專利名稱：阿魏種子提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及阿魏種子提取物抗腫瘤活性及其制備方法和在保健食品、藥品方面的用途。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年度報(bào)道，1996年全球58億人口中因癌癥死亡的有630萬(wàn)人，約占總死亡人數(shù)的12%，其中近60%為肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、口腔癌、肝癌、宮頸癌及食管癌，是僅次于心血管疾病的第2大死因。從1996年以來(lái)全球每年新確診的腫瘤患者均在1030萬(wàn)以上，到1999年底全球腫瘤患者總數(shù)已逾4000萬(wàn)人。世界衛(wèi)生組織2001年報(bào)道，世界癌癥發(fā)病率和死亡率比1990年上升了 22%，今后20年還將上升大約50%。從天然產(chǎn)物中尋找抗腫瘤藥物，有著現(xiàn)實(shí)意義。
阿魏為傘形科(Umbelliferae)阿魏屬植物，是我國(guó)人民應(yīng)用歷史悠久的中藥之一。中華人民共和國(guó)藥典載收載的阿魏為新疆阿魏Ferula sinkiangensis K. M. Shen或阜康阿魏Ferula fukangensis K. M. Shen的樹(shù)脂[I]。阿魏屬植物所分泌的具有特殊蔥蒜樣臭味的油膠樹(shù)脂，具有截瘧、止痢、解毒、除臭、殺蟲(chóng)、消積、祛痰、疏風(fēng)等作用，在維吾爾、哈薩克等民間常用于治療肉食積滯、瘀血痞塊、蟲(chóng)積腹痛等癥、具有極高的藥用價(jià)值。對(duì)阿魏的研究國(guó)外較多，近年來(lái)由于發(fā)現(xiàn)其中具有植物雌激素活性成分和抗癌物質(zhì)而倍受人們關(guān)注[2]。種子作為植物中含油較多的部位，對(duì)其藥理作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明涉及了具有腫瘤作用的阿魏種子提取物及其在制備具有抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，填補(bǔ)了阿魏在這一領(lǐng)域應(yīng)用的空白。

發(fā)明內(nèi)容
I.本發(fā)明阿魏種子提取物的制備方法(I)水蒸氣蒸餾法稱取阿魏種子g，粉碎，加入到蒸餾瓶中，加入水8-12倍量，安裝揮發(fā)油提取器，水蒸氣蒸餾3-5小時(shí)，從揮發(fā)油提取器重中將含水的揮發(fā)油分液漏斗中，分出回復(fù)一部分，放入-10 -15°C冰箱中冷凍過(guò)夜，取水除冰得到淺黃色揮發(fā)油，得率％。(2)稱取阿魏種子，粉碎，置于5L超臨界萃取釜中。開(kāi)啟萃取釜和分離釜加溫裝置，待達(dá)到設(shè)定溫度后打開(kāi)壓縮泵，使萃取釜壓力保持為20. OMPa，溫度為50°C，以40kg/h的C02流速循環(huán)萃取。分離釜壓力和溫度分別為10. OMPa和30°C，循環(huán)萃取3小時(shí)，得到黃色油狀物，有特殊香味，提取率為％。(3)取新疆阿魏種子50g用8倍量的石油醚(30_60°C )浸提三次，每次12小時(shí)，減壓濃縮得黃色揮發(fā)油.2.本發(fā)明的阿魏種子提取物的化學(xué)成分所得阿魏提取物經(jīng)GC-MS分析，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所得質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索確定了阿魏種子提取物中部分化學(xué)成分。氣相色譜條件石英毛細(xì)管柱Varian VF-5MSCP8944, 30mX O. 25mm，膜厚 O. 25 μ m。升溫程序從 60°C開(kāi)始，以 5°C /min 升到250°C，再以15°C /min升到280°C，載氣為He，柱流量I. OmL/min，進(jìn)樣口溫度270°C。質(zhì)譜條件=EI電源；電離電壓70eV ;離子源溫度230°C ;掃描范圍30 550aum ;進(jìn)樣量I μ 1，分流比22 I。分析鑒定結(jié)構(gòu)表明，阿魏種子提取物主要化學(xué)成分為等，總含量占全油的。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，新疆阿魏種子提取物具有廣譜抗腫瘤作用，對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞CAC02、人宮頸癌細(xì)胞HeLa及肝癌細(xì)胞均有一定的抑制生長(zhǎng)作用。。因此，新疆阿魏種子提取物可應(yīng)用于食品、藥品、保健品、化妝品 等行業(yè)，制備出具有抗腫瘤作用的各種形式的產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例I新疆阿魏種子提取物抗人宮頸癌細(xì)胞HeLa作用I. I細(xì)胞株人宮頸癌細(xì)胞HeLa由本研究所常規(guī)液氮保存。I. 2樣品為揮發(fā)油，I號(hào)新疆阿魏種子揮發(fā)油(水蒸氣蒸餾法提取)，2號(hào)阜康阿魏種子揮發(fā)油(水蒸氣蒸餾法提取)，3號(hào)羊食阿魏種子揮發(fā)油(水蒸氣蒸餾法提取)，4號(hào)新疆阿魏種子提取物(石油醚(30-60)提取)。I. 3體外抑瘤活性測(cè)定收集生長(zhǎng)良好的腫瘤細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成6X104/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，每孔ΙΟΟμ 1，37°C，5% CO2孵箱培養(yǎng)24h后，加入待測(cè)藥液(藥物終濃度I. 875,3. 75,7. 5、15、30 μ g/ml)，每濃度設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性藥物對(duì)照(順鉬10、1、0· lyg/ml)和空白對(duì)照。培養(yǎng)48h后棄上清，每孔加入MTT液10 μ I (5mg/ml)，RPMI-1640培養(yǎng)基配制)后繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入100 μ I酸化異丙醇細(xì)胞裂解液，過(guò)夜培養(yǎng)，用Bio-Tek MQX200型酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)540nm、參考波長(zhǎng)450nm下測(cè)吸光度(A)值，抑制率計(jì)算(A aθ5( Μ_Α#ρ°ρ ) /ASθ μ χ 100,采用 Graphpad Prism5 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算 IC5。。2.結(jié)果見(jiàn)表I。表I揮發(fā)油對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用
