專利名稱：一種生地黃水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥新用途，特別是一種生地黃水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用， 可有效用于治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病，如婦女更年期綜合癥等。
背景技術(shù)：
生地黃為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鮮或干燥塊莖。 秋季采挖，除去蘆頭、須根及泥沙，將其緩緩烘焙至約八成干，即為生地黃。歷代名家對(duì)其均有論述和研究，認(rèn)為其性甘、寒，歸心、腎、肝經(jīng)，清熱涼血、養(yǎng)陰生津。主治熱病舌絳煩渴、陰虛內(nèi)熱、骨蒸勞熱、內(nèi)熱消渴、吐血、衄血、血崩、月經(jīng)不調(diào)、胎動(dòng)不安、陰傷便秘等。現(xiàn)代藥理及臨床研究表明生地黃能促進(jìn)凝血、升高外周白細(xì)胞；能強(qiáng)心、利尿、升高血壓；能保護(hù)肝臟，降低血糖；有增強(qiáng)免疫功能、抗輻射損傷和腎上腺皮質(zhì)激素樣作用。但尚未有生地黃關(guān)于雌激素樣活性方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，本發(fā)明的目的就是提供一種生地黃水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，有效解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病(如婦女更年期綜合癥等)的用藥問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，將生地黃每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到生地黃浸膏狀水提物，該生地黃水提物可有效用于制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病的藥物，實(shí)現(xiàn)生地黃水提物在制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病(如婦女更年期綜合癥等)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明水提物制備方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可靠，并經(jīng)多次試驗(yàn)，均取得了相同或相近似的結(jié)果，方便，成本低，其水提物有效用于制備雌性激素藥物，開辟了生地黃藥用新用途，臨床意義巨大。


圖1為本發(fā)明的生地黃水提物對(duì)ERE調(diào)控的報(bào)告基因載體ERa瞬時(shí)表達(dá)的誘導(dǎo)作用圖。圖2為本發(fā)明的生地黃水提物對(duì)ERE調(diào)控的報(bào)告基因載體ER3瞬時(shí)表達(dá)的誘導(dǎo)作用圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例和有關(guān)試驗(yàn)資料對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例1本發(fā)明在具體實(shí)施中，所述的生地黃水提物是，將生地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.) IOOg用其10倍重量的水IOOOg (即1000ml)煎煮2次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到生地黃浸膏狀水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為71. 90%，該水提物可制備雌激素藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。實(shí)施例2本發(fā)明在具體實(shí)施中，所述的生地黃水提物是，將生地黃(Rehmarmia glutinosa Libosch.) 200g用其10倍重量的水2000g(即2000ml)煎煮2次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到生地黃浸膏狀水提物143. 90g，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為71. 95%, 該水提物可制備雌激素藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。實(shí)施例3本發(fā)明在具體實(shí)施中，所述的生地黃水提物是，將生地黃(Rehmarmia glutinosa Libosch. )300g用其10倍重量的水3000g(即3000ml)煎煮2次，每次2h，合并兩次水煎液，減壓濃縮干燥得到生地黃浸膏狀水提物215. 20g，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為71. 73%, 該水提物可制備雌激素藥物，用于治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病，如婦女更年期綜合癥藥。根據(jù)上述方法按生地黃和水的比例可以通過工業(yè)化生產(chǎn)制得任意量的生地黃水提物，用于制備雌激素藥物，有效解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病(如婦女更年期綜合癥等)的用藥治療問題，并經(jīng)試驗(yàn)得到了充分證明，有關(guān)試驗(yàn)資料如下采用細(xì)胞增殖試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)及報(bào)告基因技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了充分證明，其有關(guān)試驗(yàn)資料如下首先通過MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(E-SCREEN)，發(fā)現(xiàn)生地黃能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖，說明其在體外具有雌激素樣作用。其次通過小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)，證明生地黃能夠顯著增加性未成熟雌性小鼠的子宮系數(shù)，說明其在體內(nèi)具有雌激素樣作用。