專利名稱：高粱原花青素混合物的制備方法及其抗齲齒應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗齲齒功效的活性多酚一高粱原花青素混合物的制備方法。同時(shí)還涉及一種高粱原花青素混合物預(yù)防齲齒的用途。
背景技術(shù)：
原花青素是一種高活性植物多酚，它是以兒茶素(和/或)表兒茶素為結(jié)構(gòu)單元聚合而成的黃烷醇類聚合物(早期稱為縮合鞣質(zhì)或縮合單寧)。因其具有較強(qiáng)的抗氧化能力、清除自由基能力和較高的藥理活性，如抗癌、抗誘變、抗炎癥、抗HIV病毒等多種作用，現(xiàn)已在臨床醫(yī)學(xué)、化妝品等領(lǐng)域得到應(yīng)用。因此人們對原花青素的研究越來越重視，尋找新的富含原花青素的資源，適合于工業(yè)化提取、純化高活性原花青素的方法是目前有關(guān)原花青素研究的內(nèi)容之一。對植物材料中原花青素的提取和純化，一般都采用甲醇或丙酮水溶液等有機(jī)溶劑提取后，用乙酸乙酯萃取分離，再經(jīng)葡聚糖凝膠分離、純化。此類方法不僅成本高，而且產(chǎn)品中存在有機(jī)溶劑殘留和易造成環(huán)境污染。齲齒是人類廣泛流行的一種慢性疾病，尤其在青少年和兒童中，齲齒的發(fā)生率很高，世界衛(wèi)生組織已將齲齒列為與腫瘤、高血壓并列的3個重點(diǎn)防治疾病之一。研究表明齲齒發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果致齲菌在口腔中的生長和產(chǎn)酸，致齲菌在牙面的粘附和聚集，以及菌斑中超氧化物陰離子自由基的濃度等相關(guān)。對于齲齒這種發(fā)生于人類最常見的細(xì)菌性疾病，人們通過多種途徑尋找預(yù)防和治療方法，其中藥物防治是有效的和最常用的方法。但是現(xiàn)有的治療藥物和治療方法都存在一定的局限，如早期采用的抗生素類藥物如青霉素、紅霉素、四環(huán)素或螺旋霉素等，雖具有一定的防齲效果，但長期使用可引起口腔和腸道菌群失調(diào)而導(dǎo)致其他疾病。氟化物防齲是目前研究最多的方法，但其應(yīng)用有諸多局限性，如氟濃度的穩(wěn)定性保證，防止氟的毒副作用以及口腔耐氟菌株選擇性生長等方面的問題尚未解決而存在一定的爭議。因此，尋找一種使用安全、高效的防齲藥物成為預(yù)防齲齒研究的重點(diǎn)。近10多年來天然植物多酚防齲齒研究成為其中研究的熱點(diǎn)，大量的研究報(bào)道證實(shí)茶多酚是優(yōu)良的防齲齒功效成分。原花青素的分子中含有比兒茶素(茶多酚的主要成分)結(jié)構(gòu)單元中更多的酚羥基，而具有更廣泛的抑菌譜、更好的抑酶活性和結(jié)合蛋白質(zhì)的能力，以及清除包括超氧陰離子在內(nèi)的各種自由基的能力。這也預(yù)示原花青素可能是一種更值得關(guān)注的預(yù)防齲齒植物藥。已有報(bào)道證實(shí)，原花青素預(yù)防齲齒效果優(yōu)于茶多酚，KyoimgHeon Kim Q004)研究證實(shí)可可殼的提取物純化后(主要成分是原花青素)，其抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活力為從綠茶和烏龍茶中提取得到的茶多酚抑制率的2-12倍；KWOn(1990)等和Kim DY(2000)等的研究結(jié)果證實(shí)綠茶和烏龍茶提取物中由于含有大量的兒茶素和表兒茶素單體，其抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活力遠(yuǎn)低于可可殼提取的原花青素的活力。國外研究報(bào)道高粱是一種富含原花青素的植物資源，并對其分離、鑒定方法和生物活性進(jìn)行相關(guān)研究。我國高粱的栽培面積居世界第5位，產(chǎn)量居世界第3位，分布在全國
321個省市自治區(qū)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，我國產(chǎn)高粱外種皮中原花青素的含量超過5%，而且不同產(chǎn)地和品種高粱中原花青素含量和組成有較大差異。高粱作為食用和飼用時(shí)都要經(jīng)過碾白去掉外種皮(糠)，而碾白時(shí)出糠率為20%左右，這一富含原花青素資源未被有效利用。

發(fā)明內(nèi)容
以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的污染環(huán)境、安全性差和不適宜進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)的問題。本發(fā)明的目的是在于提供了一種高粱原花青素混合物的制備方法，該方法易行，操作簡便，采用超聲輔助乙醇溫浸提取，經(jīng)大孔樹脂分離純化方法得到活性多酚，該活性多酚的總多酚含量以原花青素計(jì)> 95%，得率為2. 2-3. 76%。通過提取、分離純化得到高粱原花青素混合物，并對純化后的原花青素混合物進(jìn)行了成分測定，已鑒定出的化合物有兒茶素/表兒茶素單體、原花青素二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體等。