專利名稱：一種用于女性盆底的生物復(fù)合補(bǔ)片及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，特別是涉及一種用于修復(fù)女性盆腔組織缺陷的補(bǔ)片。
背景技術(shù)：
女性盆底功能障礙性疾病是50歲以上中老年婦女的常見病、多發(fā)病，給中老年婦女的生活和健康造成嚴(yán)重的影響。目前的治療方法是用一些醫(yī)用聚丙烯類合成材料的網(wǎng)帶或片，通過(guò)外科手術(shù)進(jìn)行盆底功能重建。相對(duì)生物材料，無(wú)機(jī)材料易引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。 臨床效果顯示，聚丙烯網(wǎng)片具有組織侵蝕性的缺點(diǎn)，其生物相容性差，易產(chǎn)生異物刺激的不適和組織侵蝕性、性交痛等，而且，單純聚丙烯網(wǎng)片較難和植入局部發(fā)生融合，再加上在體內(nèi)老化變硬變脆、摩擦、位移、蝕穿等作用，常發(fā)生刺穿膀胱、陰道等不良并發(fā)癥。為克服這些弊端曾有學(xué)者試用脫細(xì)胞尸體筋膜、自體筋膜、人造膠原材料來(lái)進(jìn)行盆底功能重建。但這些材料均有各自特有缺陷難以克服，均處于試驗(yàn)階段。而替代材料中，異種脫細(xì)胞基質(zhì)材料最具有理想特性，其來(lái)源廣泛，強(qiáng)度良好，并含有生物活性因子，組織相容性優(yōu)秀，是未來(lái)盆底理想的修復(fù)材料，唯一缺陷是自然降解性導(dǎo)致其遠(yuǎn)期療效不穩(wěn)定，現(xiàn)階段技術(shù)條件下，尚無(wú)法取代聚丙烯材料的地位。但可以將其用作聚丙烯的輔助材料，目的是提高生物相容性， 從而降低聚丙烯并發(fā)癥。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服已有技術(shù)中上述缺陷，本發(fā)明提供了一種用于修復(fù)女性盆腔組織缺陷的補(bǔ)片，將異種脫細(xì)胞基質(zhì)材料作為聚丙烯網(wǎng)片的輔助材料，以提高生物相容性、降低聚丙烯并發(fā)癥，從而解決植入部位的炎癥反應(yīng)明顯的問(wèn)題。同時(shí)，本發(fā)明還提供上述補(bǔ)片的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種用于女性盆底的生物復(fù)合補(bǔ)片，在聚丙烯網(wǎng)片的表面包裹有動(dòng)物供體的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。其中，所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)優(yōu)選接種有BMSCs?？蛇x擇地，所述聚丙烯網(wǎng)片為長(zhǎng)方形、正方形、圓形或異形體。進(jìn)一步地，所述聚丙烯纖維的排列方向與膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的纖維方向呈25-75 度，優(yōu)選40-50度。進(jìn)一步地，所述聚丙烯網(wǎng)片內(nèi)置于兩片所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)之間，可吸收縫合線連接兩片所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)，將聚丙烯網(wǎng)片包裹于內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種用于女性盆底的生物復(fù)合補(bǔ)片的制備方法，包括如下步驟(1)制備膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)取動(dòng)物供體的膀胱，去除粘膜層和漿膜層，獲得膀胱基質(zhì)；對(duì)膀胱基質(zhì)進(jìn)行脫細(xì)胞處理以及凍干處理；消毒后，低溫塑封保存；(2)取聚丙烯網(wǎng)片，將上述獲得的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)包裹于所述聚丙烯網(wǎng)片的表面。
進(jìn)一步地，所述步驟( 具體為將聚丙烯網(wǎng)片內(nèi)置于兩片所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)之間，用可吸收縫合線將兩片所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)縫合，使得聚丙烯網(wǎng)片包裹于內(nèi)。進(jìn)一步地，所述的膀胱基質(zhì)的脫細(xì)胞過(guò)程為采用脫細(xì)胞液和緩沖液對(duì)膀胱基質(zhì)進(jìn)行反復(fù)浸泡和沖洗。優(yōu)選地，所述脫細(xì)胞液為三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟的混合液。本發(fā)明的多功能生物補(bǔ)片的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)采用動(dòng)物脫細(xì)胞膀胱材料(urinarybladder matrix,簡(jiǎn)稱UBM)，經(jīng)過(guò)特定工序，除掉動(dòng)物膀胱的細(xì)胞成分，保留動(dòng)物膀胱的脫細(xì)胞基質(zhì)， 并含有細(xì)胞生長(zhǎng)的各種生物成分，如血管生長(zhǎng)因子，TGF-β，VFGF等，然后將聚丙烯網(wǎng)片包裹，構(gòu)成“三明治”結(jié)構(gòu)。