專利名稱：一種生物蛋白海綿及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)學臨床手術后和肌體創(chuàng)傷用生物蛋白海綿及其制造方法；特別涉及一種用于人體和動物體新鮮創(chuàng)面的止血，促進細胞生長增殖能力，以及血管和器官組織修復的生物蛋白海綿及其制備方法。
背景技術：
在醫(yī)學領域中，創(chuàng)傷修復和臨床手術后肌體的生長和再生是一個相關聯的病理生理過程，眾所周知臨床手術后及其他創(chuàng)傷修復中，它包括肌體一系列生化、生理和形態(tài)的變化。通常情況從凝血開始到炎癥反應、細胞浸潤、新血管生成以及細胞外基質產生等不同階段，各不同階段都是相互依存的一種有序變化過程，這些不同的修復過程是一個唇齒相依、 密不可分的整體。由于人體組織內的細胞都浸潤在細胞間質液中，細胞間質就像一個儲藏室，是細胞賴以生存的前提。細胞間質是由細胞產生的不具有細胞形態(tài)和結構的物質，它包括纖維、基質和流體物質(組織液、淋巴液、血漿等)，細胞間質對細胞起著支持、保護、連結和營養(yǎng)作用，參與構成細胞生存的微環(huán)境(microenvironment)。細胞間質是肌體細胞所生活的液態(tài)環(huán)境，其細胞間質液中含有細胞在新陳代謝時所需要的全部生存條件；同樣的， 細胞間質液也會接受細胞的代謝產物，或未被利用的物質。因此肌體受傷時，常常出現肌體皮膚和器官缺損創(chuàng)面，特別是不可避免破壞了細胞間質，在其細胞不可能恢復的情況下， 在肌體上顯現出轉移皮瓣和移植皮片壞死、潰爛、感染等等狀況的發(fā)生，一般臨床上為了降低這種現象的發(fā)生的幾率，通常采用注射抗生素或外部采用外敷中藥、西藥等抗感染處理方法，但創(chuàng)傷面肌體組織細胞的存活率極低，造成修復周期長，產生皮膚疤痕，肌肉缺損、組織細胞壞死等問題，并相繼造成傷口的愈合周期長、肌體內營養(yǎng)成分消耗大、恢復慢等不良情況發(fā)生，甚至發(fā)生再手術率高等特點。為了縮短傷口愈合時間及減少再手術率這一技術難題，長時間以來，國內外醫(yī)學界在該領域進行了不斷地探索和研究，自八十年代以來有關利用生長因子對肌體創(chuàng)傷和醫(yī)療手術后肌體組織修復作用進行了大量地研究和臨床應用， 使人們對現代創(chuàng)傷修復的理念發(fā)生了根本的改變。拋開了傳統(tǒng)的單一的解決傷口的某一方面的問題，一是肌體組織修復的內涵已從單純的體表愈合發(fā)展到細胞組織的修復過程； 二是通過人工干預創(chuàng)面的自然愈合過程可以通過生長因子得到某種程度的“促進”或“恢復”組織細胞成活的效果。生長因子生物活性極不穩(wěn)定，對生理環(huán)境敏感，易被蛋白酶降解，在體內半衰期極短；經長期研究中發(fā)現生長因子與膠原蛋白相互依存的生物理論。人體組織內的細胞都浸潤在細胞間質液中，細胞和液體之間不斷地進行著物質交換，吸取氧分和養(yǎng)料，排出二氧化碳等廢物，為了不使創(chuàng)傷面細胞本身被產生的廢物所破壞，充分讓細胞間質液不斷地更新。我們研發(fā)了利用新鮮哺乳動物結締組織或皮的細胞間質較多這一優(yōu)勢，因為動物的結締組織(connective tissue)或皮是由細胞和大量細胞間質構成的，細胞間質包括基質、細絲狀的纖維和不斷循環(huán)更新的組織液；另外由于制作生物蛋白海綿的原料是以新鮮動物的結締組織或皮為原料制備的，在臨床應用過程中勢必存在人畜共患病原微生物交叉感染的可能，為避免這類潛在危險的發(fā)生，除加強對原料的篩選和控制外，在制備過程中進行二次病毒滅活的過程，即采用向溶液中加入有機溶劑/去污劑(Solvent/ Detergent)的辦法滅活脂包膜病毒，即S/D滅活病毒。通過病毒滅活驗證，以偽狂犬病毒 (Pseudorabies virus PRV)，7jC泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus VSV)作為指示病毒，證明S/D滅活病毒的可行性，同時添加蔗糖溶液、甘氨酸為保護劑，具有不使生物蛋白變性和不影響膠原蛋白的回收率等特點；并采用CM陽離子色譜純化工序，純化掉多余的聚山梨酯80、磷酸三丁酯，即聚山梨酯80殘留量小于lOOug/ml，磷酸三丁酯殘留量小于 lOug/ml，殘留量符合《中國藥典》2010版第三部規(guī)定的要求；同時采用加熱滅活病毒工藝代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鈷60輻射滅菌方法，實現臨床應用上安全可靠，這是本行業(yè)制備工藝方法的一種新突破，也為未來行業(yè)的發(fā)展方向奠定了基礎；試驗中我們還發(fā)現傳統(tǒng)的透析工序制備周期長，一般在48小時以上，為了更好地保護生物蛋白活性，縮短制備周期，用超濾工藝替代了透析工序，不僅降低了生產成本，縮短制備周期40小時以上，而且極大地提高了生物蛋白的活性；上述本發(fā)明的技術方案的形成，這對于利用生化理論應用到臨床醫(yī)療具有重要的功能性意義。