有反應的動物相比具有較高的平均肺重量。細菌學從M. bovis感染的負鼠的肺和脾分離牛型結(jié)核菌。從不同組的肺和脾分離的 M. bovis的平均數(shù)目如圖8和9所示。非配制和配制的BCG組的平均肺細菌計數(shù)明顯低于非接種對照組(P < 0. 05)。配制的BCG組的平均脾細菌計數(shù)是非配制的BCG組的約十分之一，是非接種對照組的約四十分之一。配制的BCG組的平均脾細菌計數(shù)明顯低于非配制的BCG組和非接種對照組(P < 0. 05)。在第二個試驗中，比較了四種口服脂質(zhì)BCG制劑和皮下接種(表4)，三個口服接種組和皮下接種組的脾細菌計數(shù)明顯低于非接種組(P < 0. 05)。其它的口服脂質(zhì)BCG組(脂質(zhì)N)未顯示出脾細菌計數(shù)的明顯下降。當與肺細菌計數(shù)相比時在各組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。一般地，對接種未顯示免疫反應的負鼠(即非接種和脂質(zhì)N組)與有反應的動物相比具有較高的平均脾細菌計數(shù)和肺細菌計數(shù)。表1.用不同脂質(zhì)制劑a 口服接種8周后小鼠中牛PPD刺激的脾細胞反應
權(quán)利要求
1.一種口服給藥的抗原組合物，其包含適于對動物或人給藥的脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分，所述抗原成分包含能有效刺激免疫反應的量的活細菌，所述脂質(zhì)制劑是固體或膏狀形式的脂質(zhì)基質(zhì)并且包含40 %的油酸，3 %的肉豆蔻酸，26 %的棕櫚酸，15 %的硬脂酸及6 %的亞油酸；或者47%的月桂酸，20%的肉豆蔻酸，12%的棕櫚酸，12%的硬脂酸及3%的油酸；并且所述組合物在所述動物的生理溫度下發(fā)生從固體到液體的轉(zhuǎn)變，所述細菌均勻分布在整個所述脂質(zhì)基質(zhì)中。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)制劑在30°C到約37°C的生理溫度之間發(fā)生從固體到液體的轉(zhuǎn)變。
3.—種抗原組合物，其包含適于對動物或人給藥的脂質(zhì)制劑和至少一種以能有效刺激免疫反應的量存在的分離的抗原成分，所述脂質(zhì)制劑是固體或膏狀形式的脂質(zhì)基質(zhì)，且所述脂質(zhì)制劑在所述動物的生理溫度下發(fā)生從固體到液體的轉(zhuǎn)變，并且所述抗原成分均勻分布在整個所述脂質(zhì)基質(zhì)中，其中所述脂質(zhì)制劑包含40%的油酸，3%的肉豆蔻酸，26%的棕櫚酸，15%的硬脂酸及6%的亞油酸；或者47%的月桂酸，20%的肉豆蔻酸，12%的棕櫚酸，12%的硬脂酸及3%的油酸。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述的抗原成分是蛋白質(zhì)、糖蛋白質(zhì)或肽或其混合物。
5.如權(quán)利要求3所述的組合物，其被配制成用于非腸道給藥的制劑。
6.如權(quán)利要求3所述的組合物，其被配制成用于皮下給藥的制劑。
7.如權(quán)利要求3所述的組合物，其被配制成用于口服給藥的制劑。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述活細菌是卡介苗。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述卡介苗是83/6235、I^steur1173P2、 Glaxo 1077、Japanese 172、Prague, Russian、Brazilian、Danish 1331、Copenhagen 或 Connaught0
10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述卡介苗的濃度為1X IO5至1 X 101°克隆形成單位/ml。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述卡介苗的濃度為IXIO7至IXlO9克隆形成單位/ml。
12.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，其包含至少兩種抗原成分。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中一種抗原成分是所述活細菌，一種抗原成分是蛋白質(zhì)或肽。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述活細菌是卡介苗。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述卡介苗是83/6235、I^steur1173P2、 Glaxo 1077、Japanese 172、Prague, Russian、Brazilian、Danish 1331、Copenhagen 或 Connaught0
16.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述蛋白質(zhì)是免疫避孕蛋白質(zhì)。
17.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述蛋白質(zhì)或肽是弱免疫原性的。
