專利名稱：一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物載體，具體地說，是一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備方法及在體外Hela宮頸癌細(xì)胞治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，有效地治療癌癥一直是世界矚目的研究課題。反義核酸技術(shù)是近年發(fā)展的一種基因治療腫瘤的有效方法，它以腫瘤發(fā)生相關(guān)基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過人工合成的反義寡核苷酸與之特異性互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶向基因的表達(dá)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，具有高選擇性、高效率、低毒性等特點(diǎn)。但是由于單純的反義寡聚核苷酸很難進(jìn)入腫瘤細(xì)胞或被降解而達(dá)不到治療效果。研究表明通過選擇合適的藥物載體輸送， 可大大提高治療惡性腫瘤的效果。因此，發(fā)展高效安全的基因載體系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要意義。圖1為已知的高嶺土納米管的透射電鏡圖。高嶺土納米管是一種類似碳納米管的一維納米管狀結(jié)構(gòu)材料。高嶺土納米管是層狀結(jié)構(gòu)硅酸鹽礦物，是由一層硅氧四面體和一層鋁氧八面體通過共同的氧原子互相連接形成一個(gè)晶層單元，為1 1型層狀硅酸鹽。高嶺土納米管的表面含有如下官能團(tuán)-Si(Al)-0H，-Si-O-Al-和-Si(Al)-O,這些活性官能團(tuán)使高嶺土的內(nèi)表面帶正電荷，外表面帶負(fù)電荷，表面所帶電荷的不同為高嶺土納米管表面改性打下了基礎(chǔ)。高嶺土納米管表面改性可以通過物理、化學(xué)方法對高嶺土納米管表面進(jìn)行處理，以改變其表面的物理化學(xué)性質(zhì)(如表面電性、表面能、官能團(tuán)、表面吸附性和反應(yīng)特性等)。通過功能化修飾的高嶺土納米管在聚合物/納米高嶺土復(fù)合材料、生物醫(yī)學(xué)、 抗菌材料、貯能材料等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的零維納米顆粒相比，高嶺土納米管在藥物載體上的應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn) 1)功能化的高嶺土納米管具有良好的生物相容性，對生物體系的毒性??；2)高嶺土納米管具有較大的比表面積，為藥物、蛋白質(zhì)、DNA及核酸等提供了更多的負(fù)載空間，大大提高負(fù)載量；3)高嶺土納米管的表面特性使其可以被有效地表面功能化，通過修飾帶有不同功能的官能團(tuán)，應(yīng)用于不同生物體系的研究。生存素(survivin)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白(IAP)，它主要抑制凋亡中主要的效應(yīng)蛋白酶caSpaSe3和caSpaSe7來介導(dǎo)凋亡的抑制。在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達(dá)豐富，但在相應(yīng)正常組織中不表達(dá)，這種選擇性表達(dá)特性使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)。而針對生存素(survivin)基因作為藥物治療靶點(diǎn)，負(fù)載其反義寡聚核苷酸的高嶺土納米管基藥物載體未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提出一種新型功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備方法。
本發(fā)明的另一目的，在于提出一種新型功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體對體外Hela宮頸癌細(xì)胞治療中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備，其特征在于包括以下步驟A)將3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在甲苯中，其體積比為2 25，再加入高嶺土納米管粉末，高嶺土納米管粉末與3-氨丙基三乙氧基硅烷的質(zhì)量體積比為0.6g 2ml ； 30-80HZ超聲波分散10-20分鐘；B)將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應(yīng)20小時(shí)后，通過過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物；C)用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應(yīng)產(chǎn)物3-5次除去未反應(yīng)的有機(jī)硅烷，烘干干燥后即獲得功能化高嶺土納米管粉末；D)取步驟C)中的功能化高嶺土納米管粉末溶解在水中，配成0. 2g/L的功能化高嶺土納米管水溶液；E)取一定量的功能化高嶺土納米管水溶液中加入20 μ mol/L的反義寡聚核苷酸， 反義寡聚核苷酸與功能化高嶺土納米管的體積比為1.5 1 ；再加入無菌二次蒸餾水，室溫下?lián)u床反應(yīng)4小時(shí)；F)待反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1-2次離心處理，去掉上清液；G)將步驟F)所得物質(zhì)重新分散到二次蒸餾水中，得到穩(wěn)定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的應(yīng)用，其特征在于，介導(dǎo)反義寡聚核苷酸進(jìn)入細(xì)胞，以較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，在體外Hela宮頸癌細(xì)胞治療中的應(yīng)用。采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備及應(yīng)用具有以下優(yōu)點(diǎn)1、制備方法簡單、快速；2、該載體具有轉(zhuǎn)染率高、靶向性強(qiáng)，抑制腫瘤細(xì)胞效果明顯；3、對不同的生物體系以功能化高嶺土納米管為載體輸送不同的靶向性生物分子或藥物為其它腫瘤或疾病的治療提供了一條新途徑。