綜上所述，在各種理論性的結論日臻成熟的今天，相繼出現了多種應用生物敷料， 替代傳統(tǒng)的對肌體創(chuàng)傷和皮膚修復的治療方法。雖然各種生物提取物與生長因子結合物用途相近，但由于制作工藝和制備方法的千差萬別，并且生長因子的存活時間不同，所突破的醫(yī)療領域和效果大相徑庭，具體區(qū)別在于使用功能和臨床應用效果上。促進傷口愈合和組織再生、使創(chuàng)傷面得以完好修復，一直以來是醫(yī)學界廣泛重視的研究課題。在這種情況之下，我們另辟蹊徑經過科學的論證和嚴謹的科學方法加工提取出與人體和動物體相似的細胞間質，并添加一定比例的生長因子，制作成無菌性生物蛋白海綿。其與創(chuàng)傷面接觸時，生長因子可緩釋傷口處，而且生物活性得以最大限度的延長，并能充分補充損失的細胞間質、 激活細胞，通過對細胞的黏附作用，可提高細胞的成活率，并誘導細胞分化及細胞上受體的表達，并參與構成細胞生存的微環(huán)境。特別對于特殊體質的人群，如疤痕體質、具有嚴重疾病綜合癥和內臟手術后的修復等等；尤其現在醫(yī)學整容領域的發(fā)展，對其手術后的皮膚組織修復的完好率要求極高的情況下，其要求皮膚組織恢復和再生能力的程度越來越高。因此，對醫(yī)療手術后皮膚組織修復能力的輔助醫(yī)療措施的完備，是高科技快速發(fā)展和人們對生活水平質量要求越來越高的今天，所亟待解決的問題。根據中國發(fā)明專利公開說明書CN1M8339A《促進脊髓組織損傷愈合的海綿材料其制備方法及應用》中披露的成纖維細胞生長因子(FGF)分為酸性和堿性兩種，兩者的相關性為50%，其活性相差很大，堿性比酸性的活性高100倍以上；兩者的組織分布也不盡相同； 另外，堿性成纖維細胞生長因子是一種趨化因子；但堿性成纖維細胞生長因子必須依賴于局部投藥載體，否則很難發(fā)揮其有效作用。又根據中國發(fā)明專利公開說明書CN1511592A《一種含有表皮生長因子的皮膚組織工程支架的構建方法》中披露一種無抗原性、強度高、柔韌性和耐酶性好、對肌體無毒害、含有表皮生長因子(EGF)的皮膚組織工程支架的構建方法。并根據臨床使用表明表皮生長因子具有誘導細胞分裂，加速創(chuàng)傷面修復的特性。公開了通過引入肝素，促使表皮生長因子與膠原形成緩解系統(tǒng)，逐漸釋放出表皮生長因子，在創(chuàng)傷愈合前保持表皮生長因子持續(xù)作用于創(chuàng)面組織細胞。從上述公開的現有技術中可以明顯看出，現在普遍使用制備方法生產的產品，只能單一的運用其中某一性能的特點，雖然也體現生長因子的部分特點，但對最大限度的應用生長因子的生物活性，及在緩釋生長因子、激活組織細胞的修復能力上及臨床應用過程中的安全性等，都沒有實質上的突破和應用；因此在臨床應用過程中，存在使用上單一、綜合應用受限制等問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明就是針對上述問題，提供一種根據人體和動物體內細胞和細胞生長環(huán)境相適應的特點，利用細胞間質作為生長因子、凝血因子的緩釋載體，并通過冷凍干燥技術，使其形成凍干海綿狀，以緩釋的給藥方式作用于肌體創(chuàng)面，創(chuàng)造細胞生長分裂的微環(huán)境，細胞在其表面及孔隙間均可以良好生長；通過與組織接觸對其新鮮傷口有止血、創(chuàng)造細胞生長分裂的微環(huán)境、加速組織修復，使細胞間質與生長因子發(fā)生協(xié)同生物功效，產生修復神經纖維、促進新毛細血管生成的作用，從而達到促進組織創(chuàng)傷的主動修復和功能恢復，縮短創(chuàng)傷面愈合時間、減少或減輕瘢痕形成和色素沉著等，補充細胞間質、激活細胞組織的修復能力，提高臨床手術后傷口愈合質量的生物蛋白海綿。