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種高粱原花青素混合物在治療或預(yù)防齲齒的藥物中的應(yīng)用，通過該方法獲得的高純度高粱原花青素可用于抗齲齒藥物的開發(fā)，本發(fā)明提供了高粱原花青素混合物在治療或預(yù)防齲齒藥物(功效)中的的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明所述的抗齲齒功效的活性多酚——高粱原花青素的綠色制備方法，采用超聲輔助乙醇溫浸提取，經(jīng)大孔樹脂分離純化方法得到活性多酚，該活性多酚的總多酚含量以原花青素計(jì)> 95%，得率為2. 2% 3. 76%。一種高粱原花青素混合物的制備方法，其步驟是a、將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末加入10-25倍(m/v)量的70% (體積比)乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4-7，混勻。置于20-60°C、20-40KHz的超聲波儀中加熱10-70min，經(jīng)減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液，真空濃縮得到提取液。乙醇回收利用。b、取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和10% -50% (體積比)乙醇洗脫。C、將步驟b中10-50% (體積比)乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末所述步驟a中加入70% (體積比)乙醇體積優(yōu)選為20倍。所述的步驟a中pH值優(yōu)選為4。所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的溫度優(yōu)選為。所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的時(shí)間優(yōu)選為66min。所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的功率優(yōu)選為^KHz。所述的步驟c中乙醇洗脫的純度優(yōu)選為40%。高粱原花青素混合物它含主要成分為兒茶素/表兒茶素單體、原花青素二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體等。高粱原花青素混合物作為治療或預(yù)防齲齒的藥物在抑制主要致齲齒菌生長、產(chǎn)酸中的應(yīng)用。高粱原花青素混合物在清除超氧陰離子中的應(yīng)用。高粱原花青素混合物含量的計(jì)算測量高粱原花青素粉末純度的方法采用鹽酸-正丁醇法(Porter’ s方法)。取
40. lmg/mL的高粱原花青素甲醇溶液ImL測試液于具塞螺旋試管中，然后依次加入6mL鹽酸-正丁醇(5 95，V/V)溶液和0. 2mL NH4(FeSO4)2 · 12H20溶液?；旌蠐u勻后，放入沸水中加熱45min，然后取出冷卻至室溫O0_25°C，以下相同)，于M6nm下測定吸光度。按下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算原花青素含量原花青素％ = abs/ (c/7. 2*0. 366)式中c 原花青素的濃度(mg/mL)，abs :546nm下的吸光度。高粱原花青素的結(jié)構(gòu)表征MS分析稱取凍干高粱原花青素粉末(含量為96. 01% )5mg，溶于5mL甲醇中，通過0. 45 μ m濾膜過濾。將濾液通過直接進(jìn)樣模式進(jìn)行MS分析。MS/MS分析條件負(fù)離子模式；離子化方式ESI-；掃描范圍50-2200m/z ；干燥氣溫度350°C，干燥氣流速10L/min ；噴霧壓力40psi;毛細(xì)管電壓3000V。高粱原花青素混合物全范圍掃描質(zhì)譜圖見圖1。全范圍掃描質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的主要分子離子的MS/MS分析結(jié)果見表1。表1 高粱原花青素混合物全范圍掃描質(zhì)譜圖中主要分子離子的MS/MS圖譜中出
現(xiàn)的主要碎片離子
原花青素低聚體及單體分子離子(m/z)碎片離子(m/z)單體289.25245.21(203.27), 205.21, 179.21二聚體577.19289.18, 407.24, 425.11,451.17三聚體865.19406.87，451.03，574.91，713.15，739.14四聚體1153.22407.06，451.15，575.00，577.15，713.04，865.16， 983.16, 1027.19五聚體1441.28575.10，577.15，739.15，865.70，983.13， 1027.15，1153.13，1271.13，1315.11，1423.12六聚體1730.20575.12, 863.17，983.13，1027.15，1151.12， 1153.15，1439.10，1441.15，1559.11，1603.18， 1711.12本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果對環(huán)境友好，選取水、乙醇為溶劑，環(huán)境污染小，減少了有機(jī)溶劑的使用；通過超聲波輔助提取大大節(jié)約了提取所用時(shí)間，并降低了提取溫度，具有高效、低碳效果；另本發(fā)明不僅提供了高粱原花青素安全高效的提取制備方法，同時(shí)還做了關(guān)于預(yù)防齲齒功效方面的理論研究。該方法是采用超聲輔助乙醇溫浸提取，經(jīng)大孔樹脂分離純化方法得到活性多酚，該活性多酚的總多酚含量以原花青素計(jì)> 95%，得率為2. 2-3. 76%。通過提取、分離純化得到高粱原花青素混合物，并對純化后的原花青素混合物進(jìn)行了成分測定，已鑒定出的化合物有兒茶素/表兒茶素單體、原花青素二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體等。


