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納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):865651閱讀:532來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物載體領(lǐng)域,具體涉及納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
由于癌癥是最致命的疾病之一,每年就有1千萬(wàn)人死于癌癥。雖然近年來(lái)診斷設(shè)備和治療技術(shù)有了很大的提高,死亡率有所下降,但是癌癥治療藥物普遍具有毒性,對(duì)人體良性組織和細(xì)胞具有殺傷性,亟待改進(jìn)(Dan Peer and Jeffrey Μ. Karp, Nat. Nanotechnol., 2007,2: 751-760.)。納米技術(shù)的發(fā)展似乎帶來(lái)了心的曙光,目前被應(yīng)用到了工程學(xué)、物理、化學(xué)和生物學(xué)等方面(Mauro Ferrari,Nat. Rev. Cancer, 2005, 5:161 - 171.),納米粒子由于其高比表面、尺寸小、高活性,能夠克服癌癥治療的困難,也被作為新型抗癌藥物研究。近年來(lái),生物降解性的納米粒子具有延長(zhǎng)對(duì)特定器官的循環(huán)作用周期的能力,因此通常被作為一種潛在藥物傳送載體,它作為一種藥物的攜帶者在腫瘤學(xué)的發(fā)展中已經(jīng)打破了抗腫瘤治療在生理和藥理方面的障礙(Kommareddy et al, Technol Cancer Res. Treat., 2005, 4: 615—625; Lee and Kim, Pharm. Res., 2005,22: 1-10; Barbara and Eugene, Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations 2008,26: 57 - 64;)。納米粒子作為抗腫瘤藥物的攜帶者為直接進(jìn)入腫瘤組織提供了一種新的方法。納米粒子可以運(yùn)送特定劑量的抗腫瘤藥物到腫瘤組織中,既可以增強(qiáng)抗腫瘤藥物的滲透性還可以很好的保留抗腫瘤藥物原有的治療效果。這些修飾以后的納米粒子可以直接與腫瘤細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核受體相互作用于。這使得我們可以控制和維持藥物在運(yùn)輸和特定作用位點(diǎn)的釋放??刂扑幬镌谔囟ńM織中的分布,讓抗癌藥物直接作用于腫瘤細(xì)胞,然后還可以清除多余的藥物,減少了藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用的同時(shí),也提高藥物的治療效果。硒是人體所必須的痕量元素,具有重要的生理功能和藥理作用。有研究表明富硒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠預(yù)防癌癥并且降低癌癥的病癥程度(Natalia. Cancer Lett., 2002, 197:39— 42)。 盡管硒在臨床上被局限于化學(xué)預(yù)防試劑,但是硒也可以與其他抗癌試劑聯(lián)用治療癌癥。Cao利用伊立替康(治療結(jié)腸癌藥物)和硒結(jié)合使用,來(lái)降低化學(xué)藥物的毒性,并且成功提高了對(duì)伊立替康有耐藥性的小鼠癌細(xì)胞的治愈率(Cao et al, Clin. Cancer Res.,2004,10 2561-2569入 Greeder報(bào)道了硒化合物能夠抑制癌癥的發(fā)展, 并且對(duì)動(dòng)物的其他組織沒(méi)有明顯毒副作用(Glenn and Greeder. Milner. Science, 1980, 209:825-826)。Hu報(bào)道了硒化合物可以增強(qiáng)紫杉醇對(duì)前列腺癌的治愈效果,硒可以作為覆載藥物而又具有良好應(yīng)用前景的試劑(Hu et al,Clin. Cancer Res, 2008 1150-1158)。納米硒由于具有更好的生物適應(yīng),得到了研究者的重視。^iang等發(fā)現(xiàn)與硒代甲基硒半胱氨酸相比,納米尺寸的硒在提高特征酶活性上與其具有相同的功效,但是毒副作用更低。此外,納米硒在體內(nèi)還具有自由基清除的功能,是有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒化合物難以達(dá)到的(Zhang et al, Toxicological Sciences, 2008,101: 22 - 31)。因此,我們的主要目標(biāo)是把納米硒粒子作為一個(gè)運(yùn)輸體系,用抗癌藥物對(duì)納米粒子的大小進(jìn)行控制、改變納米粒子的表面性能的同時(shí),還維持了抗腫瘤藥物的藥理活性作用,實(shí)現(xiàn)納米硒與抗癌藥物的雙重抗腫瘤作用。