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種生物蛋白海綿的制備方法，該方法改變了傳統(tǒng)的制備過程，采用S/D病毒滅活并添加保護劑，避免人畜共患病毒交叉感染幾率；CM陽離子色譜純化過程，提高生物蛋白純度，促進生物蛋白海綿止血及組織愈合效果，降低臨床副反應；采用超濾工序替代透析工序，縮短了制備周期，保護生物蛋白活性，降低了生產成本； 用加熱滅活病毒代替鈷60輻射滅菌方法，避免了放射線對產品帶來的危害，同時保護了生物蛋白的活性，實現產品在臨床應用上安全可靠的一種生物蛋白海綿的制備方法。為了實現上述本發(fā)明的目的，本發(fā)明一種生物蛋白海綿，它包括細胞間質、生長因子、凝血因子，其特點在于以細胞間質為基質，均勻的添加一定比例的生長因子、凝血因子， 通過冷凍干燥技術制備成海綿狀。所述細胞間質由膠原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖組成。所述膠原蛋白由I型和III型膠原蛋白為主的19種其他型膠原蛋白組成。所述生長因子分為堿性成纖維細胞生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經生長因子、結締組織生長因子、肽類生長因子、轉化生長因子、血小板源生長因子。所述凝血因子分為凝血酶因子、纖維蛋白原因子、XIII因子。所述生物蛋白海綿每平方厘米生長因子、凝血因子的含量為30 300IU。本發(fā)明生物蛋白海綿制備方法，采用如下工藝流程以新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料脫脂工序——粉碎工序——酶解工序——S/D病毒滅活工序——一次鹽析沉淀工序——離心分離工序——二次鹽析工序—— CM陽離子交換色譜純化工序——超濾工序——配制工序一過濾除菌工序一分裝工序—— 凍干工序——切割工序——內包裝工序——二次滅活病毒工序——檢驗工序——成品包裝工序——入庫；包括以下步驟步驟1、選取原料和脫脂處理取新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料，進行脫脂處理；其工藝如下將新鮮哺乳動物的結締組織或皮放入不銹鋼桶中，按原料與10 35%
6碳酸鈉溶液1 1 10的比例，浸泡5 60min，定時攪拌；浸泡后撈出，先用水反復沖洗數次，再用純化水反復沖洗5 10次；浙凈水分，用不銹鋼刀具刮凈原料上的油脂或毛囊等雜質；步驟2、粉碎工序先用切絲機將原料切成條狀，然后倒入絞肉機中粉碎，倒入不銹鋼桶中，加入75%乙醇溶液浸泡5 60min撈出，用純化水反復沖洗5 10次，再用注射用水反復沖洗2 5次，浙干；步驟3、酶解工序按Ikg 5-30kg的比例加入注射用水混勻，倒入膠體磨中勻漿；勻漿液轉入酶解罐中，緩慢滴加鹽酸溶液，調一定PH值；按Ikg原料加入1 IOg胃蛋白酶，酶解溫度控制在10°C 35°C之間，攪拌勻漿液PH值為2. 0 4. 0時終止，此時酶解液成粘稠、均勻的膠狀流體；步驟4、S/D病毒滅活工序S卩脂胞膜病毒滅活，酶解液與注射用水按1 1 10 的比例進行稀釋、混勻，用孔徑為40 μ m的濾芯進行粗濾，再用孔徑為1. 0 μ m濾芯進行精濾至病毒滅活罐中，加入保護劑，達到終濃度為0. 5 1. 5%，在連續(xù)攪拌的狀態(tài)下，緩慢加入 S/D病毒滅活液，即聚山梨酯80的濃度為1 %，磷酸三丁酯的濃度為0. 3%，攪拌均勻，采用
病毒滅活6h即可；步驟5、鹽析離心工序溶液加入1 20倍(W/W)注射用水，混勻，按1 1 5的比例加入飽和氯化鈉溶液，攪勻，用連續(xù)流離心機10000 17000rpm離心分離沉淀；取沉淀物加入1 20倍(W/W)注射用水，攪勻，使沉淀溶解完全，進行二次鹽析，再進行離心分離， 收集沉淀物；其沉淀物與10 25倍注射水溶解，轉入CM陽離子色譜純化工序；步驟6、CM陽離子交換色譜純化工序將裝有CM陽離子交換樹脂的色譜柱 (10 X 100CM,華美公司)進行平衡，上樣速度為3. 0 6. Oml/min,然后用pH = 4. O、濃度為 0. 3 0. 6mol/L的氯化鈉溶液進行洗脫，收集細胞間質洗脫液。步驟7、超濾工序將收集的細胞間質洗脫液用優(yōu)選孔徑為IOkD還可使用20kD、 30kD的超濾器超濾(Millipore)，進行濃縮脫鹽處理，收集截留液。步驟8、配制工序以截留液的生物蛋白含量與生長因子、凝血因子以一定比例進行配制，PH值為4. 5 7. 5;步驟9、過濾除菌工序將配制好的溶液依次用孔徑為0. 45 μ m和0. 22 μ m濾芯 (PALL)過濾，分裝；步驟10、凍干工序通過低溫冷凍干燥將加有生長因子、凝血因子溶液中的水分去除，采用_20°C -45°C進行冷凍1 釙，抽真空干燥，20°C 40°C恒溫1 釙；步驟11、二次滅活病毒工序將凍干后的產品進行加熱滅活病毒，溫度為60 100°C、時間為 0. 