專利名稱：一種骨靶向藥物天冬氨酸六肽丹參素的合成方法及其醫(yī)療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨靶向藥物天冬氨酸六肽丹參素的合成方法及防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用，屬于藥物制造的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥是老年人和絕經(jīng)婦女的常見病、多發(fā)病。其主要的發(fā)病機(jī)制是機(jī)體的骨重建的失衡，骨重建是指去除骨骼局部舊骨代謝形成新骨的過程，是成熟骨組織的ー種重要替換機(jī)制，是破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞ー個(gè)成對(duì)的、相偶聯(lián)的細(xì)胞活動(dòng)過程。骨質(zhì)疏松癥是ー種以骨量低下、骨顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性増加、易發(fā)生骨折的全身性骨病。骨量低下是指骨組織單位體積內(nèi)骨質(zhì)含量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞指骨質(zhì)中鈣逐漸流失，骨小梁變薄、變細(xì)、斷裂和骨組織內(nèi)的孔隙增多，最終導(dǎo)致骨脆性増加，骨強(qiáng)度下降，容易發(fā)生骨折。骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)主要有全身性的骨痛、駝背、身高縮短和骨折，最常見的骨折部位是胸、腰椎、股骨上端和橈骨遠(yuǎn)端骨折。骨質(zhì)疏松性骨折在骨質(zhì)疏松癥患者中的發(fā)病 率為20%左右，且呈逐年上升的趨勢(shì)，成為威脅老年人身心健康和影響生活質(zhì)量的僅次于心血管疾病的嚴(yán)重疾病。特別是髖部骨折后，使患者失去生活自理能力，長(zhǎng)期臥床易并發(fā)感染、心血管疾病。骨質(zhì)疏松癥國(guó)際骨質(zhì)疏松基金會(huì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，骨質(zhì)疏松癥目前危害著全球大約三分之一 50歲以上的女性和五分之一 50歲以上的男性。隨著世界人ロ的増加和平均壽命的提高，這種疾病的威脅將越來越大。2008年10月20日在北京發(fā)布的《骨質(zhì)疏松癥防治中國(guó)白皮書》指出，我國(guó)至少有6944萬人患有骨質(zhì)疏松，有2. I億人患低骨量存在骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)。預(yù)計(jì)到2020年我國(guó)骨質(zhì)疏松和低骨量患者將增加至2. 8億。如果這么大的人群得不到早期干預(yù)治療，其后果將是骨折發(fā)生率大大增加，不但給患者帶來痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也會(huì)給醫(yī)療資源帶來不小的壓力。骨質(zhì)疏松癥已成為一個(gè)日益突出的社會(huì)公共健康問題。目前，治療骨質(zhì)疏松癥主要有兩大類ー類是抑制骨吸收的藥物；ー類是促進(jìn)骨形成的藥物。前者有雙膦酸鹽(羥こ膦酸鈉和阿侖膦酸鈉等)、降鈣素(鮭魚降鈣素和鯁魚降鈣素衍生物)、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雌激素、活性維生素D和鈣劑；后者有氟化物、甲狀旁腺素、活性維生素D和合成類固醇等。然而骨組織是ー種特殊的組織，其血流量低、硬度大、滲透性差和生理生化過程特殊，按一般的給藥途徑很難使藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至有效部位，有些藥物常需全身給藥或者多次給藥，才能在骨組織中達(dá)到有效的治療濃度。這樣不僅降低了藥物的治療指數(shù)，也會(huì)對(duì)病人的非骨組織或器官造成不必要的毒副作用。如長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素治療骨質(zhì)疏松癥易出現(xiàn)陰道出血、乳房腫痛、子宮內(nèi)膜增生和靜脈血栓等嚴(yán)重不良反應(yīng)；活性維生素D治療骨質(zhì)疏松癥呈劑量依賴性，然而增加VD用量時(shí)則可能引起高鈣血癥和高尿血癥。