納米控釋抗癌藥物與普通抗癌藥物相比,具有可靶向輸送、緩釋藥物、延長(zhǎng)給藥時(shí)間和減少毒副作用等優(yōu)點(diǎn),因而具有廣闊的應(yīng)用前景。其中,5-氟尿嘧啶作為一種廣譜性抗腫瘤藥物,其療效顯著,但和大多數(shù)抗腫瘤藥物一樣,5-氟尿嘧啶的安全治療范圍相對(duì)較窄,毒性隨劑量的增加而增加。大部分的藥物在肝臟中分解代謝為沒(méi)有活性的產(chǎn)物二氫嘧啶脫氫酶(DPD),血漿半衰期極短,體內(nèi)僅5min,致使藥物的生物利用率降低,需頻繁給藥。同時(shí),5-氟尿嘧啶缺乏腫瘤細(xì)胞的選擇性,對(duì)非靶細(xì)胞和器官造成較大的不良反應(yīng), 如消化道反應(yīng)、骨髓抑制、脫發(fā)、內(nèi)分泌失調(diào)等,嚴(yán)重者甚至發(fā)生血性下瀉而死亡,嚴(yán)重限制了 5-氟尿嘧啶劑量的提高和療效。Thant等研究發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉和5-氟尿嘧啶聯(lián)用后,改善了 5-氟尿嘧啶對(duì)結(jié)腸癌的耐藥性(Thant et al, Anticancer Res. ,2008, 28 3579-3592)。Schroeder等研究發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用后,使5-氟尿嘧啶對(duì)SW620結(jié)腸癌細(xì)胞的抗增殖作用提高了 1. 5倍Gchroeder et al, Biol. Trace Elem. Res.,2004,明:17-25. )。Rustum等研究發(fā)現(xiàn)硒對(duì)5-氟尿等化療藥物引起的細(xì)胞毒性有保護(hù)作用(Fakih et al, Clin. Cb/orecia/ Ca/^er,湖Λ5",5 :132_1;35.)。故而用 5-氟尿嘧啶修飾納米硒,一方面5-氟尿嘧啶以納米硒為運(yùn)輸載體,提高生物利用率,降低所需劑量; 另一方面高效低毒的納米硒,可以降低5-氟尿嘧啶耐藥、對(duì)化療藥不敏感的癌細(xì)胞通過(guò)硒殺傷,提高化療的治愈率。同時(shí)納米硒可以減少5-氟尿嘧啶對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。這對(duì)進(jìn)一步提高納米硒和5-氟尿嘧啶的抗癌效果,臨床應(yīng)用的靈活性具有重要的意義。同樣,阿霉素既含有脂溶性的蒽環(huán)配基,又有水溶性的柔紅糖胺,有酸性酚羥基和堿性氨基,易于通過(guò)細(xì)胞膜,可多靶點(diǎn)起作用,療效廣泛,故而具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞有特殊的療效,并且它是通過(guò)抑制細(xì)胞核酸的生成來(lái)起到抗癌效果(Swati et al,Cancer Nano, 2011, 10: 7-12.)。但是,P-糖蛋白的流出、心臟毒性、腎毒性、骨髓抑制和異構(gòu)酶的限制導(dǎo)致阿霉素分布不均勻,限制阿霉素的療效。然而,納米粒子可以通過(guò)控制阿霉素的釋放來(lái)減少對(duì)正常組織的毒副作用,并且阿霉素作為抗癌藥物容易與納米粒子形成共軛結(jié)合后更容易滲透到細(xì)胞里。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的對(duì)抗腫瘤藥物的研究,提供一種可發(fā)揮抗腫瘤藥物和納米硒在抗腫瘤方面協(xié)同作用的抗腫瘤藥物復(fù)合體系。該體系中,抗腫瘤藥物在納米硒中的負(fù)載率高,體系穩(wěn)定性好。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn) 納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用,可以是如下兩種方法
(1)常溫常壓下,將還原性溶液與抗腫瘤藥物溶液混合均勻后,滴加二氧化硒溶液或亞硒酸鹽溶液并攪拌,定容,反應(yīng)H4h,得到負(fù)載抗腫瘤藥物的納米硒溶膠; 或者是