圖1為提取時(shí)間與功率對原花青素提取率影響的響應(yīng)面示意圖(A)和等高線示意圖(B)0從圖1 (A)可以看出，隨時(shí)間(Xl)變化，曲面變化比較陡峭；隨功率(X2)變化，曲面變化比較平坦。固定超聲波頻率的大小，原花青素的得率隨著時(shí)間的增加而增大，曲線趨于平緩，這可能是因?yàn)楫?dāng)時(shí)間大于一定的值時(shí)，原花青素大部分已經(jīng)被提取出來，并可能導(dǎo)致原花青素的破壞。當(dāng)固定時(shí)間提取時(shí)，原花青素的得率也是隨著超聲波頻率的增加而增加的，但斜率小于Xl的斜率。由此可知時(shí)間對原花青素得率的影響大于功率。(B)圖等高線揭示了交互作用的規(guī)律，圖中等值線密的方向，對應(yīng)的坐標(biāo)所表示的因素為交互作用的主要方面。由圖可見，時(shí)間(Xl)處于各水平時(shí)，隨功率(X2)增加，得率均緩慢增加；功率(X2)處于各水平時(shí)，隨時(shí)間(Xl)增加，得率均迅速增加。所以，交互作用X1X2中影響優(yōu)化值的主要方面是提取時(shí)間。圖2為提取時(shí)間與溫度對原花青素提取率影響的響應(yīng)面示意圖(A)和等高線示意圖(B)0圖2㈧顯示，隨時(shí)間(Xl)變化，曲面呈上升狀態(tài)，由陡峭變得平緩；隨溫度(X3)變化，曲面變化比較平坦。當(dāng)超聲波頻率達(dá)到MKHz (中心點(diǎn)值)時(shí)，固定提取溫度，原花青素的得率隨著時(shí)間的增加呈拋物線變化，這可能是因?yàn)檩^長時(shí)間的超聲波提取導(dǎo)致了原花青素結(jié)構(gòu)的破壞，從而影響了原花青素的得率。當(dāng)固定提取時(shí)間時(shí)，原花青素的得率隨著提取溫度的升高也呈拋物線變化，但變化量較小。這可能是因?yàn)樵ㄇ嗨厥艿捷^高溫度，發(fā)生分解，從而影響其得率。(B)圖表明，時(shí)間(Xl)處于較低水平時(shí)，隨溫度(X3)增加而得率無明顯變化；時(shí)間(Xl)處于高水平時(shí)，隨溫度(X3)增加而得率緩慢升高。溫度(X3)處于各水平時(shí)，隨時(shí)間(Xl)增加得率均迅速增加。因此等高線表明交互作用X1X3影響優(yōu)化值的主要方面是提取時(shí)間。圖3為提取功率與溫度對原花青素提取率影響的響應(yīng)面示意圖(A)和等高線示意圖(B)0圖3 (A)顯示，隨溫度(X3)變化，曲面變化比較平坦；隨功率(X2)變化，曲面變化比較陡峭。當(dāng)固定提取溫度時(shí)，原花青素的得率隨著超聲波頻率的增加呈上升趨勢，并且功率較低時(shí)，得率變化明顯。當(dāng)固定超聲波頻率時(shí)，原花青素的得率隨著提取溫度也呈拋物線變化。(B)圖表明，溫度(X3)處于各水平時(shí)，隨功率(X2)增加，得率均迅速增加。功率(X2)處于各水平時(shí)，隨溫度(Χ》增加，得率均緩慢升高。等高線表明交互作用X2X3影響優(yōu)化值的主要方面是超聲波頻率。圖4為高粱原花青素混合物全范圍掃描質(zhì)譜圖。高粱原花青素全掃描質(zhì)譜圖中顯示含有m/z 577. 19,865. 19,1153. 22,1441. 28和1730. 20，它們分別對應(yīng)為原花青素的二聚體(分子量578)、三聚體(分子量866)、四聚體(分子量1154)、五聚體(分子量144 和六聚體(分子量1731)的分子離子(M-H)-圖5為不同濃度高粱原花青素混合物對超氧陰離子的清除率隨著高粱原花青素濃度O00mg/L-600mg/L)的增大，對超氧陰離子的清除能力逐漸增強(qiáng)(13. · 80% -44. 90% ) ο
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種高粱原花青素混合物粉末的制備方法(具有抗齲齒功效的活性多酚的綠色制備方法)，其步驟是a、將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末加入10或15或20或25倍(m/v)量的70%(體積比)乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至4或5或6或7，混勻。置于20或30或40或50或60°C、20或30或40KHz的超聲波儀中加熱10或20或30或40或50或60或70min，經(jīng)減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液，真空濃縮得到提取液。乙醇回收利用。b、取提取液加入大孔樹脂層析柱中，先后用水和10或20或30或40或50%乙醇洗脫。C、將步驟b中10或15或25或35或45或50%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末所述步驟a中加入70%乙醇體積優(yōu)選為20倍。所述的步驟a中pH值優(yōu)選為4。所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的溫度優(yōu)選為。