5 144h ；以下工序都在潔凈區(qū)中進行分裝工序、切割工序、內包裝工序、檢驗工序、成品包裝工序、入庫。所述S/D病毒滅活工序加入蔗糖溶液、甘氨酸作為保護劑。所述二次滅活病毒工序優(yōu)選溫度為60°C、80°C、10(TC ；優(yōu)選時間為144h、72h、 0. 5h0與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明的生物蛋白海綿，是一種無菌干性生物蛋白海綿，具有強大的吸收傷口創(chuàng)面滲液能力，具有對創(chuàng)面充分引流的性能，且體積小重量輕，吸收液體后不膨脹等特點， 不會給創(chuàng)面增加負擔；2、本發(fā)明生物蛋白海綿的成分與人體或動物體的細胞間質相似，生長因子、凝血因子均勻地分布在細胞間質中，以其為基質或載體，可以在一定病理條件下，緩慢釋放出來，生長因子、凝血因子的生物活性得以延長；3、本發(fā)明具有促使細胞生長增殖能力，以及血管和器官組織修復功能，同時提供給創(chuàng)面營養(yǎng)成分；4、本發(fā)明主要成分有I型和III型膠原為主的19種其他型膠原、糖蛋白、蛋白多糖，而膠原是細胞間質的主要成分，且它結合其他間質蛋白起到了物理支架的作用，并對細胞起到黏附作用，可提高細胞的成活率，不斷補充病理條件下創(chuàng)面的細胞間質和營養(yǎng)，避免創(chuàng)面的養(yǎng)分流失，保護新生組織細胞和主動修復創(chuàng)面細胞的功能；5、本發(fā)明用超濾工序替代透析工序，縮短制備生產周期40h以上，降低生產成本， 而且采用透析工序使生物蛋白的活性降低了，為了更好地保護生物蛋白活性，縮短制備周期，用超濾工序替代了透析工序，避免由于透析工序時間長而引起的生物蛋白變性問題，極大地提高了生物蛋白的存活率；6、本發(fā)明采用在二次鹽析后CM陽離子色譜純化工序，使生物蛋白純度由80 85%提高到95 98%，促進了生物蛋白海綿在臨床應用上的止血及肌體組織愈合效果，并降低了臨床的的副作用；7、本發(fā)明生物蛋白海綿的原料來源為動物的皮或結締組織，存在人畜共患病毒交叉感染的可能性，在工藝中增加了二步滅活病毒過程。第一步采用加入S/D病毒滅活的方法，并在病毒滅活過程中加入以糖(蔗糖)和氨基酸(甘氨酸、組氨酸)為主的保護劑，克服傳統(tǒng)的不進行S/D病毒滅活或病毒滅活中不加保護劑的不足，避免了交叉感染病毒的發(fā)生并保護了細胞間質的活性；第二步采用加熱滅活病毒代替鈷60輻射方法，避免了放射線對產品帶來的危害，同時保護了生物蛋白的活性；實現產品在臨床應用上安全可靠性；8、本發(fā)明所加入的滅活劑在后續(xù)鹽析、色譜純化等蛋白純化過程中被去除，聚山梨酯80的殘留量小于lOOug/L，磷酸三丁酯的殘留量小于lOug/L，殘留量符合《中國藥典》 2010版第三部規(guī)定的要求，保證了生物蛋白海綿的臨床使用要求。
具體實施例方式本發(fā)明一種生物蛋白海綿，它包括細胞間質、生長因子、凝血因子，其特點在于以細胞間質為基質，均勻的添加一定比例的生長因子、凝血因子，通過冷凍干燥技術制備成海綿狀。所述細胞間質由膠原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖組成。所述膠原蛋白由I型和III型膠原蛋白為主的19種其他型膠原蛋白組成。所述生長因子分為堿性成纖維細胞生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經生長因子、結締組織生長因子、肽類生長因子、轉化生長因子、血小板源生長因子。所述凝血因子分為凝血酶因子、纖維蛋白原因子、XIII因子。所述生物蛋白海綿每平方厘米生長因子、凝血因子的含量為30 300IU。