為了解決骨質(zhì)疏松的治療難題，本課題組對(duì)中藥進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究，已發(fā)現(xiàn)丹參素在治療骨質(zhì)疏松方面具有較好的作用，丹參素是唇形科植物丹參的主要水溶性成分，化學(xué)名為D(+) β-(3，4-ニ羥基苯基)乳酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)有許多文獻(xiàn)報(bào)道，在預(yù)防骨質(zhì)疏松方面已有文獻(xiàn)證明丹參的粗提取物對(duì)成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶活性有明顯的促進(jìn)作用(丁寅相，華西口腔醫(yī)學(xué)雜，1996)，對(duì)人成骨細(xì)胞缺血-再灌注損傷有保護(hù)作用(王福生，中華現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2000)，對(duì)骨折愈合有促進(jìn)作用(符詩聰，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1999)。本課題組證明丹參水提物能有效預(yù)防糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的大鼠骨質(zhì)疏松(崔燎，生物醫(yī)學(xué)工程，2004)，還可阻止去卵巢大鼠牙槽骨的骨丟失(張曉燕，中成藥，2007)，丹參水提物和丹參素促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和防治潑尼松所致大鼠骨質(zhì)疏松(崔燎，中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004)等。關(guān)于丹參素的藥理學(xué)研究，已經(jīng)證明丹參素能擴(kuò)張心腦血管，抵抗血小板粘附聚集，清除氧自由基；能抑制細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇合成的作用，具有抗脂蛋白氧化的作用，防止 氧化蛋白對(duì)細(xì)胞的損傷；還能改善微循環(huán)，加速血液流速，抵抗血小板凝聚和血栓形成的作用，具有提高機(jī)體抗凝和纖溶活性的作用(楊春欣，中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1997)。而本課題組經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)丹參素對(duì)體外大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞有直促進(jìn)增殖、分化和礦化作用，上調(diào)成骨細(xì)胞骨保護(hù)素基因的表達(dá)；另外，還可誘導(dǎo)或促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨髄基質(zhì)細(xì)胞成骨分化，抑制其成脂分化。因此我們認(rèn)為丹參素可預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥，其可能機(jī)制通過直接促進(jìn)成成骨細(xì)胞骨基質(zhì)的形成及礦化從而對(duì)抗骨吸收，和間接通過改善微循環(huán)促進(jìn)成骨源細(xì)胞-骨髄基質(zhì)細(xì)胞成骨分化，從而提高骨形成。丹參素屬于酚酸類化合物，經(jīng)研究認(rèn)為其活性基團(tuán)是苯乳酸丹參素，其結(jié)構(gòu)較為不穩(wěn)定，尤其是在堿性環(huán)境中，其化學(xué)不穩(wěn)定性可能與其結(jié)構(gòu)中的α -羥基和酚羥基有夫，在水溶液中鄰ニ酚羥基的電荷密度増大，易解離形成氧負(fù)離子，發(fā)生自動(dòng)氧化生成有色醌類物質(zhì)，而α-羥基由于羧基的存在變得更活潑，還原性強(qiáng)；丹參素其在人體內(nèi)代謝較快被代謝，消除半衰期約O. 94h (約56min)(劉琦，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003)，在代謝的方式可能是通過α -羥基的こ?；蛊涫セ钚?裴渭靜，分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2005)。丹參素的這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，影響了其在體內(nèi)的應(yīng)用。天冬氨酸寡肽作為骨靶向藥物的載體已應(yīng)用始于2000年，kasugai等發(fā)現(xiàn)幾種能與HA結(jié)合的非膠原蛋白，在其與羥基磷灰石吸附實(shí)驗(yàn)(HA)的可能結(jié)合位點(diǎn)處有重復(fù)的氨基酸序列，因此合成了小肽(Asp)6，將其與熒光素異硫氰酸偶聯(lián)，考察它在小鼠體內(nèi)分布情況及其體外親和力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在硬組織(牙、骨)中有明顯的熒光標(biāo)記，而在軟組織中未發(fā)現(xiàn)(Kasugai S, J Bone Miner Res,2000)。