最后通過ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證生地黃提取物是通過與雌激素受體ERi3的結(jié)合而發(fā)揮雌激素樣作用。發(fā)明人已通過實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明藥物在制備雌激素類藥物中的新用途。其主要實(shí)施方案如下一、實(shí)驗(yàn)材料與方法1.實(shí)驗(yàn)藥物玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鮮或干燥塊莖。秋季采挖，除去蘆頭、須根及泥沙，將其緩緩烘焙至約八成干，即為生地黃。生地黃IOOg以10倍量的水煎煮2次，每次2h，水煎液減壓干燥濃縮干燥得到生地黃水提物71.90g(浸膏狀)。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株及質(zhì)粒昆明種小鼠，雌性，出生21天(剛斷乳)，體重9 12g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供。HEK293細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)對(duì)照質(zhì)粒P β gal-Contro 1、重組報(bào)告基因pERE_TAL_luc由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所葉棋濃博士惠贈(zèng)。重組人ER α (humanER α，hER α )表達(dá)載體pCXN2_hER α和重組人 ERβ (humanERβ，hERβ )表達(dá)載體pCXN2-hERβ由東京大學(xué)醫(yī)學(xué)系Satoshi Inoue博士惠贈(zèng)。3.主要試劑RPMI1640 培養(yǎng)基、小牛血清(Newborn Calf Serum, NCS)和脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000Reagent 購(gòu)自 Gibco Invitrogen 公司；胎牛血清、無(wú)酚紅 RPMI1640 培養(yǎng)基、17 β-雌二醇(17 β-estrogen，Ε2)、氨芐青霉素(Amp)、Tris 堿和活性炭(Charcoal) 均購(gòu)自Sigma公司；葡聚糖T-70(Dextran-70)購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；己烯雌酚片(合肥久聯(lián)制藥)；鄰-硝基苯-β -D-半乳吡喃糖苷(O-Nitrophenyl- β -D-galactopy ranoside, 0NPG)、EDTA, MTT 及 DMSO 為 Amresco 公司產(chǎn)品；17-β 雌二醇(E2)為 Sigma 公司產(chǎn)品；Steady-GloR穩(wěn)定熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒(Steady-Glo^ Luciferase Assay Systerm)、閃亮裂解緩沖液(Glo lysis Buffer)購(gòu)自Promega公司；胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自 OXOID公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5 α (Ε. coli Competent Cells DH5 α )購(gòu)自 Solarbio 公司； 西班牙瓊脂糖為Biowest生產(chǎn)；質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit I)購(gòu)自O(shè)MEGA公司； 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。4.所用主要儀器普通手術(shù)器械；二氧化碳培養(yǎng)箱(REVCO)；倒置顯微鏡(NIKON ECLIPSE TS100)； KDC-160HR高速低溫冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；酶標(biāo)儀(BI0-RAD 680)；純水儀(Sartorius 611VF) ；90_3磁力攪拌器(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；ZRD-7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；微量加樣器(Nichipet EX PLUS)； AB204-N電子讀數(shù)分析天平(梅特勒_托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品)；IOcm培養(yǎng)皿、 96孔培養(yǎng)板、凍存管均為Corning公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán))；UV-7504PC型紫外-可見分光光度計(jì)(福州健洋科技儀器有限公司)；Veritas 微板光度計(jì)(Turner BioSystems公司)；SK6200H型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；電泳儀，電泳槽(北京市六一儀器廠)；HZS-H型水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)； SHP-150型生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。5.實(shí)驗(yàn)方法5. 1MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MCF-7細(xì)胞經(jīng)無(wú)酚紅含10%去激素血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗兩次，用0. 25 %胰蛋白酶消化后，加入無(wú)酚紅含2 %去激素血清的 RPMI1640培養(yǎng)基吹打均勻，以2X IO3個(gè)/孔的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為 200 μ L·培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，換為含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。