(2 )常溫常壓下,將二氧化硒溶液或亞硒酸鹽溶液與抗腫瘤藥物溶液混合均勻后,滴加還原性溶液并攪拌,定容,反應(yīng)1 Mh,得到負(fù)載抗腫瘤藥物的納米硒溶膠。作為一種優(yōu)選方案,上述兩種方法中,所述還原性溶液為維生素C、谷胱甘肽、硼氫化鈉或水合胼溶液;所述抗腫瘤藥物為5-氟尿嘧啶、阿霉素、順鉬或紫杉醇;所述亞硒酸鹽為亞硒酸鈉。更進(jìn)一步地,所述還原性溶液的濃度為0. 2^100 mmol · L—1,二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的濃度為0. 05 25 mmol · L—1,所述抗腫瘤藥物溶液濃度為10 200 mg · L—1。本發(fā)明上述方法制得的負(fù)載抗腫瘤藥物的納米硒溶膠的保存方式是在2 1(TC下以溶膠或粉末形態(tài)保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果
(1)納米硒的尺寸一般5(Γ200納米,在水溶液中具有較好的穩(wěn)定性,具有較好的生物相容性,以此為載體覆載抗腫瘤藥物可以實(shí)現(xiàn)高的載藥量。(2)以納米硒作為載體覆載抗腫瘤藥物能夠克服多數(shù)抗腫瘤藥物溶解性和穩(wěn)定性差、血藥濃度半衰期短、毒副作用大等諸多生物屏障。實(shí)現(xiàn)兩者的協(xié)同作用,療效高于納米硒及抗腫瘤藥物本身。(3)抗腫瘤藥物在結(jié)構(gòu)上具有特殊性,具有羥基、氨基等結(jié)構(gòu),具有良好的親水性, 同時(shí)具有疏水鏈段,容易與納米粒子形成共軛結(jié)合后更容易滲透到細(xì)胞里。(4)腫瘤藥物修飾納米硒后,得到了粒徑較小、穩(wěn)定性好、高效低毒的納米粒子。增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的吸收率,能顯著降低臨床上癌癥化療時(shí)大劑量使用硒所帶來(lái)的毒害作用,同時(shí)減少抗癌藥物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的毒副作用,同時(shí)還可發(fā)揮抗癌活性小分子和納米硒的協(xié)同抗癌作用。為臨床上癌癥的聯(lián)合化療提供一種很好的優(yōu)選方案。(5)本文所制備的抗腫瘤藥物修飾的納米硒,操作簡(jiǎn)單,簡(jiǎn)便快捷。且本體系中以維生素C等為還原劑,以抗癌小分子對(duì)納米硒進(jìn)行功能化調(diào)控,不添加其他任何模板劑,避免了在實(shí)際應(yīng)用中可能產(chǎn)生的不良效果。


圖1為5-氟尿嘧啶功能化納米硒的TEM圖(Α:納米硒,B、C :5_氟尿嘧啶/納米硒)和粒徑隨時(shí)間的變化(D);
圖2為A: 5-氟尿嘧啶/納米硒的EDX分析;B:納米硒、5-氟尿嘧啶/納米硒、5-氟尿嘧啶的紅外光譜圖3為納米硒、阿霉素/納米硒的SEM圖; 圖4為納米硒、阿霉素、阿霉素納米硒體系的紅外光譜圖; 圖5為納米硒、阿霉素/納米硒液相中的的平均粒度及其分布圖; 圖6為(A) 2小時(shí)以后,包覆有香豆素6的5-氟尿嘧啶/納米硒在不同濃度下對(duì)人體黑色素瘤細(xì)胞的吸收;(B) 40 yg ^mr1香豆素6納米硒粒子在不同時(shí)間下對(duì)人體黑色素瘤細(xì)胞的吸收;
圖7為香豆素6納米粒子、納米硒對(duì)人體黑色素瘤細(xì)胞吸收的定量分析; 圖8為(A) MTT法測(cè)試得到5-氟尿嘧啶/納米硒對(duì)不同細(xì)胞系的I C5tl值;(B) MTT法測(cè)試得5-氟尿嘧啶、納米硒、5-氟尿嘧啶/納米硒分別對(duì)A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞的存活情況;
圖9為5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的A375細(xì)胞的凋亡(A)用Epics XL-MCL流式細(xì)胞儀分析5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的A375細(xì)胞周期變化,(B)用TUNEL和DAPI法(NikonEclipse 80i熒光顯微鏡)檢測(cè)5FU-NaiK^e誘導(dǎo)的A375細(xì)胞的凋亡時(shí)DNA斷裂和染色質(zhì)固縮圖10為5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的caspase獨(dú)立的A375細(xì)胞的凋亡(A) 5_氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的caspase 3、8、9的活性,(B)不同的caspase抑制劑對(duì)5_氟尿嘧啶/ 納米硒誘導(dǎo)的A375細(xì)胞凋亡的影響;