以上結(jié)果表明，(Asp)6是一個(gè)有效的骨革巴向藥物載體分子。進(jìn)ー步研究表明其親骨性只與其氨基酸數(shù)目有夫，與其旋光性無關(guān)?？紤]到D型氨基酸在體內(nèi)可能不易被水解，研究者建議使用L-型氨基酸。(L-Asp)6通過連接橋丁ニ酸與雌ニ醇連接得到了抗骨質(zhì)疏松癥化合物E2 ^D6(Sekidc) T, J Drug Target, 2001)和E2 · 17 β D6 (Yokogawa K, Endocrinology, 2001),對(duì)HA的親和カ與原藥都增加，體內(nèi)也顯示了較高的骨靶向性，藥效顯示可防止去卵巢大鼠的骨丟失，而不會(huì)引起子宮的不良反應(yīng)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，以天冬六肽與丹參素結(jié)合，組成新型的骨靶向藥物，可解決丹參素結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性及較短半衰期短的問題，同時(shí)由于六肽為骨靶向載體，與丹參素結(jié)合后可作為丹參素骨靶向載體，増加其在骨組織的分布及沉積，使其更好地發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

發(fā)明內(nèi)容
合成一種以天冬六肽為骨靶向載體的天冬六肽丹參素，解決丹參素結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性及在體內(nèi)半衰期短，在骨組織中分布少，抗骨質(zhì)疏松作用不強(qiáng)問題，為骨質(zhì)疏松臨床應(yīng)用提供新的治療藥物。本發(fā)明的主要實(shí)施方案是骨靶向丹參素的設(shè)計(jì)及合成丹參素化合物的結(jié)構(gòu)中含有羧基(見說明書附圖
I)，可與氨基形成酰胺鍵，本設(shè)計(jì)參考布洛芬與六肽的連接方式(見說明書附圖2)，設(shè)計(jì)將丹參素與天冬氨酸六肽(L-Asp) 6的N端以酰胺鍵結(jié)合得化合物天冬氨酸六肽-丹參素(簡(jiǎn)稱DD6),結(jié)構(gòu)見說明書附圖3。我們采用固相合成法對(duì)天冬氨酸六肽-丹參素進(jìn)行合成，方法如下天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成設(shè)計(jì)固相多肽合成采用固定羧基端，即由C向N端合成；先將所要合成肽鏈的C端氨基酸的羧基以共價(jià)鍵的形式同固相合成樹脂相連，然后以結(jié)合在樹脂上的氨基酸的氨基作為反應(yīng)活性位點(diǎn)，與下一個(gè)氨基酸的羧基反應(yīng)生成肽鍵，延長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)(縮合、洗滌、去保護(hù)、中和、洗滌和下ー輪縮合)操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹脂上切割下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。
固相多肽合成包括固相合成樹脂、氨基酸保護(hù)策略以及肽鍵縮合試劑三個(gè)關(guān)鍵部，目前較為常用的樹脂是wang氏樹脂，屬于ー種酸敏感羥基樹脂，其羥基位點(diǎn)可與氨基酸羧基端形成酯鍵。氨基酸所需保護(hù)基團(tuán)是α-氨基及側(cè)鏈基團(tuán)，如今α-氨基的保護(hù)常用9-芴甲氧羰基(Fmoc)，其對(duì)酸穩(wěn)定，其可用20%哌啶/DCM或哌啶/DMF輕易脫除，具有反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，產(chǎn)率高等特點(diǎn)，采用Fmoc作為保護(hù)基的方法也稱為Fmoc合成法。天冬氨酸側(cè)鏈上存在活潑的羧基基團(tuán)，目前常用的保護(hù)劑是叔丁氧基(OtBu)，對(duì)酸較敏感，可用TFA(三氟こ酸)去除，TFA還可用作樹脂的切割劑，將肽從樹脂上切割下來。本合成選用wang氏樹脂作為固相載體將其與合成原料Fmoc-Asp (OtBu) -OH成酯結(jié)合之后,再以苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)/I-羥基-苯并-三氮唑(HOBT) /N，N-ニ異丙基こ胺(DIEA)為縮合劑合成連接剩余氨基酸得肽樹脂，最后再用適合縮合劑將丹參素(DSU)與肽樹脂結(jié)合，切割得粗產(chǎn)物。本研究采用多肽固相合成法先合成(L-Asp) 6載體，采用Fmoc保護(hù)α-氨基，用20%哌啶/DMF脫除，使用含有側(cè)鏈保護(hù)的Fmoc-Asp (OtBu) -OH為合成原料。