本發(fā)明生物蛋白海綿制備方法，采用如下工藝流程以新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料脫脂工序——粉碎工序——酶解工序——S/D病毒滅活工序——一次鹽析沉淀工序——離心分離工序——二次鹽析工序—— CM陽離子交換色譜純化工序——超濾工序——配制工序一過濾除菌工序一分裝工序—— 凍干工序——切割工序——內包裝工序——二次滅活病毒工序——檢驗工序——成品包裝工序——入庫包括以下步驟步驟1、選取原料和脫脂處理取新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料，進行脫脂處理；其工藝如下將新鮮哺乳動物的結締組織或皮放入不銹鋼桶中，按原料與10 35% 碳酸鈉溶液1 1 10的比例，浸泡5 60min，定時攪拌；浸泡后撈出，先用水反復沖洗數次，再用純化水反復沖洗5 10次；浙凈水分，用不銹鋼刀具刮凈原料上的油脂或毛囊等雜質；步驟2、粉碎工序先用切絲機將原料切成條狀，然后倒入絞肉機中粉碎，倒入不銹鋼桶中，加入75%乙醇溶液浸泡5 60min撈出，用純化水反復沖洗5 10次，再用注射用水反復沖洗2 5次，浙干；步驟3、酶解工序按Ikg 5-30kg的比例加入注射用水混勻，倒入膠體磨中勻漿；勻漿液轉入酶解罐中，緩慢滴加鹽酸溶液，調一定PH值；按Ikg原料加入1 IOg胃蛋白酶，酶解溫度控制在10°C 35°C之間，攪拌勻漿液PH值為2. 0 4. 0時終止，此時酶解液成粘稠、均勻的膠狀流體；步驟4、S/D病毒滅活工序S卩脂胞膜病毒滅活，酶解液與注射用水按1 1 10 的比例進行稀釋、混勻，用孔徑為40 μ m的濾芯進行粗濾，再用孔徑為1. 0 μ m濾芯進行精濾至病毒滅活罐中，加入保護劑，達到終濃度為0. 5 1. 5%，在連續(xù)攪拌的狀態(tài)下，緩慢加入 S/D病毒滅活液，即聚山梨酯80的濃度為1 %，磷酸三丁酯的濃度為0. 3%，攪拌均勻，采用
病毒滅活6h即可；步驟5、鹽析離心工序溶液加入1 20倍(W/W)注射用水，混勻，按1 1 5的比例加入飽和氯化鈉溶液，攪勻，用連續(xù)流離心機10000 17000rpm離心分離沉淀；取沉淀物加入1 20倍(W/W)注射用水，攪勻，使沉淀溶解完全，進行二次鹽析，再進行離心分離， 收集沉淀物；其沉淀物與10 25倍注射水溶解，轉入CM陽離子色譜純化工序；步驟6、CM陽離子交換色譜純化工序將裝有CM陽離子交換樹脂的色譜柱 (10 X 100CM,華美公司)進行平衡，上樣速度為3. 0 6. Oml/min,然后用pH = 4. O、濃度為 0. 3 0. 6mol/L的氯化鈉溶液進行洗脫，收集細胞間質洗脫液；步驟7、超濾工序將收集的細胞間質洗脫液用優(yōu)選孔徑為IOkD還可使用20kD、 30kD的超濾器超濾(Millipore)，進行濃縮脫鹽處理，收集截留液。步驟8、配制工序以截留液的生物蛋白含量與生長因子、凝血因子以一定比例進行配制，PH值為4. 5 7. 5;步驟9、過濾除菌工序將配制好的溶液依次用孔徑為0. 45 μ m和0. 22 μ m濾芯 (PALL)過濾，分裝；步驟10、凍干工序通過低溫冷凍干燥將加有生長因子、凝血因子溶液中的水分去除，采用_20°C -45°C進行冷凍1 釙，抽真空干燥，20°C 40°C恒溫1 釙；
步驟11、二次滅活病毒工序將凍干后的產品進行加熱滅活病毒，溫度為60 100°C、時間為 0. 5 144h ；以下工序都在潔凈區(qū)中進行分裝工序、切割工序、內包裝工序、檢驗工序、成品包裝工序、入庫。所述S/D病毒滅活工序加入蔗糖溶液、甘氨酸作為保護劑。所述二次滅活病毒工序優(yōu)選溫度為60°C、80°C、10(TC ；優(yōu)選時間為144h、72h、 0. 5h0下面通過實施例進一步詳細描述本發(fā)明的制備過程，但不以任何方式限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1步驟1、選取原料和脫脂處理取新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料，進行脫脂處理；其工藝如下將新鮮哺乳動物的結締組織或皮放入不銹鋼桶中，按原料與10%碳酸鈉溶液1 1的比例，浸泡5min，定時攪拌；浸泡后撈出，先用水反復沖洗數次，再用純化水反復沖洗5次；浙凈水分，用不銹鋼刀具刮凈原料上的油脂或毛囊等雜質；步驟2、粉碎工序先用切絲機將原料切成條狀，然后倒入絞肉機中粉碎，倒入不銹鋼桶中，加入75%乙醇溶液浸泡5min撈出，用純化水反復沖洗5次，再用注射用水反復沖洗2次，浙干；步驟3、酶解工序按Ikg 5kg的比例加入注射用水混勻，倒入膠體磨中勻漿；勻漿液轉入酶解罐中，緩慢滴加鹽酸溶液，調一定PH值；按Ikg原料加入Ig胃蛋白酶，酶解溫度控制在10°C之間，攪拌勻漿液PH值為2. 0時終止，此時酶解液成粘稠、均勻的膠狀流體；步驟4、S/D病毒滅活工序S卩脂胞膜病毒滅活，酶解液與注射用水按1 1的比例進行稀釋、混勻，用孔徑為40 μ m的濾芯進行粗濾，再用孔徑為1. 0 μ m濾芯進行精濾至病毒滅活罐中，加入蔗糖溶液、甘氨酸作為保護劑，達到終濃度為0.5%，在連續(xù)攪拌的狀態(tài)下， 緩慢加入S/D病毒滅活液，即聚山梨酯80的濃度為1%，磷酸三丁酯的濃度為0. 