本發(fā)明將生物材料和無(wú)機(jī)材料進(jìn)行有效的結(jié)合，綜合二者的各自優(yōu)勢(shì)，獲得了明顯優(yōu)良的使用效果。其中，外層的膀胱基質(zhì)能夠起到隔離聚丙烯網(wǎng)片和宿主組織的作用，能顯著提高生物相容性。同時(shí)，還能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)向免疫適應(yīng)性轉(zhuǎn)變，有效降低其免疫排異原性，柔軟性與人的組織相近，無(wú)異物刺激、蝕穿等弊端，植入后可誘導(dǎo)患者纖維組織長(zhǎng)入，最后形成患者自身纖維組織的修復(fù)，可用于陰道前后壁膨出、子宮脫垂，張力性尿失禁等女性盆底功能障礙的手術(shù)治療。同時(shí)，本發(fā)明的生物復(fù)合補(bǔ)片經(jīng)上述工藝處理可大大提高補(bǔ)片的穩(wěn)定性。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例的立體分解圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明不同實(shí)驗(yàn)組植入陰道粘膜下植入局部組織內(nèi)⑶4細(xì)胞免疫組化檢測(cè)
結(jié)果；圖4為本發(fā)明不同實(shí)驗(yàn)組植入陰道粘膜下植入局部組織內(nèi)⑶8細(xì)胞免疫組化檢測(cè)
結(jié)果；圖5為本發(fā)明不同實(shí)驗(yàn)組植入陰道粘膜下植入局部組織內(nèi)CCR4細(xì)胞免疫組化檢測(cè)結(jié)果；圖6為本發(fā)明不同實(shí)驗(yàn)組植入陰道粘膜下植入局部組織內(nèi)CXCR3細(xì)胞免疫組化檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。對(duì)于所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，從對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明中，本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。本發(fā)明提供一種用于女性盆底的生物復(fù)合補(bǔ)片，補(bǔ)片包括聚丙烯網(wǎng)片1和膀胱脫脫細(xì)胞基質(zhì)2。其中，聚丙烯網(wǎng)片為市售產(chǎn)品，本發(fā)明不限制聚丙烯網(wǎng)片1的結(jié)構(gòu)和形狀，也就是說(shuō)，聚丙烯網(wǎng)片1可以采用長(zhǎng)方形、正方形、圓形或其它異形體。在選取臨床應(yīng)用的聚丙烯網(wǎng)片時(shí)，可以增加該網(wǎng)片的孔隙率，即將常規(guī)的2mm增加到4-5mm，以減少聚丙烯材料的密度，這種做法能進(jìn)一步降低免疫反應(yīng)強(qiáng)度。本發(fā)明使用的膀胱脫脫細(xì)胞基質(zhì)2來(lái)自于動(dòng)物供體，并經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞、殺菌處理，該動(dòng)物供體包括但不限于豬、牛、羊，優(yōu)選豬源性。SIS、 AP、UBM、ADM、CEM是五種最常用的豬脫細(xì)胞基質(zhì)材料，均可以作為本發(fā)明的選擇，其中優(yōu)選
4UBM，從相關(guān)特性檢測(cè)，包括吸水性、降解周期、抗菌性、細(xì)胞相容性、生物力學(xué)性能5個(gè)方面看，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UBM具有最長(zhǎng)的降解周期，最強(qiáng)的抗菌性、最高的吸水性、最好的生物力學(xué)性能、以及優(yōu)秀的組織相容性，非常適合于盆底的特殊環(huán)境。如圖1、2所示，本實(shí)施例中，膀胱脫脫細(xì)胞基質(zhì)2選自于豬的UBM(為表達(dá)清晰，以下出現(xiàn)的UBM 2均是膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)2)，UBM 2作為復(fù)合補(bǔ)片的生物隔離成分，將UBM 2和聚丙烯網(wǎng)片1兩種材料復(fù)合將上述聚丙烯網(wǎng)片1內(nèi)置于兩片所述UBM 2之間，用可吸收縫合線(圖中未示)采用縫合方式連接兩片所述UBM 2，最終將聚丙烯網(wǎng)片1包裹在里面，如圖2所示?？p合線可以是現(xiàn)有技術(shù)中所采用的任何一種醫(yī)用級(jí)可吸收縫合線，比如聚乙交酯-丙交酯材料制成的縫合線。如圖1所示，所述聚丙烯網(wǎng)片1采用長(zhǎng)方形，其中的聚丙烯網(wǎng)片1的纖維11的排列方向與UBM 2的大體纖維21方向(圖中以虛線表示纖維方向)呈 40-50度，最好是45度。采用該結(jié)構(gòu)的補(bǔ)片，聚丙烯纖維11起到“鋼筋”的支架作用，而UBM 2居于外面，不僅加強(qiáng)了 UBM 2的強(qiáng)度，而且不影響UBM 2的組織相容性，并且聚丙烯網(wǎng)片1 的纖維走向基本不會(huì)影響補(bǔ)片的順應(yīng)性，能達(dá)到單純的UBM的順應(yīng)性水平。上述的UBM 2取自于動(dòng)物供體的膀胱，去除粘膜層和漿膜層后獲得膀胱基質(zhì) ’然后對(duì)膀胱基質(zhì)進(jìn)行脫細(xì)胞處理以及凍干處理；消毒后，采用低溫塑封保存。其中，脫細(xì)胞處理時(shí)，需要用脫細(xì)胞液和緩沖液對(duì)膀胱基質(zhì)進(jìn)行反復(fù)浸泡和沖洗。