圖 11 為(A)用 Epics XL-MCL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter, Miami, FL)檢測(cè) 5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的A375細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化;(B)用DCFH-DA熒光法分析A375 細(xì)胞在不同濃度的5-氟尿嘧啶/納米硒作用3小時(shí)下,細(xì)胞內(nèi)的活性氧變化情況,(C) 一定濃度的5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的A375細(xì)胞凋亡,在不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)的活性氧的變化情況,(D)利用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)觀察5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的A375細(xì)胞凋亡中活性氧的變化情況。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明,但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1抗腫瘤藥物功能化納米硒粒子的制備
常溫常壓下(15 35 °C,1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓),配制5 mmol · L—1的二氧化硒或亞硒酸鈉和 20 mmol · L—1維生素C等還原性溶液。配制32. 5 mg · mL—1的5-氟尿嘧啶溶液。取適量抗腫瘤藥物溶液,再加入濃度為25 mmol · L—1的維生素C等還原性溶液1. 0 ml,輕輕搖勻使之混合充分后,滴加濃度為5 mmol · L—1的亞硒酸鈉溶液1. 0 ml,邊滴加邊輕輕搖勻,滴加完畢,加水定容至5 ml容量瓶中,待紅色不再加深,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至4 °C下在水溶液中以溶膠或粉末形態(tài)保存,反應(yīng)時(shí)間為M小時(shí)。即得到納米硒濃度為1 mmol · Γ1,維生素C濃度為 4 mmol · L—1O
實(shí)施例2抗腫瘤藥物功能化納米硒粒子的制備
常溫常壓下(15 35 °C,1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓),配制5 mmol化―1的二氧化硒或亞硒酸鈉和20 mmol · Γ1維生素C等還原性溶液。配制32. 5 mg · mL—1的5-氟尿嘧啶溶液。取濃度為20 mmol · Γ1的維生素C等還原性溶液1. 0 ml,滴加濃度為5 mmol · L—1的亞硒酸鈉溶液1. 0 ml,邊滴加邊輕輕搖勻,加入適量抗腫瘤藥物溶液,再加入輕輕搖勻使之混合充分后,滴加完畢,加水定容至5 ml容量瓶中,待紅色不再加深,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至4 °C下在水溶液中以溶膠或粉末形態(tài)保存,反應(yīng)時(shí)間為M小時(shí)。即得到納米硒濃度為1 mmol · Γ1,維生素C濃度為 4 mmol · L-1。實(shí)施例3 5-氟尿嘧啶功能化納米硒粒子的制備
常溫常壓下(15 35 °C,1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓),配制5 mmol · L—1的亞硒酸鈉和20 mmol · L—1 維生素C溶液各10 ml。配制32. 5 mg · mL—1的5-氟尿嘧啶溶液。然后再加入濃度為20 mmol -T1的維生素C溶液1. 0 ml,輕輕搖勻使之混合充分后,滴加濃度為5 mmol -L"1的亞硒酸鈉溶液1.0 ml,邊滴加邊輕輕搖勻,滴加完畢,加水定容至5 ml容量瓶中,待紅色不再加深,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至4 !下在水溶液中以溶膠或粉末形態(tài)保存,反應(yīng)時(shí)間為M小時(shí)。即得到納米硒濃度為1 mmol ·Ι^,維生素C濃度為4 mmol ·Ι^,5-氟尿嘧啶濃度為6. 5 mg -πιΓ1 的產(chǎn)物。用TECNAI-10型透射電子顯微鏡(Philips)表征的納米硒和5-氟尿嘧啶功能化