圖1為已知的高嶺土納米管的透射電鏡圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例的功能化高嶺土納米管的透射電鏡圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例的帶有FAM熒光素標(biāo)記的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體和Hela細(xì)胞孵育4小時(shí)后流式細(xì)胞儀測定其轉(zhuǎn)染率圖，未處理的Hela細(xì)胞作為對照；圖4為本發(fā)明實(shí)施例的采用噻唑藍(lán)法分別檢測功能化高嶺土納米管，裸露的反義寡聚核苷酸，功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體對Hela細(xì)胞孵育不同時(shí)間 (24,48,72小時(shí))后的細(xì)胞抑制率示意圖，未處理的Hela細(xì)胞作為對照。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例及其附圖對本發(fā)明作更進(jìn)一步說明。圖2為本發(fā)明實(shí)施例的功能化高嶺土納米管的透射電鏡圖。本發(fā)明的新型功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備中，首先對高嶺土納米管進(jìn)行功能化修飾，提高了其水溶性并使其表面帶正電荷，并通過靜電組裝負(fù)載反義寡聚核苷酸，構(gòu)建成一種新型功能化高嶺土納米管反義核酸復(fù)合體。該復(fù)合體作用于體外培養(yǎng)的Hela宮頸癌細(xì)胞，可有效地介導(dǎo)反義核酸進(jìn)入細(xì)胞，具有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，并且顯著提高反義核酸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡效率，增強(qiáng)其抗腫瘤活性。實(shí)施例1本發(fā)明的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備，其特征在于包括以下步驟a、將lml3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在12. 5ml甲苯中，加入約0. 3克的高嶺土納米管粉末，充分30-80HZ超聲波分散10-20分鐘；b、將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應(yīng)20小時(shí)后，通過過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物；c、用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應(yīng)產(chǎn)物3-5次除去未反應(yīng)的有機(jī)硅烷，烘干干燥后即獲得功能化高嶺土納米管粉末；d、取2mg功能化高嶺土納米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0. 2mg/ml的高嶺土水溶液；e、取上述高嶺土水溶液10 μ L，加入20 μ M反義寡聚核苷酸15 μ L，再加入無菌的二次蒸餾水至1ml，室溫下?lián)u床反應(yīng)4小時(shí)；f、待反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1-2次離心處理，去掉上清液(即棄除溶液中游離的反義寡聚核苷酸)；g、將步驟f所得物質(zhì)重新分散到二次蒸餾水中，得到穩(wěn)定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。實(shí)施例2本發(fā)明的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備，其特征在于包括以下步驟a、將2ml3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在25ml甲苯中，加入約0. 6克的高嶺土納米管粉末，充分30-80HZ超聲波分散10-20分鐘；b、將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應(yīng)20小時(shí)后，通過過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物；c、用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應(yīng)產(chǎn)物3-5次除去未反應(yīng)的有機(jī)硅烷，烘干干燥后即獲得功能化高嶺土納米管粉末；d、取2mg功能化高嶺土納米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0. 2mg/ml的高嶺土水溶液；e、取上述高嶺土水溶液10 μ L，加入20 μ M反義寡聚核苷酸15 μ L，再加入無菌的二次蒸餾水至1ml，室溫下?lián)u床反應(yīng)4小時(shí)；f、待反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1-2次離心處理，去掉上清液(即棄除溶液中游離的反義寡聚核苷酸)；g、將步驟f所得物質(zhì)重新分散到二次蒸餾水中，得到穩(wěn)定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。實(shí)施例3本發(fā)明的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備，其特征在于包括以下步驟a、將3ml3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在37. 5ml甲苯中，加入約0. 9克的高嶺土納米管粉末，充分30-80HZ超聲波分散10-20分鐘；b、將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應(yīng)20小時(shí)后，通過過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物；c、用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應(yīng)產(chǎn)物3-5次除去未反應(yīng)的有機(jī)硅烷，烘干干燥后即獲得功能化高嶺土納米管粉末；d、取2mg功能化高嶺土納米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0. 2mg/ml的高嶺土水溶液；e、取上述高嶺土水溶液10 μ L，加入20 μ M反義寡聚核苷酸15 μ L，再加入無菌的二次蒸餾水至1ml，室溫下?lián)u床反應(yīng)4小時(shí)；f、待反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1-2次離心處理，去掉上清液(即棄除溶液中游離的反義寡聚核苷酸)；g、將步驟f所得物質(zhì)重新分散到二次蒸餾水中，得到穩(wěn)定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。實(shí)施例4功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的應(yīng)用功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的測定用帶有FAM熒光素標(biāo)記的反義寡聚核苷酸取代單純的反義寡聚核苷酸制備功能化高嶺土納米管反義核酸復(fù)合體來考察該藥物載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。