氨基酸羧基端先與Wang樹脂的羥基位成酯連接后，肽鏈從C端向N端延伸，得到線型肽樹脂后，再脫除氨基保護(hù)基，將丹參素的羧基端與肽鏈的N端縮合后，用含有95% TFA的切割劑割去樹脂和側(cè)鏈保護(hù)劑，經(jīng)冰こ醚沉淀后即得到目標(biāo)化合物粗品。其合成路線見說明書附圖4。天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成步驟(一)Fmoc-Asp (OtBu)-O-Wang 樹脂的合成(成酯反應(yīng))(I)樹脂的溶脹稱取Wang樹脂于預(yù)先經(jīng)DCM處理的反應(yīng)器中，用DCM溶脹過夜，使樹脂充分溶脹，便于反應(yīng)能夠較完全進(jìn)行，分別用DCM及DMF洗滌樹脂，真空泵抽干。(2)Fmoc保護(hù)基團(tuán)的脫除配置20%哌啶/DMF脫除劑，為了能充分脫除Fmoc基團(tuán)，采用兩次脫除法。第一次脫除時(shí)間15min，試劑用量15mL/g樹脂；第二次，脫除時(shí)間15min,試劑用量15mL/g樹脂。(3)洗滌依次用DMFX I，DCMX 5、DMFX I進(jìn)行洗漆，每次氮?dú)夤拇禂嚢杓sImin左右。(4)縮合反應(yīng)將準(zhǔn)確稱取的Fmoc-Asp (-OtBu) -OH (4倍樹脂擔(dān)載量當(dāng)量)和HOBt (2倍樹脂擔(dān)載量當(dāng)量)放入燒杯中，加入45% DMF/THF磁力攪拌，溶解后，置于冰浴中，緩慢加入DIC (2倍當(dāng)量)，攪拌反應(yīng)活化20min。然后將此活化酯溶液倒入盛有Wang樹脂的反應(yīng)器(加入樹脂前用DCM處理反應(yīng)器)中；再加DMAP (O. 3倍樹脂擔(dān)載量當(dāng)量)，室溫下通入氮?dú)夥磻?yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗3次，加入ニ氯甲烷、こ酸酐和ニこ胺后，室溫反應(yīng)30min以封閉未被酯化的羥基。抽干，用DMF、DCM、MeOH分別洗滌三次，真空干燥樹脂。備下步合成用。(ニ)Fmoc-Asp (OtBu) - [Asp (OtBu) ] 4_Asp (OtBu) -O-Wang 樹脂的合成(I)反應(yīng)前樹脂的溶脹處理準(zhǔn)確稱取上所得氨基酸樹脂加入反應(yīng)器中，加入IOmLDCM浸泡，封閉過夜，使樹脂充分溶脹。真空抽去溶劑，用DMFX2洗滌lmin，抽干。(2)脫除Fmoc氨基保護(hù)基:同2. I. I (2)。(3)洗滌同 2. I. 1(3)。(4)肽鍵的形成稱取HBTU(3倍過量，以樹脂上氨基酸物質(zhì)的量為基準(zhǔn)，下同)、HOBT (3倍過量)，磁力攪拌下加入DMF溶解，再加入Fmoc-Asp (-otBu) -OH (3倍過量)溶解，室溫?cái)嚢杌罨?0min加入到脫除Fmoc氨基保護(hù)樹脂中。量取DIEA (6倍過量)，通入氮?dú)馐覝叵路磻?yīng)直到茚三酮檢測(cè)顯示反應(yīng)完全為止依次用DCM，DMF洗滌。重復(fù)步驟(2) (3)，直至六肽皆連接上。用DMF、DCM、MeOH分別洗滌三次，真空干燥樹脂。備下步合成用。若縮合效率不高，有必要用50%醋酸酐/吡啶(V/V)在25°C下反應(yīng)2h，以封閉未反應(yīng)氨基。(三)天冬氨酸六肽丹參素的合成(I)反應(yīng)前樹脂的溶脹處理準(zhǔn)確稱取上所得肽樹脂加入到燒瓶中，用IOmL DCM浸泡過夜，使樹脂充分溶脹。真空抽去溶劑，用3mL DMFX2洗滌，抽干。(2)脫除Fmoc氨基保護(hù)基:同2. I. I (2)。(3)洗滌同 2. I. 1(3)。(4)肽鍵的形成準(zhǔn)確稱取DSU(等量，與樹脂上肽的物質(zhì)的量為基準(zhǔn)，下同)用適當(dāng)溶劑溶解，再稱取HBTU (等量)和HOBT (等量)，經(jīng)DMF溶解后，一起加入到脫除Fmoc肽保護(hù)樹脂中，量取加入DIEA(2倍過量)，通入氮?dú)馐覝叵路磻?yīng)。用DMF、DCM、MeOH分別洗滌三次，除去溶劑后，樹脂直接于反應(yīng)器中放置真空干燥箱中干燥。(5)脫除側(cè)鏈保護(hù)及樹脂取出反應(yīng)器，氮?dú)夤拇迪?，加入冰的切割劑TFA/TIS/H2O (95/2. 5/2. 5，V/V/V)室溫下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，收集濾液，用少量TFA洗樹脂三次，合并濾液，加入大量無水冰こ醚，離心、洗滌三次，收集沉淀。沉淀經(jīng)真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹參素產(chǎn)品。( ニ)天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的質(zhì)量控制對(duì)所合成的粗品進(jìn)行高效液相色譜(RP-HPLC)分析，收集主峰，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。I)樣品溶液制備稱取所合成的天冬氨酸六肽-丹參素,用O. I % TFA-H2O溶解后用O. 22 μ m濾膜過濾，供RP-HPLC分析備用。2) RP-HPLC 分析條件色譜分析儀器及分析條件如下儀器AngilentHPLC 1200series色譜柱ODSC18 柱(250mmX 4. 6mm, 5 μ m, Hypersil)