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，該脫細(xì)胞液和緩沖液可以為任何一種適合的產(chǎn)品，優(yōu)選的是脫細(xì)胞液采用三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟的混合液，混合重量比控制在80-120 1。作為優(yōu)選的實(shí)施例，本發(fā)明還可以將干細(xì)胞接種到生物材料上構(gòu)建組織工程材料，即上述的UBM還可以按現(xiàn)有技術(shù)接種BMSCs (bone marrowmesenchymal stem cells骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)，體外培養(yǎng)一周。下面將要詳述的生物學(xué)評(píng)價(jià)，也會(huì)將其列為一個(gè)對(duì)照對(duì)象。下面給出UBM的一個(gè)具體制作方法，但不作為本發(fā)明的限制，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員，還可采用現(xiàn)有技術(shù)中可行的其它方法。1、豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的制備取封閉飼養(yǎng)豬(體重約200kg)死后半小時(shí)內(nèi)的新鮮豬膀胱標(biāo)本，在超凈臺(tái)下用機(jī)械方法除去粘膜層和漿膜層。2、脫細(xì)胞處理第一次處理取一干凈IOOOml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0. 0122g，加入約800ml去離子水，充分?jǐn)噭蛉芙?，調(diào)PH值至8. 0。將溶液到入一干凈 5000ml燒杯中，并將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡。將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)，過(guò)夜。第二次處理取一干凈IOOOml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0. 0122g,加入約800ml去離子水，充分?jǐn)噭蛉芙猓{(diào)PH值至8. 0，然后到入一干凈 5000ml燒杯中，并將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡。將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)。第三次處理取一干凈IOOOml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0. 0122g,加入約800ml去離子水，充分?jǐn)噭蛉芙?，調(diào)PH值至8. 0，然后到入一干凈 5000ml燒杯中，并將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡。將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)，過(guò)夜。第四次處理取一干凈IOOOml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0. 0122g,加入約800ml去離子水，充分?jǐn)噭蛉芙猓{(diào)PH值至8. 0，然后到入一干凈5000ml燒杯中，并將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡。將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)。第五次處理取一干凈500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0. 0122g,吸取20mlTritOn X-100,放入燒杯，加入適量水，充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄈ葜?2000ml，并將溶液轉(zhuǎn)入5000ml燒杯。用適量磷酸鹽緩沖液洗滌膀胱基質(zhì)后放入之前配置的溶液，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)，過(guò)夜。第六次處理取一干凈500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0. 0122g,吸取20mlTritOn X-100,放入燒杯，加入適量水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?2000ml，并將溶液轉(zhuǎn)入5000ml燒杯，將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)。第七次處理取一干凈500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0. 0122g,吸取20mlTritOn X-100,放入燒杯，加入適量水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?2000ml，并將溶液轉(zhuǎn)入5000ml燒杯，將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌，過(guò)夜。第八次處理取一干凈500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟0. 0122g,吸取20mlTritOn X-100,放入燒杯，加入適量水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?2000ml，并將溶液轉(zhuǎn)入5000ml燒杯，將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)。