將帶有FAM熒光素標(biāo)記的功能化高嶺土納米管反義核酸復(fù)合體加入到對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞中，在37°C 5% CO2 飽和溫度下培養(yǎng)4小時(shí)。取未經(jīng)任何處理的對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，作為陰性對照。胰酶消化后，用70%的乙醇固定。用流式細(xì)胞儀檢測他們的轉(zhuǎn)染率。該復(fù)合藥物的轉(zhuǎn)染率可以達(dá)到95%以上，說明功能化高嶺土納米管可以作為一種很好的藥物載體應(yīng)用于生物領(lǐng)域。Hela宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)Hela宮頸癌細(xì)胞株購買自中科院細(xì)胞庫。取每孔6000個(gè)Hela宮頸癌細(xì)胞在含 10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，370C 5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)期生長細(xì)胞。細(xì)胞抑制率的測定將功能化高嶺土納米管(f-HNTs)，裸露的反義寡聚核苷酸(naked ASODNs)和功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸(f-HNTs-APTES-ASODNs)分別加入到對數(shù)生長期的 Hela細(xì)胞中，在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)Mh。取未經(jīng)任何處理的對數(shù)生長期的Hela 細(xì)胞，作為陰性對照，通過噻唑藍(lán)法(MTT)檢測細(xì)胞的抑制率。與裸露的反義寡聚核苷酸相比，功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體可明顯提高反義寡聚核苷酸的抑制腫瘤細(xì)胞的效率。裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細(xì)胞抑制率為6 %，而功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到20%。實(shí)施例5功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的應(yīng)用
除在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)48h，裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細(xì)胞抑制率為7%，功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到25%外，其余同實(shí)施例2。實(shí)施例6除在37°C 5% CO2飽和溫度下培養(yǎng)72h，裸露的反義寡聚核苷酸的腫瘤細(xì)胞抑制率為9%，功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到外，其余同實(shí)施例2。以上實(shí)施例僅供說明本發(fā)明之用，而非對本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變換或變化。因此，所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)該屬于本發(fā)明的范疇，應(yīng)由各權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
1.一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備方法，其特征在于包括以下步驟A)將3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在甲苯中，其體積比為2 25，再加入高嶺土納米管粉末，高嶺土納米管粉末與3-氨丙基三乙氧基硅烷的質(zhì)量體積比為0. 6g 2ml ；30-80HZ 超聲波分散10-20分鐘；B)將上述混合物在65°C條件下回流攪拌反應(yīng)20小時(shí)后，通過過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物；C)用甲苯和水洗滌處理步驟B)得到的反應(yīng)產(chǎn)物3-5次除去未反應(yīng)的有機(jī)硅烷，烘干干燥后即獲得功能化高嶺土納米管粉末；D)取步驟C)中的功能化高嶺土納米管粉末溶解在水中，配成0.2g/L的功能化高嶺土納米管水溶液；E)取一定量的功能化高嶺土納米管水溶液中加入20μ mol/L的反義寡聚核苷酸，反義寡聚核苷酸與功能化高嶺土納米管的體積比為1.5 1 ；再加入無菌二次蒸餾水，室溫下?lián)u床反應(yīng)4小時(shí)；F)待反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1-2次離心處理，去掉上清液；G)將步驟F)所得物質(zhì)重新分散到二次蒸餾水中，得到穩(wěn)定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。
2.一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的應(yīng)用，其特征在于介導(dǎo)反義寡聚核苷酸進(jìn)入細(xì)胞，以較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，在體外Hela宮頸癌細(xì)胞治療中的應(yīng)用。
全文摘要
一種功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸藥物載體的制備方法及其應(yīng)用，其步驟為將3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在甲苯中，再加入高嶺土納米管粉末；超聲波分散；將混合物回流攪拌反應(yīng)后，通過過濾得到反應(yīng)產(chǎn)物；用甲苯和水洗滌處理得到的上述反應(yīng)產(chǎn)物除去未反應(yīng)的有機(jī)硅烷，烘干干燥后即獲得功能化高嶺土納米管粉末；取功能化高嶺土納米管粉末溶解在水中，配成功能化高嶺土納米管水溶液；取一定量的功能化高嶺土納米管水溶液中加入反義寡聚核苷酸，反義寡聚核苷酸；再加入無菌二次蒸餾水，室溫下?lián)u床反應(yīng)；待反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)若干次離心處理，去掉上清液；將所得物質(zhì)重新分散到二次蒸餾水中，得到穩(wěn)定的功能化高嶺土納米管-反義寡聚核苷酸溶液。
文檔編號A61K48/00GK102343101SQ201110203268
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者石寅峰, 賈能勤 申請人:上海師范大學(xué)