3%，攪拌均勻，采用M士 1 °C病毒滅活乩即可；步驟5、鹽析離心工序溶液加入1倍(W/W)注射用水，混勻，按1 1的比例加入飽和氯化鈉溶液，攪勻，用連續(xù)流離心機IOOOOrpm離心分離沉淀；取沉淀物加入1倍(W/W) 注射用水，攪勻，使沉淀溶解完全，進行二次鹽析，再進行離心分離，收集沉淀物；其沉淀物與10倍注射水溶解，轉入CM陽離子色譜純化工序；步驟6、CM陽離子交換色譜純化工序將裝有CM陽離子交換樹脂的色譜柱 (10X100CM,華美公司)進行平衡，上樣速度為3. Oml/min,然后用PH = 4. O、濃度為 0. 3mol/L的氯化鈉溶液進行洗脫，收集細胞間質洗脫液；步驟7、超濾工序將收集的細胞間質洗脫液用孔徑為IOkD的超濾器超濾 (Millipore)，進行濃縮脫鹽處理，收集截留液；步驟8、配制工序以截留液的生物蛋白含量與生長因子、凝血因子以一定比例進行配制，PH值為4.5;步驟9、過濾除菌工序將配制好的溶液依次用孔徑為為0. 45 μ m和0. 22 μ m濾芯 (PALL)過濾，分裝；步驟10、凍干工序通過低溫冷凍干燥將加有生長因子、凝血因子溶液中的水分
10去除，采用_20°C進行冷凍證，抽真空干燥，20°C恒溫證；步驟11、二次滅活病毒工序將凍干后的產品進行內包裝，然后加熱滅活病毒，溫度為100°C、時間為0. 5h ；以下工序都在潔凈區(qū)中進行分裝工序、切割工序、內包裝工序、檢驗工序、成品包裝工序、入庫。實施例2步驟1、選取原料和脫脂處理取新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料，進行脫脂處理；其工藝如下將新鮮哺乳動物的結締組織或皮放入不銹鋼桶中，按原料與35%碳酸鈉溶液1 10的比例，浸泡60min，定時攪拌；浸泡后撈出，先用水反復沖洗數次，再用純化水反復沖洗10次；浙凈水分，用不銹鋼刀具刮凈原料上的油脂或毛囊等雜質；步驟2、粉碎工序先用切絲機將原料切成條狀，然后倒入絞肉機中粉碎，倒入不銹鋼桶中，加入75%乙醇溶液浸泡60min撈出，用純化水反復沖洗10次，再用注射用水反復沖洗5次，浙干；步驟3、酶解工序按Ikg 30kg的比例加入注射用水混勻，倒入膠體磨中勻漿； 勻漿液轉入酶解罐中，緩慢滴加鹽酸溶液，調一定PH值；按Ikg原料加入IOg胃蛋白酶，酶解溫度控制在35°C之間，攪拌勻漿液PH值為4. 0時終止，此時酶解液成粘稠、均勻的膠狀流體；步驟4、S/D病毒滅活工序S卩脂胞膜病毒滅活，酶解液與注射用水按1 10的比例進行稀釋、混勻，用孔徑為40 μ m的濾芯進行粗濾，再用孔徑為1. 0 μ m濾芯進行精濾至病毒滅活罐中，加入蔗糖溶液、甘氨酸作為保護劑，達到終濃度為1. 5%，在連續(xù)攪拌的狀態(tài)下，緩慢加入S/D病毒滅活液，即聚山梨酯80的濃度為1 %，磷酸三丁酯的濃度為0. 3%，攪拌均勻，采用病毒滅活Mi即可；步驟5、鹽析離心工序溶液加入20倍(W/W)注射用水，混勻，按1 5的比例加入飽和氯化鈉溶液，攪勻，用連續(xù)流離心機17000rpm離心分離沉淀；取沉淀物加入20倍(W/ W)注射用水，攪勻，使沉淀溶解完全，進行二次鹽析，再進行離心分離，收集沉淀物；其沉淀物與25倍注射水溶解，轉入CM陽離子色譜純化工序；步驟6、CM陽離子交換色譜純化工序將裝有CM陽離子交換樹脂的色譜柱 (10X100CM,華美公司)進行平衡，上樣速度為6. Oml/min,然后用pH值為4. O、濃度為 0. 6mol/L的氯化鈉溶液進行洗脫，收集細胞間質洗脫液；步驟7、超濾工序將收集的細胞間質洗脫液用孔徑為20kD的超濾器超濾 (Millipore)，進行濃縮脫鹽處理，收集截留液；步驟8、配制工序以截留液的生物蛋白含量與生長因子、凝血因子以一定比例進行配制，PH值為7. 5 ；步驟9、過濾除菌工序將配制好的溶液依次用孔徑為為0. 45 μ m和0. 22 μ m濾芯 (PALL)過濾，分裝；步驟10、凍干工序通過低溫冷凍干燥將加有生長因子、凝血因子溶液中的水分去除，采用_45°C進行冷凍lh，抽真空干燥，40°C恒溫Ih ；步驟11、二次滅活病毒工序將凍干后的產品進行內包裝，然后加熱滅活病毒，溫度為60°C、時間為144h；