第九次處理配置2000ml的DNA酶及RNA酶的雙酶消化溶液lmol/L的NaCl (含 DNase及RNA酶各40U/ml)，用適量的磷酸鹽緩沖液漂洗膀胱基質(zhì)后，將膀胱基質(zhì)放入雙酶消化液浸泡12小時(shí)，過(guò)夜。第十次處理配置2000ml的DNA酶及RNA酶的雙酶消化溶液，并將膀胱基質(zhì)放入雙酶消化液浸泡12小時(shí)。第i^一次處理取一干凈500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和20g 十二烷基硫酸鈉，放入燒杯，加入適量水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?000ml。用適量磷酸鹽緩沖液漂洗膀胱基質(zhì)后放入之前配置的溶液，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)，過(guò)夜。第十二次處理取一干凈500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和20g 十二烷基硫酸鈉，放入燒杯，加入適量水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?000ml后到入5000ml的燒杯中，將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)。第十三次處理取一干凈500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和20g 十二烷基硫酸鈉，放入燒杯，加入適量水，充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄈ葜?000ml后到入5000ml的燒杯中，將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)，過(guò)夜。第十四次處理取一干凈500ml的燒杯，稱取12. Ilg三羥甲基氨基甲烷和20g 十二烷基硫酸鈉，放入燒杯，加入適量水，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?000ml后到入5000ml的燒杯中，將膀胱基質(zhì)放入燒杯浸泡，將燒杯置于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)。第十五次處理配置2000ml的磷酸鹽緩沖液，并將膀胱基質(zhì)放入漂洗12小時(shí)，過(guò)夜。第十六次處理配置2000ml的磷酸鹽緩沖液，并將膀胱基質(zhì)放入漂洗12小時(shí)。第十七次處理配置2000ml的磷酸鹽緩沖液，并將膀胱基質(zhì)放入漂洗12小時(shí)，過(guò)夜。
第十八次處理配置2000ml的磷酸鹽緩沖液，并將膀胱基質(zhì)放入漂洗12小時(shí)。3、凍干處理上述處理后的膀胱已經(jīng)成為脫細(xì)胞UBM，取出后程序性降溫到-80攝氏度16小時(shí)。4、消毒處理C060 γ射線照射除菌，4°C保存?zhèn)溆?。下面以?dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)入植入試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明獲得的復(fù)合補(bǔ)片材料作體內(nèi)生物學(xué)反應(yīng)評(píng)價(jià)。主要包括單純UBM、接種BMSCs的UBM、復(fù)合聚丙烯的UBM以及單純聚丙烯網(wǎng)片等四種不同材料作為盆底修復(fù)生物補(bǔ)片植入體內(nèi)的生物反應(yīng)性。一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠SPF級(jí)，200 士 10g，第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
.、主要試劑及材料
DMEM/A2培養(yǎng)基胎牛血清胰蛋白酶 EDTA
無(wú)水乙醇(分析純) 戊巴比妥鈉
兔抗大鼠CD8多克隆抗體(bs-0648R)
Gibco公司 Hyclone 公司 Sigma公司 Sigma公司
成都科龍化學(xué)試劑廠 Sigma公司
北京博奧森公司
北京博奧森公司北京博奧森公司北京博奧森公司北京博奧森么Y司北京博奧森公司
兔抗大鼠CD4多克隆抗體(bs-0766R) 兔抗大鼠CCR4多克隆抗體(bs-1168R) 兔抗大鼠CXCR3多克隆抗體(bs-2209RR)
生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG
DAB染色試劑盒三、主要試劑配制1.0. 25%胰蛋白酶溶液胰蛋白酶0. 25g用D-HanlT s液IOOml溶解混勻，經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌， 分裝成細(xì)1/瓶，_20°C保存?zhèn)溆谩?. PBS 溶液成品PBS粉末，加ddH20 100ml、攪拌使之完全溶解，轉(zhuǎn)入2000ml容量瓶中，加 ddH20至刻度線，混勻，測(cè)量pH值為7. 5。分裝至500ml、100ml玻璃瓶中，高壓蒸汽消毒滅菌后，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?.青霉素、鏈霉素雙抗培養(yǎng)基青霉素溶液的配制青霉素80萬(wàn)單位加生理鹽水至80ml，依照公式計(jì)算其濃度為 10000U/ml,0. 