流動(dòng)相A0. I % TFA/H20，B 0. 1% TFA/ こ腈流速lmL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280nm,進(jìn)樣量20 μ L洗脫程序如下
權(quán)利要求
1.一種六肽丹參素的合成方法及其醫(yī)療用途。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種六肽丹參素的合成方法是指將丹參素結(jié)構(gòu)中含有的羧基與天冬氨酸六肽的N端以酰胺鍵結(jié)合得化合物天冬氨酸六肽-丹參素，結(jié)構(gòu)見說明書附圖3。
3.如權(quán)利要求I所述的ー種六肽丹參素的合成方法是指以天冬氨酸六肽為載體的合成方法，其特征是采用多肽固相合成法先合成天冬氨酸六肽載體，采用9-芴甲氧羰基保護(hù)α -氨基，用20%哌啶/N，N- ニ甲基甲酰胺脫除，使用含有側(cè)鏈保護(hù)的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH為合成原料；氨基酸羧基端先與Wang樹脂的羥基位成酯連接后，肽鏈從C端向N端延伸，得到線型肽樹脂后，再脫除氨基保護(hù)基，將丹參素的羧基端與肽鏈的N端縮合后，用含有95%三氟こ酸的切割劑割去樹脂和側(cè)鏈保護(hù)劑，經(jīng)冰こ醚沉淀后即得到目標(biāo)化合物粗品，其合成路線包括下述步驟 (1)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(_叔丁氧基)-O-Wang樹脂的合成(成酯反應(yīng)) 1)樹脂的溶脹稱取Wang樹脂于預(yù)先經(jīng)ニ氯甲烷處理的反應(yīng)器中，用ニ氯甲烷溶脹過夜，使樹脂充分溶脹，便于反應(yīng)能夠較完全進(jìn)行，分別用ニ氯甲烷及N，N-ニ甲基甲酰胺洗滌樹脂，真空泵抽干； 2)9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的脫除配置20%哌啶/N，N-ニ甲基甲酰胺脫除劑，為了能充分脫除9-芴甲氧羰基基團(tuán)，采用兩次脫除法。第一次脫除時(shí)間15min，試劑用量15mL/g樹脂；第二次，脫除時(shí)間15min,試劑用量15mL/g樹脂； 3)洗滌依次用N，N-ニ甲基甲酰胺XI，ニ氯甲烷X5、N，N-ニ甲基甲酰胺Xl進(jìn)行洗漆，姆次氮?dú)夤拇禂嚢杓sImin左右； 4)縮合反應(yīng)將準(zhǔn)確稱取的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(_叔丁氧基)-OH(4倍樹脂擔(dān)載量當(dāng)量)和HOBt (2倍樹脂擔(dān)載量當(dāng)量)放入燒杯中，加入45% N，N-ニ甲基甲酰胺/四氫呋喃磁力攪拌，溶解后，置于冰浴中，緩慢加入N，N' -ニ異丙基碳ニ亞胺(2倍當(dāng)量)，攪拌反應(yīng)活化20分鐘。然后將此活化酯溶液倒入盛有Wang樹脂的反應(yīng)器(加入樹脂前用ニ氯甲烷處理反應(yīng)器)中；再加4-ニ甲氨基吡啶(O. 3倍樹脂擔(dān)載量當(dāng)量)，室溫下通入氮?dú)夥磻?yīng)6小吋。反應(yīng)結(jié)束后用N，N-ニ甲基甲酰胺洗3次，加入ニ氯甲烷、こ酸酐和ニこ胺后，室溫反應(yīng)30分鐘以封閉未被酯化的羥基。抽干，用N，N-ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分別洗滌三次，真空干燥樹脂； (2)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-[天冬氨酸(叔丁氧基)]4-天冬氨酸(叔丁氧基)-O-Wang樹脂的合成 1)反應(yīng)前樹脂的溶脹處理準(zhǔn)確稱取上所得氨基酸樹脂加入反應(yīng)器中，加入IOmLニ氯甲烷浸泡，封閉過夜，使樹脂充分溶脹，真空抽去溶劑，用N，N-ニ甲基甲酰胺X2洗滌I分種，抽干； 2)脫除9-芴甲氧羰基氨基保護(hù)基方法同⑴步驟的2)； 3)洗滌方法同(I)步驟的3)； 4)肽鍵的形成稱取苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3倍過量，以樹脂上氨基酸物質(zhì)的量為基準(zhǔn)，下同)、1_羥基-苯并-三氮唑(3倍過量)，磁力攪拌下加入N, N- ニ甲基甲酰胺溶解，再加入9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH (3倍過量)溶解，室溫?cái)嚢杌罨?0分鐘，加入到脫除Fmoc氨基保護(hù)樹脂中；量取N，N- ニ異丙基こ胺(6倍過量)，通入氮?dú)馐覝叵路磻?yīng)，直到茚三酮檢測(cè)顯示反應(yīng)完全為止，依次用ニ氯甲烷，N, N- ニ甲基甲酰胺洗滌。