6納米硒形貌;由結(jié)果可知5-氟尿嘧啶對(duì)納米硒功能化后得到了規(guī)則球形納米粒子,并對(duì)納米硒有很好的分散作用(圖1,A-C); Nano-ZS (Malvern Insruments Limited)測(cè)定產(chǎn)物中的納米粒子粒徑分布隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性;分析得出5-氟尿嘧啶功能化納米硒后其粒子穩(wěn)定性可以維持6天(圖1,D)。用能量分散型X射線分析裝置(EX-250,Horiba)對(duì) 5-氟尿嘧啶功能化納米硒進(jìn)行元素分析,分析得出得納米硒表面含有C、N、O、F元素,說(shuō)明納米硒表面包覆有5-氟尿嘧啶(圖2,A);用傅立葉變換紅外光譜儀表征5-氟尿嘧啶和 5-氟尿嘧啶功能化納米硒譜峰變化;分析得出納米硒與5-氟尿嘧啶作用后,其紅外光譜中出現(xiàn)了 5-氟尿嘧啶的特征峰,并且有峰的藍(lán)移現(xiàn)象發(fā)生,說(shuō)明納米硒與5-氟尿嘧啶發(fā)生了相互作用(圖2,B)。實(shí)施例4阿霉素功能化納米硒粒子的制備
常溫常壓下(15 35 °C,1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓),配制5 mmol · L—1的亞硒酸鈉和20 mmol · L—1 維生素C溶液各10 ml。取2. 7 mg -πιΓ1的阿霉素溶液150 μ 1加入至5 ml容量瓶中,然后再加入濃度為20 mmol 的維生素C溶液1.0 ml,輕輕搖勻使之混合充分后,滴加濃度為5 mmol · L—1的亞硒酸鈉溶液1. 0 ml,邊滴加邊輕輕搖勻,滴加完畢,加水定容至5 ml 容量瓶中,待紅色不再加深,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至4 !下在水溶液中以溶膠或粉末形態(tài)保存,反應(yīng)時(shí)間為M小時(shí)。即得到納米硒濃度為1 mmol ·Ι^,維生素C濃度為4 mmol ·Ι^,阿霉素濃度為0. 54 mg · πιΓ1的產(chǎn)物。用能量分散型X射線分析裝置(EX-250,Horiba)表征的阿霉素功能化納米硒掃描形貌圖;分析得出,納米硒與阿霉素作用后其形貌發(fā)生了變化,阿霉素對(duì)納米硒有調(diào)控修飾作用(圖3)。用傅立葉變換紅外光譜儀表征阿霉素和阿霉素功能化納米硒譜峰變化;分析得出納米硒與阿霉素作用后,其紅外光譜中出現(xiàn)了阿霉素的特征峰, 并且有峰的藍(lán)移現(xiàn)象發(fā)生,說(shuō)明納米硒與阿霉素發(fā)生了相互作用(圖4)。NanoIS (Malvern Insruments Limited)測(cè)定產(chǎn)物中的納米粒子粒徑分布情況;分析得出阿霉素功能化納米硒后粒徑主要集中在100納米左右(圖5)。用酶標(biāo)儀測(cè)試阿霉素功能化納米硒溶液中的阿霉素含量,用ICP-MS測(cè)量阿霉素功能化納米硒溶液中的硒含量,通過(guò)計(jì)算得出納米硒與阿霉素的摩爾比為1 :1,由此說(shuō)明一個(gè)納米硒粒子表面包覆有一個(gè)阿霉素。
實(shí)施例5含有香豆素6的5-氟尿嘧啶/納米硒對(duì)人體黑色素瘤細(xì)胞的吸收
常溫常壓下(15 35 °C,1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓),配制5 mmol · L—1的亞硒酸鈉和20 mmol · L—1 維生素C溶液各10 ml。配制32. 5 mg · mL—1的5-氟尿嘧啶溶液。然后再加入濃度為20 mmol · Γ1的維生素C溶液1. O ml,輕輕搖勻使之混合充分后,滴加濃度為5 mmol · L—1的亞硒酸鈉溶液1. O ml,邊滴加邊輕輕搖勻,隨后加入400 μ L濃度為1 mg -πιΓ1的香豆素 6溶液,滴加完畢,加水定容至5 ml容量瓶中,待紅色不再加深,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至4°C下在水溶液中以溶膠或粉末形態(tài)保存,反應(yīng)M小時(shí)以后。即得到納米硒濃度為1 mmol ·Ι^,維生素C濃度為4 mmol · L—1,5-氟尿嘧啶濃度為6. 5 mg · mL—1的產(chǎn)物,香豆素6濃度為0. 08 mg -πιΓ1的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)過(guò)M h透析(截留分子量6000)后經(jīng)硝化ICP方法測(cè)定5-氟尿嘧啶功能化納米硒水溶膠中硒含量,定量后的透析產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)。用Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡測(cè)試含有熒光染料(香豆素6)的5-氟尿嘧啶/納米硒(5FU-Nan0Se)對(duì)人體黑色素瘤細(xì)胞的吸收,分析結(jié)果表明,人體黑色素瘤細(xì)胞對(duì)含有熒光染料(香豆素6)的 5-氟尿嘧啶/納米硒的吸收隨著時(shí)間和劑量的增加而增加(圖6和圖7)。實(shí)施例6、5_氟尿嘧啶調(diào)控納米硒抗腫瘤活性與凋亡機(jī)制測(cè)試常溫常壓下(15 35 °C,1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓),配制5 mmol · L—1的亞硒酸鈉和20 mmol · L—1 維生素C溶液各10 ml。配制32. 5 mg · mL—1的5-氟尿嘧啶溶液。然后再加入濃度為20 mmol -T1的維生素C溶液1. 0 ml,輕輕搖勻使之混合充分后,滴加濃度為5 mmol -L"1的亞硒酸鈉溶液1.0 ml,邊滴加邊輕輕搖勻,滴加完畢,加水定容至5 ml容量瓶中,待紅色不再加深,將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至4 !下在水溶液中以溶膠或粉末形態(tài)保存,反應(yīng)M小時(shí)以后。即得到納米硒濃度為1 mmol · L—1,維生素C濃度為20 mmol · L—1,5-氟尿嘧啶濃度為6. 5 mg-πιΓ1 的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)過(guò)對(duì)h透析(截留分子量6000)后經(jīng)硝化ICP方法測(cè)定5-氟尿嘧啶功能化納米硒水溶膠中硒含量,定量后的透析產(chǎn)物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。用MTT比色法 (SpectroAmaxTM250)檢測(cè)5-氟尿嘧啶功能化納米硒抑制A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞、MCF-7 乳腺癌細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞、PC-3人胰腺癌細(xì)胞和Hs68人正常龜頭細(xì)胞的IC5tl值;有結(jié)果得出5-氟尿嘧啶功能化納米硒對(duì)癌細(xì)胞有很好的活性,而對(duì)正常細(xì)胞的毒性卻很小, 說(shuō)明5-氟尿嘧啶/納米硒在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間有很好的選擇性(圖8,A);用MTT比色法(SpectroAmax^SO)對(duì)比5-氟尿嘧啶、納米硒、5-氟尿嘧啶/納米硒分別抑制A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞的情況,分析結(jié)果得出,5-氟尿嘧啶/納米硒對(duì)癌細(xì)胞有很好的協(xié)同抑制作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也再一次的證明以納米硒作為載體覆載抗腫瘤藥物對(duì)癌癥有很好的抑制作用。用Epics XL-MCL流式細(xì)胞儀分析5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的A375細(xì)胞周期變化,結(jié)果表明5-氟尿嘧啶/納米硒對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用是通過(guò)凋亡機(jī)制引起(圖8,B);用TUNEL 和DAPI法(Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡)檢測(cè)5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞株系凋亡時(shí)DNA斷裂和染色質(zhì)固縮,分析結(jié)果表明5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)了癌細(xì)胞的DNA斷裂和染色質(zhì)固縮,說(shuō)明5-氟尿嘧啶/納米硒引起了細(xì)胞的凋亡(圖9)。 用EpicsXL-MCL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter, Miami, FL)檢測(cè)5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的caspase獨(dú)立的A375細(xì)胞的凋亡通路,結(jié)果表明5_氟尿嘧啶/納米硒通過(guò)線粒體通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡(圖10)。