22um微孔濾器過(guò)濾后分裝，-20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)按的比例加入培養(yǎng)基中。鏈霉素溶液的配制取鏈霉素1. 0g，加無(wú)菌生理鹽水至100ml，則濃度為10000μ g/ml， 0. 22 μ m微孔濾器過(guò)濾后分裝，-20°c儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)按1 %的比例加入培養(yǎng)基中。4. DMEM-F12 全培養(yǎng)基DMEM_F12+10%胎牛血清+1%青/鏈霉素四、試驗(yàn)方法(一 )植入補(bǔ)片1.實(shí)驗(yàn)分為5組，每組12只大鼠，分別植入U(xiǎn)BM，接種BMSCs的UBM，復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM(上述實(shí)施例獲得)，單純聚丙烯網(wǎng)片，假手術(shù)組。2.用手術(shù)剪剪開陰道粘膜，將UBM，接種BMSCs的UBM，復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM，單純聚丙烯網(wǎng)片植入陰道粘膜下方，假手術(shù)組不植入任何材料，其余操作程序相同；3.縫合創(chuàng)口，在創(chuàng)口上涂抹金霉素，防止感染。4.在手術(shù)后1，2，3，4周處死大鼠，每次3只，觀察植入具備的大體變化，取植入組織及周圍組織，10%中性甲醛固定，進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)。( 二 )植入組織的組織學(xué)檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)1.固定的組織進(jìn)行石蠟切片和HE染色，同時(shí)制備白片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)；2.免疫組化檢測(cè)1)取白片于60°C恒溫箱中烘烤20分鐘；2)將組織切片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后在浸泡10分鐘；3)無(wú)水乙醇中浸泡五分鐘；4)95%乙醇中浸泡五分鐘；5) 75%乙醇中浸泡五分鐘；6)蒸餾水沖洗，置PBS浸泡5分鐘；7)用水浴鍋將0. OlM枸櫞酸鈉緩沖液(pH6. 0)加熱至95°C左右，放入組織切片加熱10-15分鐘，進(jìn)行抗原修復(fù)；8)滴加3% H202,室溫孵育15min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；9) PBS沖洗，每次2分鐘，共3次；10)加10%山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘；11)傾去血清，滴加一抗，37°C孵育濁后，4°C濕盒過(guò)夜。12)取孵育過(guò)夜的切片，PBS沖洗，每次2分鐘，共3次；13)滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(l% BSA-PBS稀釋)，37°C孵育20分鐘；14) PBS沖洗，每次2分鐘，共3次；15)滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37°C孵育20分鐘；16) PBS沖洗，每次2分鐘，共3次；17)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，鏡下觀察顯色結(jié)果；18)自來(lái)水充分沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。五、試驗(yàn)結(jié)果(一)大體觀察植入試驗(yàn)1周后，可見單純植入的UBM顏色輕微淡黃，接種BMSCs的UBM顏色較單純的UBM顏色稍淺，而單純聚丙烯網(wǎng)片組有輕微感染現(xiàn)象，復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM顏色較
8深，肉眼觀察效果較UBM和接種BMSCs的UBM要差，但明顯優(yōu)于單純聚丙烯網(wǎng)片，假手術(shù)組沒(méi)有明顯異常，未見感染。植入后第2周，植入的UBM與1周前無(wú)顯著變化，接種BMSCs的 UBM與大鼠自身組織有融合現(xiàn)象，植入組織變輕微淡黃，單純聚丙烯網(wǎng)片組未與大鼠組織融合，界限清楚，復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM變?yōu)檩p微淡黃，聚丙烯網(wǎng)片與組織鑲嵌長(zhǎng)在一起。植入后第3周，單純植入的UBM已無(wú)法在體內(nèi)明顯分辯，植入部分有輕微淡黃變化，植入的UBM 大部分可能發(fā)生了降解，接種BMSCs的UBM也已無(wú)法辨別，單純聚丙烯網(wǎng)片的植入部分有結(jié)痂出現(xiàn)，復(fù)合聚丙烯的UBM補(bǔ)片未找到植入的UBM，可見聚丙烯網(wǎng)片融合于植入局部。第4 周的觀察結(jié)果與第3周無(wú)明顯差異。( 二 )植入部位的組織學(xué)變化單純UBM植入組植入一周后可見明顯的炎癥反應(yīng)，此后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，炎癥反應(yīng)逐漸減輕，但至第四周時(shí)，任有輕微的炎癥反應(yīng)。