18.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，其基本上沒有含水成分。
19.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，其中所述組合物基本上由所述活細菌和脂質(zhì)組成。
20.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，其還包含白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶。
21.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，所述組合物是疫苗。
22.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，所述組合物是疫苗佐劑。
23.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，其中所述組合物被保護性包被。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述保護性包被為明膠。
25.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，所述組合物還包含一種或多種調(diào)味劑、引誘劑或芳香劑。
26.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，其中所述脂質(zhì)制劑包含一種或多種氫化植物油。
27.如權(quán)利要求1或3所述的組合物，其中所述脂質(zhì)制劑包含椰子油或橄欖油。
28.適于對人或動物給藥的脂質(zhì)制劑和至少一種包含活細菌的抗原成分在口服給藥的、用于免疫人或動物的藥物制備中的用途，其中所述脂質(zhì)制劑是固體或膏狀形式的脂質(zhì)基質(zhì)并且包含40 %的油酸，3 %的肉豆蔻酸，26 %的棕櫚酸，15 %的硬脂酸及6 %的亞油酸；或者47 %的月桂酸，20 %的肉豆蔻酸，12 %的棕櫚酸，12 %的硬脂酸及3 %的油酸；并且所述細菌均勻分布在整個所述脂質(zhì)基質(zhì)中。
29.如權(quán)利要求觀所述的用途，其中所述抗原成分以能有效刺激免疫反應的量存在。
30.適于對人或動物給藥的脂質(zhì)制劑和至少一種包含活細菌的抗原成分在用于免疫人或動物的藥物制備中的用途，其中所述脂質(zhì)制劑在所述人或動物的生理溫度下發(fā)生從固體到液體的轉(zhuǎn)變，所述脂質(zhì)制劑是固體或膏狀形式的脂質(zhì)基質(zhì)并且包含40 %的油酸，3 %的肉豆蔻酸，26 %的棕櫚酸，15 %的硬脂酸及6 %的亞油酸；或者47%的月桂酸，20%的肉豆蔻酸，12%的棕櫚酸，12%的硬脂酸及3%的油酸；并且所述細菌均勻分布在整個所述脂質(zhì)基質(zhì)中。
31.如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述藥物被配制成用于口服給藥的制劑。
32.如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述藥物被配制成用于皮下給藥的制劑。
33.如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述藥物被配制成用于非腸道給藥。
34.如權(quán)利要求30所述的用途，其中所述抗原成分以能刺激免疫反應的量存在。
35.如權(quán)利要求觀或30所述的用途，所述藥物是疫苗。
36.如權(quán)利要求觀或30所述的用途，所述藥物是疫苗佐劑。
37.權(quán)利要求1或3所述的組合物在刺激人或動物粘膜免疫反應的藥物制備中的用途。
38.如權(quán)利要求觀-34和37中任一項所述的用途，其中所述動物是狗、貓、鳥、牛、綿羊、 鹿、山羊、大鼠、小鼠、兔、負鼠、獾、豚鼠、鼬或豬。
39.如權(quán)利要求35所述的用途，其中所述動物是狗、貓、鳥、牛、綿羊、鹿、山羊、大鼠、小鼠、兔、負鼠、獾、豚鼠、鼬或豬。
40.如權(quán)利要求36所述的用途，其中所述動物是人、狗、貓、鳥、牛、綿羊、鹿、山羊、大鼠、小鼠、兔、負鼠、獾、豚鼠、鼬或豬。
41.如權(quán)利要求38所述的用途，其中所述動物是水牛。
42.如權(quán)利要求39或40所述的用途，其中所述動物是水牛。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗原組合物及使用該抗原組合物使動物免疫的方法。該抗原組合物包含通常情況下為固體形式的脂質(zhì)制劑及至少一種抗原成分。優(yōu)選的抗原成分為活的有機體。在優(yōu)選的實施方案中該組合物被配制成口服使用。
文檔編號A61P31/00GK102294023SQ20111019860
公開日2011年12月28日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者伊恩·喬治·塔克, 布賴斯·馬爾科姆·巴都, 弗蘭克·歐內(nèi)斯特·阿爾德威爾 申請人:動物健康委員會公司, 奧塔戈創(chuàng)新公司, 阿戈里索契有限公司