37°C、5%C02培養(yǎng)72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150 μ 1DMS0， 震蕩5 lOmin，使結(jié)晶物完全溶解。以DMSO調(diào)零，用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)定各孔吸光度值 (A)，計(jì)算平均A值和增殖率(Proliferation Rate，RP)。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。Rp =(實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值F1XlOO^5. 2小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)將小鼠按體重均衡和隨機(jī)的原則分組。給藥持續(xù)7天?？瞻讓?duì)照組每日蒸餾水 0. 2ml · log—1灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組每日己烯雌酚懸濁液(0. 35mg · kg—1 · cf1)灌胃；生地黃按臨床用藥的20倍量X提取率計(jì)算，配成相應(yīng)濃度的混懸液，每日按0. 2ml/10g灌胃灌胃。 最后一次給藥24h后，脫頸處死小鼠，立即摘取子宮稱重，計(jì)算子宮系數(shù)(子宮濕重X (體重F1XlOO^ )。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果與空白組相比，計(jì)算P值考察有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5. 3ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)5. 3. 1質(zhì)粒DNA的制備5. 3. 1. 1 質(zhì)粒 DNA 的轉(zhuǎn)化(1)把感受態(tài)細(xì)胞置于冰水中融化；(2)取4個(gè)無(wú)菌1.5mlEP管，各加入50μ 1感受態(tài)大腸桿菌DH5a ；(3)分別力卩入 pCXN2_hERa、pCXN2-hERβ、ρ β gal-Control、pERE-TAL-luc 各 3μ ldOng/μ 1)，輕彈混勻；(4)冰浴 30min ；(5)42°〇放置608;(6)冰浴 3min ；(7)加入37°C預(yù)溫好的LB液體培養(yǎng)基950 μ 1，使其終體積為Iml ；(8) 37°C水浴振蕩培養(yǎng) Ih (150 170 次 /min)；(9)分別取適量涂布于含Amp LB固體培養(yǎng)基平皿中；(10) 37°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。(培養(yǎng)時(shí)間為10_14h，不可超過14h)5. 3. 1. 2轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增(1)取5ml無(wú)Amp的LB液體培養(yǎng)基，加入無(wú)菌試管中；(2)加入5 μ IAmp儲(chǔ)存液(50mg/ml)使之終濃度為50 μ g/ml ；(3)挑取3-5個(gè)轉(zhuǎn)化的單菌落，加入試管中；(4) 370C，150r/min 振搖過夜(10_12h)。5. 3. 1. 3 質(zhì)粒 DNA 的提取(1)平衡柱子取一只新的制備柱裝在收集管中，吸取200 μ 1的Buffer GPS至柱子中。室溫放置5min后，12000g/min離心2min，棄去收集管中濾液，將制備柱重新裝在收集管中待用。(平衡過的柱子需在當(dāng)天使用)(2)按照試劑盒要求提前配好solution I/Rnase A的混合液，4°C保存；加規(guī)定體積的無(wú)水乙醇到DNA wash Buffer中，室溫保存。(3)將上述菌液室溫下8000轉(zhuǎn)/分，離心5min，棄上清，收集菌體；(2)每只EP管加入250 μ 1 solution I/Rnase Α,渦旋混勻至菌體完全懸??；(3)加入250 μ 1 solution II，輕輕顛倒旋轉(zhuǎn)混勻4-6次，不要?jiǎng)×一靹?，將溶菌液置于室溫下孵?-3min ；(4)加入350 μ 1 solutionlll，輕搖混勻數(shù)次，直到絮狀白色沉淀產(chǎn)生；(5)室溫 14000g/min 離心 lOmin，得上清液；(6)小心吸取上清至2ml平衡好的制備柱中，12000g/min離心2min ；(7)棄濾液，加入 500 μ 1 Buffer HB, 12000g/min 離心 2min ；(8)棄濾液，加入 750 μ 1 DNAwash Buffer, 12000g/min 離心 2min ；(9)重復(fù)(8)的操作；(10)制備柱16000g/min離心3min，除去乙醇，空氣中晾干。
(11)分別加入 50 μ IElution Buffer 洗脫制備柱，室溫放置 2min，16000g/min 離心3min，濾液-20°C存放。5.3.1.4提取質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(1)0. 5XTBE加入0. 5%的瓊脂糖，微波加熱使瓊脂糖完全溶解；(2)溶液冷卻至約60°C時(shí)，將液體倒入膜具，插入梳子；(3)室溫放置30min后，等完全凝固，小心取出梳子，將凝膠置于電泳槽中，加入 0. 5 X TBE倒入電泳槽，液面高出膠面2mm ；(4)上樣緩沖液1 μ 1與1 μ 1質(zhì)粒DNA混合后上樣，進(jìn)行電泳。5. 3. 2細(xì)胞接種于轉(zhuǎn)染前48h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ΗΕΚ293細(xì)胞接種于24孔板，密度為16. OX IO4 個(gè)/0. 5ml/孔，且培養(yǎng)液為無(wú)抗生素、含10%⑶T-FBS的無(wú)酚紅1640培養(yǎng)液，分別設(shè)置空白對(duì)照孔、雌二醇孔及待測(cè)藥物孔。5. 3. 3轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的稀釋?duì)?β gal-Control 質(zhì)粒用 TE 稀釋為 0. 