所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的時(shí)間優(yōu)選為66min。所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的功率優(yōu)選為^KHz。所述的步驟c中乙醇洗脫的純度優(yōu)選為40 %。實(shí)施例2 將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入10倍(m/v)量的70 %乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱70min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入15倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱70min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱70min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入25倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱70min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。
將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例6 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱50min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例7 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例8 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至5，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例9 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至6，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例10 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至7，混勻，然后放入40°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例11 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入50°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40 %乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例12 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入60°C 20KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40 %乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例13 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入60°C 24KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例14:將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入60°C 28KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和40%乙醇洗脫。將40 %乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。實(shí)施例14將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入60°C 24KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和30%乙醇洗脫。將30%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例15 將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末IOOmg加入20倍(m/v)量的70%乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4，混勻，然后放入60°C 24KHz的超聲波儀中水浴加熱60min，經(jīng)過減壓(-0. IMP)抽濾得到上清液。真空濃縮得到提取液。取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和50%乙醇洗脫。將50%乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。其中實(shí)施例14為最佳實(shí)施例。實(shí)施例16
高粱原花青素混合物作為治療或預(yù)防齲齒藥物在抑制主要致齲齒菌生長中的應(yīng)用，其具體應(yīng)用步驟是將復(fù)蘇兩種主要致齲齒菌S. mutans Ingbritt C和S. sobrinus 6715凍干株轉(zhuǎn)接于TSB培養(yǎng)液中，于37°C恒溫厭氧培養(yǎng)18h，涂片檢查為純培養(yǎng)后，用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛日{(diào)整為105-106CFU/mL。稱取定量高粱原花青素混合物粉末，用無菌TSB培養(yǎng)液溶解，混勻，即為實(shí)驗(yàn)原液。以培養(yǎng)基將實(shí)驗(yàn)原液稀釋為二倍遞減的系列應(yīng)用液，濃度分別為32、16、 8、4、2、1和0. 5mg/mL含高粱原花青素混合物的TSB培養(yǎng)液。用無菌微量加樣器吸取系列濃度的含高粱原花青素混合物培養(yǎng)液ImL于滅菌試管中，再加入等量菌液，混勻，使培養(yǎng)液最終藥物濃度分別為16、8、4、2、1、0. 5和0. 25mg/mL,以上每個濃度4個平行，設(shè)陽性對照(不加各種藥品，只加菌液和等量液體培養(yǎng)基)和陰性對照(不加菌液，只加各種藥品和等量液體培養(yǎng)基)。37°C厭氧培養(yǎng)Mh。以培養(yǎng)液中無菌生長的最低稀釋濃度為MIC。用無菌微量加樣器吸取微量上述各試管中培養(yǎng)物50 μ L于滅菌培養(yǎng)皿中，TSA固體培養(yǎng)基混平皿，37°C 厭氧培養(yǎng)24h后觀察，無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MBC。結(jié)果見表2 表2 高粱原花青素作用 S. mutans hgbritt 和 S. Sobrinus 6715 的 MIC 值和 MBC 值
權(quán)利要求
1.一種高粱原花青素混合物的制備方法，其步驟是a、將高粱碾磨過篩得到外種皮粉末加入10-25倍m/v量的70%體積比乙醇，加入偏磷酸及亞硫酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至4-7，混勻，置于20-60°C、20-40KHz的超聲波儀中加熱10-70min，經(jīng)減壓-0. IMP抽濾得到上清液，真空濃縮得到提取液，乙醇回收利用；b、取提取液加入ADS-17大孔樹脂層析柱中，先后用水和10%-50%體積比乙醇洗脫；C、將步驟b中10-50%體積比乙醇洗脫部分通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高粱原花青素混合物的制備方法，其特征在于所述的步驟a中加入70%體積比乙醇體積為20倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高粱原花青素混合物的制備方法，其特征在于所述的步驟a中pH值為4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高粱原花青素混合物的制備方法，其特征在于所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的溫度為M 0C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高粱原花青素混合物的制備方法，其特征在于所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的時(shí)間為66 min0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高粱原花青素混合物的制備方法，其特征在于所述的步驟a中超聲波水浴溫浸的功率為沈KHz0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高粱原花青素混合物的制備方法，其特征在于所述的步驟c中乙醇洗脫的純度為40%。
8.權(quán)利要求1所述的一種高粱原花青素混合在治療或預(yù)防齲齒的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高粱原花青素的制備方法及抗齲齒應(yīng)用，該方法以70%的乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取技術(shù)進(jìn)行提??；分別以水和40%乙醇為流動相，提取液通過ADS-17大孔樹脂層析進(jìn)行純化，收集40%乙醇洗脫液，通過真空濃縮和冷凍干燥后得到高粱原花青素混合物，原花青素含量＞95%，得率為2.2-3.76%。該方法易行，操作簡便，對環(huán)境友好。對原花青素混合物采用ESI-MS/MS進(jìn)行鑒定，其組成為兒茶素/表兒茶素單體、原花青素二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體。通過該方法獲得的高粱原花青素具有通過抑制致齲齒菌的生長、產(chǎn)酸和清除超氧陰離子達(dá)到抗齲齒發(fā)生的效果。
文檔編號A61K31/353GK102389417SQ20111021339
公開日2012年3月28日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者劉睿, 崔瑩, 徐麗嫚, 李端丹, 黃曼 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)