重復(fù)步驟2)和3)，直至六肽皆連接上；用N，N- ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分別洗滌三次，真空干燥六肽樹脂； (3)天冬氨酸六肽丹參素的合成 1)反應(yīng)前樹脂的溶脹處理準(zhǔn)確稱取上所得六肽樹脂加入到燒瓶中，用IOmLニ氯甲烷浸泡過夜，使樹脂充分溶脹，真空抽去溶劑，用3mLN，N- ニ甲基甲酰胺X2洗滌，抽干； 2)脫除9-芴甲氧羰基氨基保護(hù)基方法同⑴步驟的2)； 3)洗滌方法同(I)步驟的3)； 4)肽鍵的形成準(zhǔn)確稱取丹參素(等量，與樹脂上肽的物質(zhì)的量為基準(zhǔn)，下同)，再稱取苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(等量)和I-羥基-苯井-三氮唑(等量)，經(jīng)N，N-ニ甲基甲酰胺溶解后，一起加入到脫除9-芴甲氧羰基肽保護(hù)樹脂中，量取加入N, N-ニ異丙基こ胺(2倍過量)，通入氮?dú)馐覝叵路磻?yīng)，用N，N-ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分別洗滌三次，除去溶劑后，樹脂直接于反應(yīng)器中放置真空干燥箱中干燥； 5)脫除側(cè)鏈保護(hù)及樹脂取出反應(yīng)器，氮?dú)夤拇迪?，加入冰的切割劑三氟こ?三異丙基硅烷/水(95/2. 5/2.5，V/V/V)室溫下反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，收集濾液，用少量三氟こ酸洗樹脂三次，合并濾液，加入大量無水冰こ醚，離心、洗滌三次，收集沉淀；沉淀經(jīng)真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹參素產(chǎn)品。
4.如權(quán)利要求I所述的ー種六肽丹參素的醫(yī)療用途是指該產(chǎn)品可作為骨靶向藥物用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。
5.如權(quán)利要求I所述的ー種六肽丹參素的醫(yī)療用途是指該產(chǎn)品可用于預(yù)防和治療心肌梗死，冠心病，動(dòng)脈粥樣硬化，高血脂，肝損傷，抗腦缺血損傷和抗腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種骨靶向藥物天冬氨酸六肽丹參素的合成方法，以及其醫(yī)療用途，特別是在防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用，屬于藥物制造的技術(shù)領(lǐng)域，六肽丹參素的合成方法是將丹參素結(jié)構(gòu)中含有的羧基與天冬氨酸六肽的N端以酰胺鍵結(jié)合得化合物天冬氨酸六肽-丹參素；本發(fā)明制備的天冬氨酸六肽-丹參素可靶向作用于骨組織，使骨組織微血管擴(kuò)張，促進(jìn)骨的微循環(huán)，同時(shí)，可以使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞形成，增加骨的合成，明顯地預(yù)防骨質(zhì)疏松，是臨床預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的良藥。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種六肽丹參素由于其在體內(nèi)不易被氧化，在血液中維持時(shí)間較久，還有許多醫(yī)療用途，這些醫(yī)療用途包括預(yù)防和治療心肌梗死，冠心病，動(dòng)脈粥樣硬化，高血脂，肝損傷，抗腦缺血損傷和抗腫瘤。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102643330SQ20111020236
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月9日
發(fā)明者仲利萍, 呂應(yīng)年, 吳怡, 吳鐵, 崔燎 申請(qǐng)人:廣東醫(yī)學(xué)院, 湛江廣醫(yī)醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司