以下工序都在潔凈區(qū)中進行，分裝工序、切割工序、內包裝工序、檢驗工序、成品包裝工序、入庫。實施例3步驟1、選取原料和脫脂處理取新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料，進行脫脂處理；其工藝如下將新鮮哺乳動物的結締組織或皮放入不銹鋼桶中，按原料與20%碳酸鈉溶液1 5的比例，浸泡30min，定時攪拌；浸泡后撈出，先用水反復沖洗數次，再用純化水反復沖洗8次；浙凈水分，用不銹鋼刀具刮凈原料上的油脂或毛囊等雜質；步驟2、粉碎工序先用切絲機將原料切成條狀，然后倒入絞肉機中粉碎，倒入不銹鋼桶中，加入75%乙醇溶液浸泡30min撈出，用純化水反復沖洗7次，再用注射用水反復沖洗4次，浙干；步驟3、酶解工序按Ikg 15kg的比例加入注射用水混勻，倒入膠體磨中勻漿； 勻漿液轉入酶解罐中，緩慢滴加鹽酸溶液，調一定PH值；按Ikg原料加入5g胃蛋白酶，酶解溫度控制在20°C之間，攪拌勻漿液PH值為3. 0時終止，此時酶解液成粘稠、均勻的膠狀流體；步驟4、S/D病毒滅活工序S卩脂胞膜病毒滅活，酶解液與注射用水按1 5的比例進行稀釋、混勻，用孔徑為40 μ m的濾芯進行粗濾，再用孔徑為1. 0 μ m濾芯進行精濾至病毒滅活罐中，加入蔗糖溶液、甘氨酸作為保護劑，達到終濃度為1.0%，在連續(xù)攪拌的狀態(tài)下， 緩慢加入S/D病毒滅活液，即聚山梨酯80的濃度為1%，磷酸三丁酯的濃度為0. 3%，攪拌均勻，采用病毒滅活Mi即可；步驟5、鹽析離心工序溶液加入10倍(W/W)注射用水，混勻，按1 3的比例加入飽和氯化鈉溶液，攪勻，用連續(xù)流離心機13500rpm離心分離沉淀；取沉淀物加入10倍(W/ W)注射用水，攪勻，使沉淀溶解完全，進行二次鹽析，再進行離心分離，收集沉淀物；其沉淀物與20倍注射水溶解，轉入CM陽離子色譜純化工序；步驟6、CM陽離子交換色譜純化工序將裝有CM陽離子交換樹脂的色譜柱 (10X100CM,華美公司)進行平衡，上樣速度為4. Oml/min,然后用PH = 4. O、濃度為 0. 4mol/L的氯化鈉溶液進行洗脫，收集細胞間質洗脫液；步驟7、超濾工序將收集的細胞間質洗脫液用孔徑為30kD的超濾器超濾 (Millipore)，進行濃縮脫鹽處理，收集截留液；步驟8、配制工序以截留液的生物蛋白含量與生長因子、凝血因子以一定比例進行配制，PH值為6.0;步驟9、過濾除菌工序將配制好的溶液依次用孔徑為0. 45 μ m和0. 22 μ m濾芯 (PALL)過濾，分裝；步驟10、凍干工序通過低溫冷凍干燥將加有生長因子、凝血因子溶液中的水分去除，采用-35°C進行冷凍2.證，抽真空干燥，30°C恒溫池；步驟11、二次滅活病毒工序將凍干后的產品進行內包裝，然后加熱滅活病毒，溫度為80°C、時間為72h;以下工序都在潔凈區(qū)中進行，分裝工序、切割工序、內包裝工序、檢驗工序、成品包裝工序、入庫?？梢岳斫獾厥?，以上關于本發(fā)明的具體描述，僅用于說明本發(fā)明而并非受限于本發(fā)明實施例所描述的技術方案，本領域的普通技術人員應當理解，仍然可以對本發(fā)明進行修改或等同替換，以達到相同的技術效果；只要滿足使用需要，都在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種生物蛋白海綿，它包括細胞間質、生長因子、凝血因子，其特征在于是以細胞間質為基質，均勻的添加一定比例的生長因子、凝血因子，通過冷凍干燥技術制備成海綿狀。
2.根據權利要求1所述的生物蛋白海綿，其特征在于所述細胞間質由膠原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖組成。
3.根據權利要求2所述的生物蛋白海綿，其特征在于所述膠原蛋白由I型和III型膠原蛋白為主的19種其他型膠原蛋白組成。
4.根據權利要求1所述的生物蛋白海綿，其特征在于所述生長因子分為堿性成纖維細胞生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、神經生長因子、結締組織生長因子、肽類生長因子、轉化生長因子、血小板源生長因子。
5.根據權利要求1所述的生物蛋白海綿，其特征在于所述凝血因子分為凝血酶因子、 纖維蛋白原因子、XIII因子。
6.根據權利要求1所述的生物蛋白海綿，其特征在于所述生物蛋白海綿每平方厘米生長因子、凝血因子的含量為30 300IU。