接種BMSCs的UBM植入一周后亦發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)，但其程度明顯低于單純UBM植入組，此后隨時(shí)間延長(zhǎng)，炎癥反應(yīng)逐漸降低，至第四周時(shí)，植入局部的組織內(nèi)僅有極少量的炎癥細(xì)胞，其在植入后的各階段，炎癥反應(yīng)皆明顯低于單純UBM植入組。單純聚丙烯網(wǎng)片植入組具有較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，明顯高于其他各組， 且這種強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)伴隨于整個(gè)試驗(yàn)觀察階段。復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM植入組的炎癥反應(yīng)與單純UBM植入組類似，初期較為強(qiáng)烈，此后逐漸降低。假手術(shù)組未見明顯的炎癥反應(yīng)。(三)免疫組化檢測(cè)結(jié)果(1)⑶4免疫組化檢測(cè)結(jié)果單純UBM植入組植入第1周和第2周⑶4細(xì)胞比例分別為37. 1 士 9. 4 % 和27. 9士8. 1 %,此后其比例迅速下降，第3周和第4周比例分別為10. 6士5. 1 %和 8. 3士2. 9%。接種BMSCs的UBM植入后反應(yīng)與單純UBM組類似，但⑶4細(xì)胞在植入后各階段均低于UBM組，其第1周至第4周植入局部組織的⑶4細(xì)胞比例分別為28. 5士4.7%， 18. 2士3. 5%,8. 3士3. 2%和5. 6士2. 4%。而單純聚丙烯網(wǎng)片組在植入后各階段的⑶4細(xì)胞比例均維持在一個(gè)較高的水平，其第1周至第4周植入局部組織的CD4細(xì)胞比例分別為 62. 9士 11. 7%，43. 5士8. 7%，39. 2士7. 4%和 38. 7士6. 9%。復(fù)合聚丙烯的 UBM 組植入后的反應(yīng)趨勢(shì)與UBM組合接種BMSCs的UBM類似，但植入后各階段⑶4細(xì)胞比例均高于以上兩組，而顯著低于單純聚丙烯網(wǎng)片組，其第1周至第4周植入局部組織的⑶4細(xì)胞比例分別為46. 3士 10. 5%，32. 6士5. 4%，28. 9士4. 3%和 16. 4士3. 5%。對(duì)照組在各階段的 CD4 細(xì)胞比例均顯著低于其他各組，其第1周至第4周植入局部組織的⑶4細(xì)胞比例分別為 5. 6士2. 3%，4. 8士2. 7%，6. 4士2. 9%和 5. 3士 1. 7%。參見圖 3。(2)⑶8免疫組化檢測(cè)結(jié)果單純UBM植入組植入第1周和第2周⑶8細(xì)胞比例分別為21. 6 士 3. 3 % 和21. 5士2. 7 %，此后其比例迅速下降，第3周和第4周比例分別為6. 2士2. 4 %和 5. 5士 2.8%。接種BMSCs的UBM植入后反應(yīng)與單純UBM組類似，其第1周至第4周植入局部組織的 CD8 細(xì)胞比例分別為23. 4士3. 9%，21. 3士3. 5%，8. 1 士2. 7%和 7. 5士2. 7%。而單純聚丙烯網(wǎng)片組在植入后各階段的CD8細(xì)胞比例均維持在一個(gè)較高的水平，其第1周至第4周植入局部組織的CD8細(xì)胞比例分別為37. 3 士4. 6 %，34. 4士 3. 5 %，32. 6 士 2. 8 %和 30. 7士3. 6%。復(fù)合聚丙烯的UBM組植入后的反應(yīng)趨勢(shì)與UBM組合接種BMSCs的UBM類似， 但植入后各階段CD8細(xì)胞比例均高于以上兩組，而顯著低于單純聚丙烯網(wǎng)片組，其第1周至第4周植入局部組織的CD8細(xì)胞比例分別為25. 7 士 2. 9 %，23. 4 士 3. 2 %，12. 6 士 2. 7 %和 10.4 士 3.6%。對(duì)照組在各階段的⑶8細(xì)胞比例均顯著低于其他各組，其第1周至第4周植入局部組織的CD8細(xì)胞比例分別為6. 1 士2. 3%，5. 4士2. 8%，6. 8士 1. 9%和6. 3士 1. 2%。 參見圖4。(3) CCR4免疫組化檢測(cè)結(jié)果單純UBM植入組植入第1周CCR4細(xì)胞比例為12. 3士2. 1 %，第2周迅速增加至55. 5士5.6%，第3周和第4周發(fā)生回落，分別為13. 2士2. 2%和12. 3士3.7%。接種 BMSCs的UBM植入后反應(yīng)趨勢(shì)與單純UBM組類似，其第1周至第4周植入局部組織的CCR4 細(xì)胞比例分別為13. 4 士 2. 3%，62. 3 士 5. 3%，17. 9 士 2. 5% 和 15. 7 士 2. 3 %，除第一周外， 其與各周的比例均顯著高于UBM組。單純聚丙烯網(wǎng)片組在植入后各階段的CCR4細(xì)胞比例均維持在一個(gè)較低的水平，其第1周至第4周植入局部組織的CCR4細(xì)胞比例分別為 6. 3士 1. 4%，8. 4士2. 3%，6. 2士2. 7%和7. 3士 1. 8%。復(fù)合聚丙烯的UBM組植入后的反應(yīng)趨勢(shì)與UBM組合接種BMSCs的UBM類似，但植入后各階段CCR4細(xì)胞比例均低于以上兩組， 而顯著高于單純聚丙烯網(wǎng)片組，其第1周至第4周植入局部組織的CCR4細(xì)胞比例分別為 9. 3士2. 7%, 24. 6士3. 5%,9. 6士2. 3%和8. 4士3. 1 %。對(duì)照組在各階段的CCR4細(xì)胞比例均顯著低于其他各組，其第1周至第4周植入局部組織的CCR4細(xì)胞比例分別為2. 3士 1. 6%， 3. 8士2. 4%，1. 9士 1. 5%和 3. 2士 1. 2%。見圖 5。(4) CXCR3免疫組化檢測(cè)結(jié)果單純UBM植入組植入第1周0乂0 3細(xì)胞比例為23.8士4.6%，第2周回落至