IC50 (μ g /ml)
順鉆_I_2_3_4_
5.15210.0020 0.00317.6116 13.4401實(shí)施實(shí)例2新疆阿魏種子提取物抗結(jié)腸腺癌細(xì)胞CAC02作用2. I細(xì)胞株結(jié)腸腺癌細(xì)胞CAC02，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)2. 2樣品為阿魏種子提取物，I號(hào)新疆阿魏種子揮發(fā)油(水蒸氣蒸餾法提取)，2號(hào)阜康阿魏種子揮發(fā)油(水蒸氣蒸餾法提取)，3號(hào)羊食阿魏種子揮發(fā)油(水蒸氣蒸餾法提取)，4號(hào)新疆阿魏種子提取物(石油醚(30-60)提取)。2. 3體外抑瘤活性測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAC02細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為8 X 104個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100uL，5% 0)。、95%濕度、37°C培養(yǎng)24h。取濃度為250ug/mL的初始濃度受試液適量，按I : 10的比例梯度稀釋，分別配制濃度為25、2. 5、0. 25、O. 025ug/mL的受試藥物。設(shè)立5個(gè)劑量組(按受試藥物濃度從高到低)，每組設(shè)3個(gè)平行孔，并設(shè)對(duì)照組和本底組。培養(yǎng)48h后，每孔中加入lmg/mL的MTT溶液50uL，繼續(xù)孵育4h。吸去各孔中上清液，加入DMSO 150uL，平板搖床振搖lOmin。570nm處測(cè)定各孔OD值。按下列公式計(jì)算不同濃度CAC02細(xì)胞增殖的抑制率，并以一 [IogrM](藥物濃度的負(fù)對(duì)數(shù))為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)，Origin v 8. O軟件計(jì)算IC5tl值。抑制率(％) = [I-(A實(shí)驗(yàn)組-A本底)/(A對(duì)照組-A本底)]X 100%。2. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 41采用常規(guī)水蒸氣蒸懼法提取新疆阿魏(Ferula sinkiangensis K. M. Shen)種子得到的揮發(fā)油對(duì)體外培養(yǎng)的CAC02腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表2，計(jì)算得IC5016. 82 ± I. 17ug/mL。表2新疆阿魏種子揮發(fā)油對(duì)體外培養(yǎng)的CAC02腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響
權(quán)利要求
1.阿魏種子提取物，其特征在于該提取物具有抗腫瘤作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的阿魏種子提取物，其特征在于該提取物是從新疆阿魏、阜康阿魏或羊食阿魏種子中提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求I和2所述的阿魏種子提取物，其特征在于可以是水蒸氣蒸餾，也可以是CO2超臨界萃取或脂溶性溶劑萃取獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的阿魏種子提取物的抗腫瘤作用，其特征在于抑制的腫瘤細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4所述的阿魏種子提取物，其特征在于該提取物可以在制備有抗腫瘤作用的保健品和藥品中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為阿魏種子提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及了阿魏的種子的脂溶性提取物及其在制備抗腫瘤作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用。采用水蒸氣蒸餾法、超臨界技術(shù)或脂溶性溶劑提取阿魏的種子，并通過(guò)氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。阿魏種子提取物對(duì)結(jié)腸癌、宮頸癌、肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)抑制作用。本發(fā)明的抗腫瘤藥劑可以是注射劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑或其它劑型。上述阿魏種子可以是新疆阿魏、阜康阿魏或羊食阿魏的種子，阿魏種子提取物制成的抗腫瘤制劑主要用于腫瘤患者的治療。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102885864SQ20111020415
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月21日
發(fā)明者李曉瑾, 斯建勇, 曹麗, 朱軍, 王月娥 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所