1 μ g/ μ 1 ；pCXN2-hER α 或 pCXN2_hER β 質(zhì)粒用 TE 稀釋為 40ng/ μ 1 ；pERE-TAL-luc 質(zhì)粒用 TE 稀釋為 0· 2 μ g/ μ 1.5· 3.4質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染(1)轉(zhuǎn)染前24h，將ΗΕΚ293細(xì)胞用含10 %無(wú)E2的FBS、無(wú)慶大霉素和酚紅的 RPMI1640培養(yǎng)基于接種于24孔板，細(xì)胞密度16 X IO4個(gè)/0. 5ml/孔。(2)36_48h后開始轉(zhuǎn)染，小心吸出原培養(yǎng)基，加入400μ 1含10%去雌激素血清、無(wú)慶大霉素和酚紅的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基。(3)取 3 只 EP 管，ER α 管中加 500 μ 1 無(wú)酚紅 RPMI1640 培養(yǎng)基、8 μ lpCXN2_hERa 質(zhì)粒、8 μ IpERE-TAL-luc 質(zhì)粒、8 μ Ip β gal-Control 質(zhì)粒；ER β 管中加 500 μ 1 無(wú)酚紅 RPMI1640 培養(yǎng)基、8 μ lpCXN2-hER β 質(zhì)粒、8 μ lpERE-TAL-Iuc 質(zhì)粒、8 μ 1 β gal-Control 質(zhì)粒；脂質(zhì)體管中加入1000 μ 1無(wú)酚紅RPMI1640培養(yǎng)基和24 μ 1脂質(zhì)體。(4)倒轉(zhuǎn)混勻脂質(zhì)體管，室溫放置5min，取500 μ 1分別加入ER α和ER β管，室溫放置20min ；(5)倒轉(zhuǎn)混勻ER α和ER β管，取80 μ IER α管中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分別加入24 孔板ER α實(shí)驗(yàn)孔，取80 μ IER β管中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分別加入24孔板ER β實(shí)驗(yàn)孔。前后搖勻，放入培養(yǎng)箱。(6) 6h后加入對(duì)照藥物和檢測(cè)藥物。5. 3. 5ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)加藥后24h的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，用ImlPBS洗一次，并移去PBS。按照Steady-GloR 穩(wěn)定熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒(Steady-GloR Luciferase Assay Systerm)及閃亮裂解緩沖液(Glo lysis Buffer)改良操作步驟操作，收集細(xì)胞裂解上清液，加入熒光素酶反應(yīng)底物(熒光素)，置于暗處，用VeritasTM微板光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。5. 3. 6 β -gal 活性檢測(cè)為了考察轉(zhuǎn)染效率，對(duì)內(nèi)參照β -gal活性進(jìn)行了檢測(cè)。(1)54μ 1β-巰基乙醇加入40ml Z-buffer中，混勻，取EP管，每管加1800 μ 1 ；
(2)每管加20 μ 1裂解上清液；(3)每管加400 μ 1 0NPG，倒轉(zhuǎn)混勻；(4)放置37°C溫箱，至顯黃色；(5) Na2CO3ImL 終止反應(yīng)；(6)測(cè) 0D420 值；(7)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性。二、統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，SPSS13. 0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way AN0VA)統(tǒng)計(jì)處理。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.生地黃水提物對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示，生地黃水提物在0. 001 0. Img -πιΓ1時(shí)對(duì)MCF-7細(xì)胞與空白組比均有極顯著的促增殖作用(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見表1。說明在體外實(shí)驗(yàn)中，生地黃水提物在低濃度時(shí)即有促M(fèi)CF-7細(xì)胞的增殖作用。表1生地黃對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響(η = 9)
權(quán)利要求
1. 一種生地黃水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的生地黃水提物是，將生地黃每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到生地黃浸膏狀水提物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生地黃水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，有效解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病的用藥問題，其解決的技術(shù)方案是，將生地黃每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，減壓濃縮干燥得到生地黃浸膏狀水提物，該生地黃水提物可有效用于制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病的藥物，實(shí)現(xiàn)生地黃水提物在制備治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明水提物制備方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可靠，并經(jīng)多次試驗(yàn)，均取得了相同或相近似的結(jié)果，方便，成本低，其水提物有效用于制備雌性激素藥物，開辟了生地黃藥用新用途，臨床意義巨大。
文檔編號(hào)A61P5/30GK102247471SQ20111021118
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月8日
發(fā)明者馮衛(wèi)生, 劉朝妍, 李冬梅, 蔣赟, 鄭曉珂 申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院