7.—種生物蛋白海綿的制備方法，采用如下工藝流程以新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料脫脂工序——粉碎工序——酶解工序——S/D病毒滅活工序——一次鹽析沉淀工序——離心分離工序——二次鹽析工序——CM陽離子交換色譜純化工序——超濾工序——配制工序一過濾除菌工序一分裝工序——凍干工序——切割工序——內包裝工序——二次滅活病毒工序——檢驗工序——成品包裝工序——入庫。包括以下步驟步驟1、選取原料和脫脂處理取新鮮哺乳動物的結締組織或皮為原料，進行脫脂處理；其工藝如下將新鮮哺乳動物的結締組織或皮放入不銹鋼桶中，按原料與10 35%碳酸鈉溶液1 1 10的比例，浸泡5 60min，定時攪拌；浸泡后撈出，先用水反復沖洗數次，再用純化水反復沖洗5 10次；浙凈水分，用不銹鋼刀具刮凈原料上的油脂或毛囊等雜質；步驟2、粉碎工序先用切絲機將原料切成條狀，然后倒入絞肉機中粉碎，倒入不銹鋼桶中，加入75%乙醇溶液浸泡5 60min撈出，用純化水反復沖洗5 10次，再用注射用水反復沖洗2 5次，浙干；步驟3、酶解工序按Ikg 5-30kg的比例加入注射用水混勻，倒入膠體磨中勻漿；勻漿液轉入酶解罐中，緩慢滴加鹽酸溶液，調一定PH值；按Ikg原料加入1 IOg胃蛋白酶， 酶解溫度控制在10°C 35°C之間，攪拌勻漿液PH值為2. 0 4. 0時終止，此時酶解液成粘稠、均勻的膠狀流體；步驟4、S/D病毒滅活工序S卩脂胞膜病毒滅活，酶解液與注射用水按1 1 10的比例進行稀釋、混勻，用孔徑為40 μ m的濾芯進行粗濾，再用孔徑為1. 0 μ m濾芯進行精濾至病毒滅活罐中，加入保護劑，達到終濃度為0. 5 1. 5%，在連續(xù)攪拌的狀態(tài)下，緩慢加入 S/D病毒滅活液，即聚山梨酯80的濃度為1 %，磷酸三丁酯的濃度為0. 3%，攪拌均勻，采用病毒滅活6h即可；步驟5、鹽析離心工序溶液加入1 20倍(W/W)注射用水，混勻，按1 1 5的比例加入飽和氯化鈉溶液，攪勻，用連續(xù)流離心機10000 17000rpm離心分離沉淀；取沉淀物加入1 20倍(W/W)注射用水，攪勻，使沉淀溶解完全，進行二次鹽析，再進行離心分離，收集沉淀物；其沉淀物與10 25倍注射水溶解，轉入CM陽離子色譜純化工序；步驟6、CM陽離子交換色譜純化工序將裝有CM陽離子交換樹脂的色譜柱 (10X100CM，華美公司)進行平衡，上樣速度為3.0 6. Oml/min，然后用pH = 4. O、濃度為 0. 3 0. 6mol/L的氯化鈉溶液進行洗脫，收集細胞間質洗脫液；步驟7、超濾工序將收集的細胞間質洗脫液用優(yōu)選孔徑為IOkD還可使用20kD、30kD 的超濾器超濾(Millipore)，進行濃縮脫鹽處理，收集截留液；步驟8、配制工序以截留液的生物蛋白含量與生長因子、凝血因子以一定比例進行配制，PH值為4. 5 7.5 ；步驟9、過濾除菌工序將配制好的溶液依次用孔徑為0. 45 μ m和0. 22 μ m濾芯(PALL) 過濾，分裝；步驟10、凍干工序通過低溫冷凍干燥將加有生長因子、凝血因子溶液中的水分去除， 采用-20°C -45°C進行冷凍1 釙，抽真空干燥，20°C 40°C恒溫1 釙；步驟11、二次滅活病毒工序將凍干后的產品進行加熱滅活病毒，溫度為60 100°C、 時間為0. 5 144h ；以下工序都在潔凈區(qū)中進行分裝工序、切割工序、內包裝工序、檢驗工序、成品包裝工序、入庫。
8.根據權利要求7所述的生物蛋白海綿的制備方法，其特征在于所述S/D病毒滅活工序加入蔗糖溶液、甘氨酸作為保護劑。
9.根據權利要求7所述的生物蛋白海綿的制備方法，其特征在于所述二次滅活病毒工序優(yōu)選溫度為60°c、80°c、10(rc ；優(yōu)選時間為144h、72h、0.釙。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物蛋白海綿及其制備方法，提供一種根據人體和動物體內細胞和細胞生長環(huán)境相適應的特點，利用細胞間質作為生長因子的緩釋載體，并通過冷凍干燥技術，使其形成凍干海綿狀，以緩釋的給藥方式作用于肌體創(chuàng)面。本發(fā)明的制備方法改變了傳統(tǒng)的制備過程，采用S/D病毒滅活并添加保護劑，避免人畜共患病毒交叉感染幾率；CM陽離子色譜純化過程，提高生物蛋白純度，促進生物蛋白海綿止血及組織愈合效果，降低臨床副反應；采用超濾工序替代透析工序，縮短了制備周期，保護生物蛋白活性，降低了生產成本；用加熱滅活病毒代替鈷60輻射滅菌方法，避免了放射線給產品帶來的危害，同時保護了生物蛋白的活性，實現產品在臨床應用上安全可靠。
文檔編號A61L15/32GK102357259SQ20111021271
公開日2012年2月22日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權日2011年7月28日
發(fā)明者王珊珊 申請人:王珊珊