16.6士3. 2%，第3周和第4周分別為9. 6士2. 4%和5. 3士2. 6%。接種BMSCs的UBM植入后反應(yīng)趨勢(shì)與單純UBM組類似，其第1周至第4周植入局部組織的CXCR3細(xì)胞比例分別為 8. 9士2. 3%,7. 8士2. 1%,6. 3士2. 和3. 2士 1. 3%，各周的比例均顯著低于UBM組。單純聚丙烯網(wǎng)片組在植入后各階段的CXCR3細(xì)胞比例均維持在一個(gè)較高的水平，其第1周至第 4周植入局部組織的CXCR3細(xì)胞比例分別為43. 7 士 6. 4 %，38. 9 士 7. 3 %，26. 4 士 5. 4 %和
17.6 士6. 3%。復(fù)合聚丙烯的UBM組植入后的反應(yīng)趨勢(shì)與UBM類似，但植入后各階段CXCR3 細(xì)胞比例均高于UBM組，而顯著低于單純聚丙烯網(wǎng)片組，其第1周至第4周植入局部組織的 CXCR3 細(xì)胞比例分別為32. 6士7. 3%，29. 3士5.7%，18. 6士4. 3%和 12. 1 士2. 5%。對(duì)照組在各階段的CXCR3細(xì)胞比例均顯著低于其他各組，其第1周至第4周植入局部組織的CXCR3 細(xì)胞比例分別為4. 6士 1. 3%,5. 3士 1. 8%,4. 3士2. 和 4. 6士 1. 8%。見圖 6。上述的檢測(cè)結(jié)果表明不同的材料作為盆底修復(fù)補(bǔ)片，其與植入組織的融合程度各不相同。UBM和接種BMSCs的UBM至第三周時(shí)已不能從植入部位分辨出來(lái)，僅能在植入部位觀察到有微黃變化，可能是未降解的組織與體內(nèi)組織發(fā)生融合所致。接種BMSCs的UBM 相對(duì)單純的UBM材料，其更易與植入部位的組織發(fā)生融合，其原因可能是接種有細(xì)胞的材料在植入初期相對(duì)未接種細(xì)胞的材料，材料內(nèi)部具有較多的細(xì)胞，能表達(dá)更多的纖維連接蛋白等基質(zhì)蛋白，因此更易于與植入局部組織發(fā)生融合。至試驗(yàn)觀察期結(jié)束時(shí)，單純的聚丙烯材料仍無(wú)法和植入部位發(fā)生融合，而通過(guò)夾心方法將聚丙烯材料夾在UBM材料之間有助于聚丙烯材料與植入部位的組織發(fā)生融合，在植入后第二周時(shí)，就與植入部位的組織發(fā)生融合。植入材料與植入部位的有效融合，將有利于促進(jìn)植入材料修復(fù)作用的發(fā)揮，因此復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM，相對(duì)單純的UBM或聚丙烯材料，具有明顯的使用優(yōu)勢(shì)。
10
材料植入初期皆有一定的炎癥反應(yīng)，但UBM和接種BMSCs的UBM的炎癥反應(yīng)隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，但單純的聚丙烯材料，在整個(gè)植入周期均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。復(fù)合聚丙烯的UBM的炎癥反應(yīng)與UBM反應(yīng)趨勢(shì)移植，其炎癥反應(yīng)程度要顯著低于單純聚丙烯材料組，表明復(fù)合聚丙烯的UBM材料中UBM具有一定的炎癥隔離作用。相對(duì)單純的 UBM，接種有BMSCs的UBM引發(fā)的炎癥反應(yīng)程度要低，原因可能是植入的干細(xì)胞與不同的免疫細(xì)胞相互作用發(fā)生免疫調(diào)節(jié)，在部分程度上抑制了免疫排斥的發(fā)生。在材料植入體內(nèi)的免疫排斥方面，接種BMSCs的UBM是本試驗(yàn)評(píng)價(jià)的四種不同材料中具有較低免疫反應(yīng)性材料，其次為單純的UBM，最差的為單純聚丙烯網(wǎng)片。通過(guò)對(duì)植入局部組織內(nèi)的細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果顯示，UBM組在植入初期CD4細(xì)胞比值較高，至第3周時(shí)才逐漸降低，接種BMSCs的UBM在植入初期盡管⑶4細(xì)胞比例有所升高，但顯著低于UBM 組，單純的聚丙烯網(wǎng)片組在整個(gè)植入期內(nèi)均維持一個(gè)較高的⑶4比例，而復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM植入后⑶4細(xì)胞比例趨勢(shì)與UBM類似，但在植入后各階段均顯著高于UBM組，且顯著低于單純居丙烯補(bǔ)片組。各組植入后⑶8細(xì)胞的趨勢(shì)與⑶4類似，但比值顯著低于⑶4細(xì)胞比值。結(jié)果顯示接種BMSCs的UBM和單純UBM組在第二周時(shí)CCR4細(xì)胞比值較高，而聚丙烯網(wǎng)片在植入后各階段的CCR4細(xì)胞比值均較低，復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM介于二者之間，CXCR3 細(xì)胞比值在各組中與CCR4正好相反，表明UBM作為盆底修復(fù)補(bǔ)片具有移植適應(yīng)的作用，并且可以利用UBM的這種特性改進(jìn)聚丙烯網(wǎng)片的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)利用干細(xì)胞接種技術(shù)還可進(jìn)一步誘導(dǎo)植入材料向免疫適應(yīng)分化。總之，UBM作為盆底修復(fù)補(bǔ)片具有引發(fā)的炎癥和免疫反應(yīng)較小，且誘導(dǎo)免疫反應(yīng)向免疫適應(yīng)轉(zhuǎn)變，且UBM還可修飾聚丙烯網(wǎng)片，起到炎癥隔離和免疫調(diào)節(jié)的作用，本發(fā)明中的復(fù)合聚丙烯網(wǎng)片的UBM是盆底修復(fù)材料的一種優(yōu)秀選擇。