用Epics XL-MCL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter, Miami, FL)檢測(cè)5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的A375人體黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化,(圖 11,A);用DCFH-DA熒光法分析A375人體黑色素瘤細(xì)胞在不同濃度的5-氟尿嘧啶/納米硒作用3小時(shí)下,細(xì)胞內(nèi)的活性氧變化情況,(圖11,B);用DCFH-DA熒光法分析A375人體黑色素瘤細(xì)胞在不同時(shí)間下的5-氟尿嘧啶/納米硒作用3小時(shí)下,細(xì)胞內(nèi)的活性氧變化情況,(圖11,C);利用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)觀察5-氟尿嘧啶/納米硒誘導(dǎo)的 A375細(xì)胞凋亡中活性氧的變化情況,(圖11,D);結(jié)果表明,5-氟尿嘧啶/納米硒通過(guò)活性氧來(lái)?yè)p傷線粒體引起細(xì)胞凋亡。
權(quán)利要求
1.納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用,其特征在于包括如下步驟常溫常壓下,將還原性溶液與抗腫瘤藥物溶液混合均勻后,滴加二氧化硒溶液或亞硒酸鹽溶液并攪拌,定容, 反應(yīng)1 M h,得到負(fù)載抗腫瘤藥物的納米硒溶膠。
2.納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用,其特征在于包括如下步驟常溫常壓下,將二氧化硒溶液或亞硒酸鹽溶液與抗腫瘤藥物溶液混合均勻后,滴加還原性溶液并攪拌,定容, 反應(yīng)1 M h,得到負(fù)載抗腫瘤藥物的納米硒溶膠。
3.權(quán)利要求1或2所述納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用,其特征在于所述還原性溶液為維生素C、谷胱甘肽、硼氫化鈉或水合胼溶液。
4.權(quán)利要求1或2所述納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用,其特征在于所述抗腫瘤藥物為5-氟尿嘧啶、阿霉素、順鉬或紫杉醇。
5.權(quán)利要求1或2所述納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用,其特征在于所述亞硒酸鹽為亞硒酸鈉。
6.權(quán)利要求1或2所述納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用,其特征在于所述還原性溶液的濃度為0.2 100 mmol化―1,二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的濃度為0.05 25 mmol · Λ 所述抗腫瘤藥物溶液濃度為10 200 mg · mL—1。
7.權(quán)利要求1或2所述納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用,其特征在于所述方法制得的負(fù)載抗腫瘤藥物的納米硒溶膠的保存方式是在2 10°C下以溶膠或粉末形態(tài)保存。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了納米硒在抗腫瘤藥物載體中的應(yīng)用。本發(fā)明是將納米硒作為載體,用于負(fù)載抗腫瘤藥物,得到抗腫瘤藥物復(fù)合體系。本發(fā)明將納米硒應(yīng)用于抗腫瘤藥物復(fù)合體系中,制得的抗腫瘤藥物復(fù)合體系可以發(fā)揮抗腫瘤藥物和納米硒在抗腫瘤方面的協(xié)同作用,在增強(qiáng)抗腫瘤藥物滲透性的同時(shí),還降低了抗腫瘤藥物本身對(duì)人體正常組織的毒副作用。上述抗腫瘤藥物復(fù)合體系可以在液相中以水溶膠的形式保存,制備工藝簡(jiǎn)單,條件溫和,穩(wěn)定性好,保存時(shí)間長(zhǎng),適合推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/02GK102327620SQ201110215019
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者劉雯, 鄭文杰, 陳填烽 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)
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