值得注意的是，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非因此限定本發(fā)明的專利保護(hù)范圍，本發(fā)明還可以對(duì)上述各種零部件的構(gòu)造進(jìn)行材料和結(jié)構(gòu)的改進(jìn)，或者是采用技術(shù)等同物進(jìn)行替換。故凡運(yùn)用本發(fā)明的說(shuō)明書及圖示內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變化，或直接或間接運(yùn)用于其他相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域均同理皆包含于本發(fā)明所涵蓋的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于女性盆底的生物復(fù)合補(bǔ)片，其特征在于，在聚丙烯網(wǎng)片的表面包裹有動(dòng)物供體的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)片，其特征在于，所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)還接種有BMSCs。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)片，其特征在于，所述聚丙烯網(wǎng)片為長(zhǎng)方形、正方形、圓形或異形體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的補(bǔ)片，其特征在于，所述聚丙烯纖維的排列方向與膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的纖維方向呈25-75度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的補(bǔ)片，其特征在于，所述聚丙烯網(wǎng)片的纖維的排列方向與膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的纖維方向呈40-50度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)片，其特征在于，所述聚丙烯網(wǎng)片內(nèi)置于兩片所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)之間，可吸收縫合線連接兩片所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)，將聚丙烯網(wǎng)片包裹于內(nèi)。
7.一種用于女性盆底的生物復(fù)合補(bǔ)片的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)取動(dòng)物供體的膀胱，去除粘膜層和漿膜層，獲得膀胱基質(zhì)；對(duì)膀胱基質(zhì)進(jìn)行脫細(xì)胞處理以及凍干處理；消毒后，低溫塑封保存；(2)取聚丙烯網(wǎng)片，將上述獲得的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)包裹于所述聚丙烯網(wǎng)片的表面。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)具體為將聚丙烯網(wǎng)片內(nèi)置于兩片所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)之間，用可吸收縫合線將兩片所述膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)縫合， 使得聚丙烯網(wǎng)片包裹于內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的膀胱基質(zhì)的脫細(xì)胞過(guò)程為采用脫細(xì)胞液和緩沖液對(duì)膀胱基質(zhì)進(jìn)行反復(fù)浸泡和沖洗。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述脫細(xì)胞液為三羥甲基氨基甲烷和苯甲基磺酰氟的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于女性盆底的生物復(fù)合補(bǔ)片及其制造方法，該補(bǔ)片在聚丙烯網(wǎng)片的表面包裹有動(dòng)物供體的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。對(duì)取自于動(dòng)物供體的膀胱，需要進(jìn)行脫細(xì)胞處理以及凍干處理；消毒后，低溫塑封保存；然后將上述獲得的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)包裹于所述聚丙烯網(wǎng)片的表面。本發(fā)明將生物材料和無(wú)機(jī)材料進(jìn)行有效的結(jié)合，綜合二者的各自優(yōu)勢(shì)，獲得了明顯優(yōu)良的使用效果。其中，外層的膀胱基質(zhì)能夠起到隔離聚丙烯網(wǎng)片和宿主組織的作用，能顯著提高生物相容性。補(bǔ)片被植入后，可誘導(dǎo)患者纖維組織長(zhǎng)入，最后形成患者自身纖維組織的修復(fù)。
文檔編號(hào)A61L27/16GK102266585SQ201110203098
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者劉祿斌, 徐惠成, 梁志清, 王延洲 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院